本方案描述了一种从小鼠胚胎中分离并培养后肾原基的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案的目的是描述一种小鼠后肾原基的分离、提取和培养方法。
在哺乳动物肾脏发育过程中，两种前体组织——输尿管芽和后肾间充质——相互交流并彼此诱导细胞机制，最终形成肾脏的集合系统和肾单位。由于哺乳动物胚胎在子宫内发育，无法直接观察，因此建立了器官培养技术。利用该方法，可以研究肾脏器官发生过程中的上皮-间充质相互作用及细胞行为。此外，还可探究先天性肾脏及泌尿生殖道畸形的起源。经过精细解剖后，将后肾原基转移至漂浮于培养基表面的滤膜上，可在细胞培养箱中维持数天。但需注意，培养条件为人工环境，可能影响组织的代谢活动。同时，由于外植体中存在细胞外基质和基底膜，测试物质的渗透可能受到限制。
器官培养的一个主要优点是实验者可以直接接触器官。该技术成本低廉、操作简便，并允许进行大量改造，例如添加生物活性物质、研究遗传变异以及应用先进的成像技术。
引言
哺乳动物的肾脏起源于两种具有中胚层来源的原始结构：管状上皮性输尿管芽和后肾间充质。在肾发生过程中，输尿管芽侵入后肾间充质并分支形成集合系统。后肾间充质则发育为肾单位的上皮成分。这些过程以精确的时间顺序和空间协调方式进行，并由相互诱导机制启动。这两种组织成分相互交流，并影响彼此的细胞形态发生。
20世纪20年代，博伊登（Boyden）首次在鸡胚中进行了中肾管的体内结扎实验，发现分离的肾源性间充质无法分化，首次提示了诱导性相互作用的存在1。几乎在同一时期，首次成功将鸡胚肾原基在悬滴培养系统中进行培养的研究被发表。随后，器官培养技术被发展用于研究哺乳动物器官发生过程中的组织相互作用。20世纪50年代，格罗布斯坦（Grobstein）开发了一种将后肾原基培养在滤膜上的技术。该技术后由萨克森（Saxén）改进，他将滤膜置于培养皿中的特罗威尔（Trowell）型金属网上1。多年来，器官培养技术已衍生出多种改进方法和应用形式。本文所述方法基于萨克森的技术，但进行了简化：滤膜自由漂浮于培养液表面，且培养孔的直径仅略大于滤膜直径，从而限制了滤膜的非预期移动。
器官整体培养是一种经典、廉价、简便但功能强大的工具，可用于研究器官发生过程中的细胞过程及细胞间通讯。通过器官培养，可使用多种生物制剂（如生长因子、抗体、反义寡核苷酸、病毒....
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方案
小鼠的饲养遵循瑞典法规和欧盟立法（2010/63/EU）。所有实验程序均按照瑞典伦理委员会指南进行（许可号：C79/9、C248/11 和 C135/14）。在海德堡大学开展的涉及动物实验的研究已获得卡尔斯鲁厄政府主席团以及海德堡大学动物福利官员的批准。
1. 培养用试剂与材料的准备
注意：使用层流罩以尽量减少污染。
- 在解剖当天，将人源Fc片段单独或与重组嵌合型ephrin蛋白（该蛋白与人源Fc片段融合）按1:5的摩尔比与抗人Fc的山羊抗体在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，进行预聚。37 °C孵育1小时5。
- 通过在Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）中添加1%青霉素/链霉素（v/v）、1%谷氨酰胺（v/v）、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（v/v）、50 µg/mL人全转铁蛋白和1.5 µg/mL两性霉素B，配制培养基。
注意：10 mL培养基足以用于16个胚胎。 - 将聚簇的重组ephrin溶液以终浓度20 µg/mL加入培养基中。以聚簇的人源Fc作为对照。
- 在无菌、未包被、平底的聚苯乙烯4孔板中，每孔加入500 µL培养基，制备培养板。
- 使用无菌镊子，将孔径为5 µm的聚碳酸酯膜滤器小心地放置于每孔培养基表面，每孔一张。将....
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结果
在 E11.5 时期从怀孕的 Black-6 近交系小鼠中分离得到后肾肾原基，并进行培养。培养 3 天后，输尿管芽已分支多达 5 次，导致最初呈 T 形的输尿管芽发生分支扩展。对每个外植体进行拍照，并量化其分支段数和末端点数量，以确定分支代数并计算每条分支的末端点数（图 1）。ImageJ（rd 代；在仅 8% 的处理组外植体中达到第 4th 代，而对照组外植体中达到 35%（图 1b）。因此，经簇状 EphrinB2 处理的外植体中，每条分支的末端点数以及每 mm2 面积内的末端点数均减少。此外，三分之一的外植体在输尿管芽尖端表现出异常形态（图 1）。这些结果表明，EphrinB2 可能通过激活 EphA4 和 EphB2 的前向信号通路，对输尿管芽的分支过程产生抑制作用。
要获得成功.......
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讨论
本文描述了一种从小鼠胚胎中分离发育中后肾原基并培养器官原基的方法。该方法是一种标准技术，最初由 Grobstein8 和 Saxén9,10 建立，后经多人改进和优化11,12。该方法的成功主要取决于解剖操作的时间长短，因为随着解剖时间的延长，外植体的存活率和诱导潜能会下降。在清除肾原基周围组织时，必须注意避免损伤间充质。后肾间充质的损伤常常是导致外植体生长不良的原因。然而，解剖速度和精细操作技能会随着练习而显著提高。
本文方案中所述的化学成分明确培养基常用于替代原代细胞和 体外 器官培养，包含体积比为1:1的DMEM与Ham's F-12混合液，添加胰岛素-转铁蛋白-硒以支持外植体的生长与存活。胰岛素促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂质生成及细胞内转运。硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，具.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Leif Oxburgh 和 Derek Adams 慷慨分享他们的专业知识，感谢 Leif Oxburgh 对手稿提出的有益意见，感谢 Stefan Wölfl 和 Ulrike Müller 提供的技术支持，以及 Saskia Schmitteckert、Julia Gobbert、Sascha Weyer 和 Viola Mayer 在实验室中的帮助。本工作由 Development、The Company of Biologists 资助。（至CP）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX 增补剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 含钙、镁的 DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | 用于解剖 |
| 全转铁蛋白（人源） | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100 倍浓缩液） | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 两性霉素 B 溶液 | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| 硫柳汞 | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| 没食子酸丙酯 | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 生物素标记的双花扁豆凝集素（Dolichorus Biflorus Agglutinin） | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 标记的链霉亲和素 | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| 重组小鼠 Ephrin-B2 Fc 融合蛋白，CF | R&D Systems | 496-EB | |
| 重组人 IgG1 Fc，CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| 山羊抗人 IgG Fc 抗体 | R&D Systems | G-102-C | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Sigma-Aldrich | P4417 | 用于固定和免疫染色 |
| Dumont #5 生物学 尖端，INOX，11 cm | agnthos.se | 0208-5-PS | 需要两对镊子 |
| 直型虹膜剪，12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| 敷料镊， 直型，精细，13 cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
| Nunclo Delta 处理培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore 膜滤器，聚碳酸酯，亲水性，5.0 µm，13 mm，白色，无涂层 | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon 多孔培养板 4 孔，平底 | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| 显微镜盖玻片 24 × 50 mm，厚度 No.1.5H，0.17±0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| 盖玻片 No.1.5，18 mm × 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| 载玻片 ~76 × 26 × 1，半磨边，无涂层 | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR 剃刀刀片 | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL 离心管 | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL 离心管 | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman 预折叠定性滤纸，113V 级，皱纹型 | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| 固定式载物台研究显微镜 | Olympus | BX61WI | |
| 近交系黑鼠，雄性，C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| 近交系黑鼠，雌性，C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough 体视显微镜 | Leica | Leica S6 E |
参考文献
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
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