需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠胚胎肾脏的分离与培养

11.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55715

⸱

2017年5月17日

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

本文内容

摘要

本方案描述了一种从小鼠胚胎中分离并培养后肾原基的方法。

摘要

本实验方案的目的是描述一种小鼠后肾原基的分离、提取和培养方法。

在哺乳动物肾脏发育过程中，两种前体组织——输尿管芽和后肾间充质——相互交流并彼此诱导细胞机制，最终形成肾脏的集合系统和肾单位。由于哺乳动物胚胎在子宫内发育，无法直接观察，因此建立了器官培养技术。利用该方法，可以研究肾脏器官发生过程中的上皮-间充质相互作用及细胞行为。此外，还可探究先天性肾脏及泌尿生殖道畸形的起源。经过精细解剖后，将后肾原基转移至漂浮于培养基表面的滤膜上，可在细胞培养箱中维持数天。但需注意，培养条件为人工环境，可能影响组织的代谢活动。同时，由于外植体中存在细胞外基质和基底膜，测试物质的渗透可能受到限制。

器官培养的一个主要优点是实验者可以直接接触器官。该技术成本低廉、操作简便，并允许进行大量改造，例如添加生物活性物质、研究遗传变异以及应用先进的成像技术。

引言

哺乳动物的肾脏起源于两种具有中胚层来源的原始结构：管状上皮性输尿管芽和后肾间充质。在肾发生过程中，输尿管芽侵入后肾间充质并分支形成集合系统。后肾间充质则发育为肾单位的上皮成分。这些过程以精确的时间顺序和空间协调方式进行，并由相互诱导机制启动。这两种组织成分相互交流，并影响彼此的细胞形态发生。

20世纪20年代，博伊登（Boyden）首次在鸡胚中进行了中肾管的体内结扎实验，发现分离的肾源性间充质无法分化，首次提示了诱导性相互作用的存在1。几乎在同一时期，首次成功将鸡胚肾原基在悬滴培养系统中进行培养的研究被发表。随后，器官培养技术被发展用于研究哺乳动物器官发生过程中的组织相互作用。20世纪50年代，格罗布斯坦（Grobstein）开发了一种将后肾原基培养在滤膜上的技术。该技术后由萨克森（Saxén）改进，他将滤膜置于培养皿中的特罗威尔（Trowell）型金属网上1。多年来，器官培养技术已衍生出多种改进方法和应用形式。本文所述方法基于萨克森的技术，但进行了简化：滤膜自由漂浮于培养液表面，且培养孔的直径仅略大于滤膜直径，从而限制了滤膜的非预期移动。

器官整体培养是一种经典、廉价、简便但功能强大的工具，可用于研究器官发生过程中的细胞过程及细胞间通讯。通过器官培养，可使用多种生物制剂（如生长因子、抗体、反义寡核苷酸、病毒和多肽）以及药物化合物和其他化学物质进行处理。此外，还可利用来自基因修饰小鼠的外植体或可诱导的基因失活技术（如Cre-loxP系统）来研究基因功能。这种方法使得研究人员能够研究那些在肾脏发育之前即导致胚胎致死的遗传突变。器官培养还可与荧光标记技术结合，用于基因功能分析或细胞谱系示踪，并结合现代成像技术，实现对细胞行为的实时监测2。

在本例中，研究了EphrinB2激活的Eph受体信号通路对输尿管芽分支形态的影响。EphA4/EphB2双基因敲除小鼠的形态学结果显示，肾脏发育存在多种严重缺陷，这些缺陷最早可在胚胎第11天（E11）检测到，涉及输尿管芽、输尿管以及共同肾管3。Eph受体介导的信号传导需要配体-受体二聚体的聚集4。为了过度激活Eph信号通路，将E11.5小鼠胚胎的肾原基在含有聚集态重组EphrinB2-Fc蛋白的条件下进行培养。EphrinB2是EphA4受体的已知配体，而EphA4受体表达于输尿管芽的顶端3。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

小鼠的饲养遵循瑞典法规和欧盟立法（2010/63/EU）。所有实验程序均按照瑞典伦理委员会指南进行（许可号：C79/9、C248/11 和 C135/14）。在海德堡大学开展的涉及动物实验的研究已获得卡尔斯鲁厄政府主席团以及海德堡大学动物福利官员的批准。

1. 培养用试剂与材料的准备

注意：使用层流罩以尽量减少污染。

  1. 在解剖当天，将人源Fc片段单独或与重组嵌合型ephrin蛋白（该蛋白与人源Fc片段融合）按1:5的摩尔比与抗人Fc的山羊抗体在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，进行预聚。37 °C孵育1小时5。
  2. 通过在Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）中添加1%青霉素/链霉素（v/v）、1%谷氨酰胺（v/v）、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（v/v）、50 µg/mL人全转铁蛋白和1.5 µg/mL两性霉素B，配制培养基。
    注意：10 mL培养基足以用于16个胚胎。
  3. 将聚簇的重组ephrin溶液以终浓度20 µg/mL加入培养基中。以聚簇的人源Fc作为对照。
  4. 在无菌、未包被、平底的聚苯乙烯4孔板中，每孔加入500 µL培养基，制备培养板。
  5. 使用无菌镊子，将孔径为5 µm的聚碳酸酯膜滤器小心地放置于每孔培养基表面，每孔一张。将制备好的培养板放入培养箱（37 °C/5% CO2）中。确保滤膜上表面保持干燥并漂浮于液面上。
    注意：一张滤膜足以支持两个肾原基的培养。
  6. 使用剃刀刀片，将约30个移液器吸头（体积：100 µL）从尖端向上约1 mm处剪断，以获得更宽的开口。将处理后的吸头放回移液器吸头架中。

2. E11.5 时期后肾原基的分离

  1. 在 E11.5 时期，通过颈椎脱位法（或采用当地伦理委员会批准的方法）处死一只定时妊娠的小鼠。
  2. 取出子宫和胚胎，操作方法如 Brown 等6 所述。此后所有操作均应在解剖显微镜下进行。
  3. 使用 5 号钟表镊，在前肢正下方剪开胚胎。每个胚胎使用一个新的培养皿。去除胚胎的后肢和尾部。操作时，用一对 5 号钟表镊夹住需去除的组织，用另一对镊子的尖端进行剪切。
  4. 为去除腹侧器官团块，用一对镊子的尖端从头侧向尾侧方向横向打开胚胎的体壁。
    1. 进行浅层切割，方向平行于充满血液因而可见的背主动脉。以背主动脉作为定位参考。用闭合镊子的尖端小心地将体壁的腹侧部分与背侧部分分离，并将胚胎翻转。以背主动脉为参考，同样从头侧向尾侧方向在另一侧横向剪开体壁。
  5. 当腹侧体壁与背侧体壁完全分离后，用一对镊子夹住腹侧部分，小心地将其连同内部器官团块一并拉出。
    注：后肾原基通常仍附着在背侧体壁上。它们呈椭圆形，长约 200 µm，位于后肢水平位置。
  6. 用一对镊子夹住背侧体壁，使腹侧朝上。用另一对镊子夹住背主动脉的头端，小心地将背主动脉从背侧体壁上剥离下来。
    注：两个后肾通常仍附着在背主动脉上。
  7. 用一对镊子在肾原基头侧进行剪切，以分离主动脉。然后用镊子尖端小心地将两个肾原基彼此分开。
  8. 用镊子尖端小心剥离肾原基上不需要的组织。注意不要损伤间充质，因为损伤可能导致生长不良，并使该外植体无法用于后续分析。
  9. 使用微量移液器和开口较宽的移液器吸头，将肾原基分别转移至 4 孔板中的聚碳酸酯膜滤膜上，每份加入 10 µL PBS。
    注：由于表面张力，外植体会被一层薄薄的培养基覆盖。一张滤膜可容纳两个肾原基。
    1. 将两个肾原基分别置于滤膜各自半侧的中央位置。将培养板放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。保持培养板在培养箱内，直至下一个胚胎的后肾原基准备好并可放置于滤膜上。
  10. 对每个胚胎重复步骤 2.3–2.9.1。
    注：经过一定练习后，每个胚胎的解剖过程大约需要 5 分钟。
  11. 将肾原基在 37 °C、5% CO2 条件下培养 3 天。

3. 固定和染色试剂的制备

  1. 配制不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中4%（w/v）多聚甲醛（PFA）溶液：将PFA在60 °C下溶于PBS中，持续搅拌。冷却至室温后，用滤纸过滤去除残留颗粒。分装后置于4 °C保存以供立即使用，或冷冻长期储存。
    注意：PFA具有毒性。操作时应穿戴符合当地安全标准规定的个人防护装备，并在通风橱中进行。废弃物应按照机构规定使用指定容器妥善处理。
  2. 配制通透化溶液：将Triton X-100以0.3%（v/v）比例溶于不含钙和镁的PBS中。
  3. 配制封闭液：在不含钙和镁的PBS中加入5%（v/v）山羊血清和0.1% Triton X-100。再加入叠氮化钠至终浓度为0.02%（w/v）。4 °C保存。
    注意：叠氮化钠具有毒性。操作时应遵守当地安全与环境保护法规。
    备注：若使用抗体进行染色，应选用与二抗来源物种相同的5%血清来配制封闭液。
  4. 将生物素标记的Dolichos biflorus凝集素以1:200比例溶于封闭液中。将Alexa488标记的链霉亲和素以1:200比例溶于封闭液中。
  5. 配制即用型包埋介质（参见材料表）：将0.1 g水溶性聚乙烯醇类黏附剂/mL加入含25%（w/v）甘油的0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）中。在持续搅拌下加热至50 °C并维持1小时，冷却后用1 M NaOH调节pH至8.0–8.5。避免使用高浓度NaOH。加入N-丙基棓酸盐至终浓度100 µg/mL，并加入硫柳汞至终浓度0.02%（w/v）。室温下搅拌30分钟。
    注意：硫柳汞具有毒性。操作时应遵守当地安全与环境保护法规。
    1. 将包埋介质分装至50 mL离心管中，平衡转子后，在3,200 × g、室温条件下离心10分钟。将上清液倾入15 mL离心管中，弃去沉淀。分装后可在-20 °C保存数周。解冻后应置于4 °C保存，并在使用前立即加热至约30 °C。
  6. 根据含有外植体的滤膜数量准备相应数量的载玻片。具体操作为：使用速干胶将两片18 × 18 mm的小盖玻片粘贴在载玻片两侧，中间预留约15 mm空间用于放置滤膜。

4. 固定与染色

  1. 培养3天后 体外 （div），将培养板从培养箱中取出，使用移液器小心吸除每孔中的培养基。注意不要触碰滤膜，并将吸头开口朝向孔壁。
  2. 向每个孔中加入 500 µL 4% PFA/PBS。滤膜会漂浮在固定液上，使用移液器将 PFA 固定液逐滴加入，以浸没滤膜。室温孵育 30 分钟。
    注意：在后续所有步骤中，需注意避免将外植体从滤膜上冲洗下来。移液时应将吸头开口朝向孔壁。
  3. 除去PFA，用500 µL PBS浸没滤膜，清洗两次。每孔加入500 µL透化溶液，室温孵育1小时。
  4. 用 500 µL PBS 洗涤两次，每孔加入 500 µL 封闭液。室温孵育 1 小时。
  5. 用250 µL以封闭液按1:200稀释的生物素化双花杜鹃凝集素替代封闭液，4 °C孵育24 h。
  6. 移除双花扁豆凝集素溶液，每孔用 500 µL PBS 洗涤两次。
  7. 加入250 µL用封闭液按1:200稀释的Alexa488偶联链霉亲和素，在4 °C孵育24 h；或在室温孵育2 h。
    注意：在 4 °C 下孵育可获得更优的信噪比。
  8. 每孔用 500 µL PBS 洗涤两次。用镊子将滤膜转移至预先准备好的载玻片上，确保组织块朝上。加入约 50–100 µL 封埋介质封片，盖上 60 mm 长的 1.5 号盖玻片。将载玻片置于避光条件下，室温静置 2 小时，使封埋介质充分凝固。随后进行成像，或用铝箔包裹载玻片后于 4 °C 保存，待成像时取出。
  9. 使用宽场落射荧光显微镜成像7 耦合汞灯，并使用镜组进行蓝光激发（激发带通，460 - 495 nm；二向色镜，505 nm；发射带通，510 - 550 nm）以及20倍平场复消色差物镜，数值孔径0.75。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在 E11.5 时期从怀孕的 Black-6 近交系小鼠中分离得到后肾肾原基，并进行培养。培养 3 天后，输尿管芽已分支多达 5 次，导致最初呈 T 形的输尿管芽发生分支扩展。对每个外植体进行拍照，并量化其分支段数和末端点数量，以确定分支代数并计算每条分支的末端点数（图 1）。ImageJ（rd 代；在仅 8% 的处理组外植体中达到第 4th 代，而对照组外植体中达到 35%（图 1b）。因此，经簇状 EphrinB2 处理的外植体中，每条分支的末端点数以及每 mm2 面积内的末端点数均减少。此外，三分之一的外植体在输尿管芽尖端表现出异常形态（图 1）。这些结果表明，EphrinB2 可能通过激活 EphA4 和 EphB2 的前向信号通路，对输尿管芽的分支过程产生抑制作用。

要获得成功...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文描述了一种从小鼠胚胎中分离发育中后肾原基并培养器官原基的方法。该方法是一种标准技术，最初由 Grobstein8 和 Saxén9,10 建立，后经多人改进和优化11,12。该方法的成功主要取决于解剖操作的时间长短，因为随着解剖时间的延长，外植体的存活率和诱导潜能会下降。在清除肾原基周围组织时，必须注意避免损伤间充质。后肾间充质的损伤常常是导致外植体生长不良的原因。然而，解剖速度和精细操作技能会随着练习而显著提高。

本文方案中所述的化学成分明确培养基常用于替代原代细胞和 体外 器官培养，包含体积比为1:1的DMEM与Ham's F-12混合液，添加胰岛素-转铁蛋白-硒以支持外植体的生长与存活。胰岛素促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂质生成及细胞内转运。硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，具...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Leif Oxburgh 和 Derek Adams 慷慨分享他们的专业知识，感谢 Leif Oxburgh 对手稿提出的有益意见，感谢 Stefan Wölfl 和 Ulrike Müller 提供的技术支持，以及 Saskia Schmitteckert、Julia Gobbert、Sascha Weyer 和 Viola Mayer 在实验室中的帮助。本工作由 Development、The Company of Biologists 资助。（至CP）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140148
GlutaMAX 增补剂Thermo Fisher Scientific35050061
含钙、镁的 DPBSThermo Fisher Scientific14040117用于解剖
全转铁蛋白（人源）Sigma-AldrichT0665
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100 倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific41400045
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
两性霉素 B 溶液Sigma-AldrichA2942
吐温 X-100Sigma-AldrichX100
叠氮化钠Sigma-AldrichS8032
硫柳汞Sigma-AldrichT5125
没食子酸丙酯Sigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
甘油Sigma-AldrichG5516
生物素标记的双花扁豆凝集素（Dolichorus Biflorus Agglutinin）Vector LaboratoriesB-1035
Alexa488 标记的链霉亲和素Jackson Immuno Research016-540-084
重组小鼠 Ephrin-B2 Fc 融合蛋白，CFR&D Systems496-EB
重组人 IgG1 Fc，CFR&D Systems110-HG-100
山羊抗人 IgG Fc 抗体R&D SystemsG-102-C
磷酸盐缓冲液片剂Sigma-AldrichP4417用于固定和免疫染色
Dumont #5 生物学
尖端，INOX，11 cm		agnthos.se0208-5-PS需要两对镊子
直型虹膜剪，12 cmagnthos.se03-320-120
敷料镊，
直型，精细，13 cm		agnthos.se08-032-130
Nunclo Delta 处理培养皿Thermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Isopore 膜滤器，聚碳酸酯，亲水性，5.0 µm，13 mm，白色，无涂层MerckMilliporeTMTP01300
Nunclon 多孔培养板
4 孔，平底		Sigma-AldrichD6789-1CS
显微镜盖玻片 24 × 50 mm，厚度 No.1.5H，0.17±0.005 mmnordicbiolabs107222
盖玻片 No.1.5，18 mm × 18 mmnordicbiolabs102032
载玻片 ~76 × 26 × 1，半磨边，无涂层nordicbiolabs1030418
VWR 剃刀刀片VWR55411-055
50 mL 离心管Sigma-AldrichCLS430828
15 mL 离心管Sigma-AldrichCLS430055
Whatman 预折叠定性滤纸，113V 级，皱纹型Sigma-AldrichWHA1213125
固定式载物台研究显微镜OlympusBX61WI
近交系黑鼠，雄性，C57BL/6NTacTaconicB6-M
近交系黑鼠，雌性，C57BL/6NTacTaconicB6-F
Greenough 体视显微镜LeicaLeica S6 E

参考文献

  1. Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
  3. Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
  4. Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
  6. Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555(2011).
  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
  13. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

后肾原基输尿管芽分支器官培养技术胚胎第11.5天聚碳酸酯膜滤器细胞培养孵育箱免疫荧光染色共聚焦显微镜成像肾脏器官发生
小鼠胚胎肾脏的分离与培养
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。