小鼠学习与记忆研究中的新物体识别实验

摘要

物体识别实验（ORT）是一种用于评估小鼠学习和记忆能力的简单且高效的检测方法。该方法的具体步骤如下所述。

摘要

物体识别实验（ORT）是一种常用于研究小鼠学习和记忆多个方面的行为学检测方法。ORT 操作相对简单，可在3天内完成：适应期、训练期和测试期。在训练阶段，允许小鼠探索两个相同的物体；在测试阶段，其中一个训练用物体被替换为一个新物体。由于小鼠天生偏爱新奇事物，如果小鼠能够识别熟悉的物体，它将更多时间花在新物体上。基于这种先天偏好，实验无需使用正向或负向强化手段，也无需长时间的训练安排。此外，ORT 还可根据多种应用需求进行修改：可通过缩短保留间隔来检测短期记忆，或延长保留间隔以探究长期记忆。在训练前、训练后或回忆前的不同时间点进行药理学干预，可用于研究学习的不同阶段（i.e.，习得、早期或晚期巩固、或回忆）。总体而言，ORT 是一种对小鼠压力较小且高效的记忆检测方法，适用于检测药理学、生物学或遗传学干预后引起的神经心理学变化。

引言

物体识别实验（ORT），也称为新物体识别实验（NOR），是一种相对快速且有效的方法，用于检测小鼠学习和记忆的不同阶段。该方法最初由 Ennaceur 和 Delacour 于 1988 年描述，最初主要用于大鼠¹；然而，此后已成功改进并适用于小鼠^2,3,4,5,6,7。该实验仅需最多三个阶段：一次适应期、一次训练期和一次测试期。训练期仅涉及对两个相同物体的视觉探索，而测试期则将其中一个先前探索过的物体替换为一个新物体。由于啮齿类动物天生偏爱新奇事物，因此记住熟悉物体的啮齿类动物会花更多时间探索新物体^7,8,9。

与其它啮齿类动物记忆测试相比，新物体识别实验（ORT）的主要优势在于其依赖于啮齿类动物探索新奇事物的自然倾向⁸因此，无需进行多次训练，也无需使用任何正向或负向强化手段来激发动物行为。这意味着，与其他测试相比，物体识别实验（ORT）的压力显著更低。^{10,11,12,13,14,15}，且运行时间显著短于其他常用的记忆测试方法（如莫里斯水迷宫或巴恩斯迷宫），后者通常需要一周甚至更长时间。因此，物体识别测试的实验条件更接近人类认知研究中的实际情况，相较于许多其他啮齿类动物记忆测试，具有更高的生态效度。同样，由于物体识别测试是一种简单的视觉回忆任务，已成功被改编应用于多种物种，包括人类和非人灵长类动物，以评估不同物种间陈述性记忆的各个方面。 ^2,16,17最后，该OR测试可轻松修改以检测学习与记忆的不同阶段（即，获取、巩固或回忆），以评估不同类型的记忆（例如，空间记忆），或评估不同的保持间隔（即短期 与 长期记忆

新物体识别实验（ORT）的多功能性为无数研究应用提供了平台。研究可利用药理学试剂来干扰或增强记忆。通过改变训练前、训练后或测试前的给药时间，可以提示导致记忆受损或增强的潜在神经机制^6,18,19,20。类似地，可在相同的不同时间点使用光遗传学技术，观察参与学习与记忆不同阶段的神经激活或抑制。ORT 还适用于评估转基因动物、损毁研究、神经退行性疾病模型或衰老研究中的差异^{21,22,23,24,25,26,27,28}。通过调整训练与测试之间的时间间隔（即记忆保持间隔），可评估上述各种因素对短期和长期记忆的影响²⁶。最终，ORT 可作为研究学习与记忆中药理学、遗传学和神经学变化的工具，也可利用这些工具深入探究 ORT 中学习与记忆的神经基础。

方案

本研究中进行的所有操作均提交并获得动物护理与使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则进行。

1. 物体选择与实验设置

1. 选择在纹理、形状、颜色图案和亮度方面复杂度相似，但又具有足够差异以便小鼠能够轻松区分的物体。 等等。以尽量减少任何可能的诱导性物体偏好，从而避免对结果产生偏差（关于物体选择的详细描述，请参见 Ennaceur 2010）⁷).
   1. 测试先天偏好与辨别能力（参见步骤2） & 3).
   2. 使用与小鼠体型相近或略大的物体以促进探索行为图1）。为减少诱导偏好，应确保小鼠能够爬上两个物体或均不能爬上；不过，能够爬上物体可能会增加其探索兴趣（仅坐在物体上的时间不计入探索时间）。
   3. 每个物体至少准备2个。然而，为了在测试期间尽量减少潜在的气味线索，建议每种物体至少准备3个，其中2个用于训练，1个用于测试。
   4. 使用由不易破碎材料制成的物体，因为在实验过程中若物体损坏丢失，可能会影响测试的连续性，并可能对动物造成伤害。
   5. 使用前后及使用间隔均需彻底清洁物品（可使用70%体积比的乙醇）。
2. 为尽量减少强光带来的应激，应使用漫射的低强度光照，将迷宫中心区域的照度控制在约20勒克斯。实验环境的温度和湿度应与常规饲养条件相近。若小鼠需从饲养房间转移至其他房间进行实验，每天使用前应使其在新房间内适应至少1小时。
3. 在训练前对小鼠进行良好的抓握适应。由于该实验依赖于啮齿类动物探索新奇事物的自然倾向，因此需尽量减少因抓握带来的任何应激或焦虑，以免影响其探索测试区域以及物体的意愿。理想情况下，在测试前1至2周内，每天抓握适应1至2次，每次至少1分钟。^15,29.
4. 主实验区域应使用一个由白色或黑色不透水塑料制成的方形区域（约40 cm × 40 cm × 40 cm），其颜色需与小鼠体色形成对比。也可选用圆形实验区域。特别是当使用易产生焦虑行为的小鼠时，由于其可能停留在方形区域的角落，此时采用圆形区域更有利于促进其探索行为。^18,30.
   1. 训练当天，将两个相同的物体放在对角线上（即 一个位于西北角，一个位于东南角）。如果物体太轻，可能被小鼠移动，则应将其固定在地面上。可移除的固定橡皮泥效果良好。
   2. 测试当天，使用 3^rd 每次复制一个物体，将一个熟悉物体和一个新物体放置在与训练日相同的对角线上（图2).
   3. 平衡每组物体的使用，使每个物体作为熟悉物体和新奇物体的使用次数相等。同时，将新奇物体的位置在竞技场的4个角落之间进行平衡。务必记录每只动物所使用的对角线，确保每只小鼠在训练日和测试日使用相同的对角线。
   4. 在使用前后以及两次使用之间，应彻底清洁仪器和物品以去除气味线索（可使用70%体积比的乙醇）。
5. 将相机置于装置正上方，以获得最佳的探索视野。仅使用具备鼻尖检测功能的软件进行准确分析。若使用软件，应在开始前先拍摄一张包含物体的背景图像。在软件中，将探索区域设置为物体周围约2至3厘米的范围。
6. 为减少实验者干扰，应录制实验过程并在事后进行评分。评分者需对实验分组设盲。若在实验过程中进行人工评分，确保实验者距离实验区域超过1米，且不被小鼠看见。
   注意：小鼠静止停留在物体上且无主动的触须扫动或嗅探行为的时间，不计入探索时间。
7. 定义探索行为为小鼠鼻尖朝向物体且距离物体2-3 cm以内，并伴有活跃的触须扫动或嗅闻动作。若小鼠停留在物体上但无主动探索迹象，则不计入探索时间。

2. 必要的预实验

1. 测试诱导偏好
   1. 适应阶段：将小鼠从其饲养笼中取出，置于开放旷场中央，使其自由探索5分钟。
   2. 训练日（T1）时，将两个不同的物体放置在装置的对角象限中，（即，西北角和东南角）。将小鼠从其饲养笼中取出，置于开放旷场的中央，允许其自由探索10分钟。
   3. 计算辨别指数。若无诱导偏好产生，辨别指数应为零或接近零。任何显示偏好的物体均不应用于物体识别实验（ORT）。
2. 测试辨别能力
   1. 进行适应性训练时，将小鼠从其饲养笼中取出，置于开放旷场中央，让其自由探索5分钟。
   2. 在训练阶段（T1）中，将两个相同的物体放置在相对的象限内。将小鼠置于旷场中央，使其自由探索10分钟。
   3. 在测试阶段（T2）中，将一个T1阶段使用过的物体和一个新物体分别放置在相对的两个象限（即西北角和东南角）。在T1结束后60分钟，将小鼠置于旷场中央，允许其自由探索10分钟。
   4. 计算辨别指数。在60分钟的保留间隔下，辨别指数应高于0.25。

3. 实验步骤

1. 习惯化
   1. 将小鼠从其原居住笼中取出，置于开放空旷的实验箱中央，允许其自由探索5分钟。待原居住笼清空后，将其保存，留作次日的暂养笼使用。
   2. 5 分钟结束后，取出小鼠并放入暂养笼中。切勿将小鼠放回原来的笼子，以免影响其余待测小鼠的行为。
   3. 在小鼠之间使用70%（体积比）乙醇彻底清洁仪器。
      注意：在适应期间，可通过计算在中心区域停留的时间来评估类似焦虑的行为（参见 Prut & 贝尔宗 2003³¹）。在考虑T1阶段所需时间长度时，这是一个有用的指标。焦虑程度较高的小鼠可能需要10分钟的实验时长才能达到最低探索标准。
2. 训练（T1）
   1. 将两个相同的物体放置在竞技场相对的象限中（即，东北角和西南角）。
   2. 适应24小时后，将小鼠从其饲养笼中取出，置于旷场中央，使其与两个相同物体的距离相等。
   3. 让小鼠自由探索至少 5 分钟。如果使用已知运动或探索活动能力较低的小鼠品系，（即大多数小鼠在5分钟内未能达到对两个物体均探索至少20秒的最低标准（如预实验或文献所述），则应将该队列中所有小鼠的试验时间延长至10分钟。
   4. 试验结束时，将小鼠取出并放入饲养笼中。待原饲养笼清空后，将其保存，留作测试当天的饲养笼使用。
   5. 使用70%（体积比）乙醇在小鼠之间彻底清洁仪器和物品。
3. 检测（T2）
   1. 将T1期间使用的一个物体放置即，熟悉物体）和一个新物体分别放置在旷场相对的两个象限中。每个小鼠的物体位置应与T1阶段使用的位置相同。
   2. 在选择阶段的 T1 到 T2 时间间隔内，将小鼠从其饲养笼中取出，放置于中心区域，使其与熟悉物体和新物体的距离相等。
      注意：在24小时的保持间隔下，大多数小鼠将无法区分熟悉物体与新物体（通常为-0.2 < d2 < 0.2，与阳性对照相比³²）。若检测促智效果，可在此时间点检测记忆增强情况；若检测记忆缺陷，则可根据小鼠品系选择20分钟至4小时之间的较短保留间隔进行检测。
   3. 自由探索10分钟。试验结束后，取出小鼠并放入饲养笼中。
4. 对于T1和T2阶段，均记录前5分钟的行为。若小鼠对两个物体的总探索时间均未达到最低20秒的要求，则继续记录超过5分钟的时间，直至总探索时间超过20秒。

4. 数据分析

1. 排除标准
   1. 在训练阶段（T1）和测试阶段（T2）期间，分别计算每轮实验中两个物体的总探索时间（e1 和 e2）。大多数小鼠在5分钟内对两个物体的总探索时间应达到至少20秒。
   2. 对于在预实验中观察到探索行为较低、在5分钟内未达到此最低标准的小鼠品系，将T1和T2时间延长至10分钟。
   3. 持续评分5分钟，或超过5分钟直至达到20秒的最低标准。
   4. 如果小鼠在10分钟时的T1或T2阶段对任一物体的探索时间均未达到至少20秒，则应从分析中排除，因为无法确认其是否进行了足够时间的探索以完成学习或辨别。
2. 绝对分析与相对分析
   注意：不同分析公式及其相互关系可参见 表1.
   1. 计算 e1 为训练阶段对两个相同物体 a1 和 a2 的总探索时间。
      e1 = a1 + a2
   2. 计算 e2 为测试期间对熟悉物体（a）和新物体（b）的总探索时间。
      e2 = a+b
   3. 将 d1 简单计算为探索新物体的时间减去探索熟悉物体的时间。绝对辨别指标（d1）未考虑小鼠之间或处理组之间探索时间的差异，但在某些情况下，它可能是一种更敏感的测量方法².
      d1 = b-a
   4. 计算 d2，即探索新物体的时间减去探索熟悉物体的时间，再除以总探索时间。最常用的指标是相对辨别值，通常称为辨别指数（d2），该指数不受探索时间差异的影响，因此所有数值均介于 -1 和 +1 之间。
      d2 = d1/e2
   5. 或者，计算识别率或偏好指数（d3）³该值为探索新物体所用时间除以总时间，因此所有数值均介于0和1之间。通常乘以100，以百分比形式表示。
      d3 = b/e2*100
3. 统计分析
   1. 使用各组的平均辨别值，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）评估记忆表现。为进一步分析，进行双因素 事后检验 与处理组的比较 与 对照条件组及阳性和阴性对照组

结果

物体识别实验（ORT）的一般实验设置如图2所示。在适应日（T0），将小鼠放入空旷的实验箱中，持续5分钟。24小时后，将小鼠重新放入箱内，箱中放置两个相同物体，允许其自由探索最多10分钟（T1）。在测试日（T2），再次将小鼠放入实验箱中，但此时箱内放置一个熟悉的物体和一个新物体，允许其自由探索最多10分钟。保留间隔（即T1与T2之间的时间）可根据实验的最终目标进行调整。在代表性数据中，由于抑制剂预期可增强记忆，因此在T1后24小时进行测试，此时溶剂处理的小鼠应无辨别能力。

磷酸二酯酶2抑制剂已被证明可增强物体识别实验（ORT）中的学习和记忆能力。与给予溶剂对照组相比，在训练前30分钟给予PDE2抑制剂Bay 60-7550或ND7001，可剂量依赖性地显著增强记忆表现⁶（图3a和

讨论

物体识别实验（ORT）是一种研究小鼠学习与记忆的高效且灵活的方法。在设计实验时，需考虑多种可能影响实验结果的变量。如代表性结果部分所述，小鼠品系会影响探索时间以及记忆保持间隔。探索时间的减少可能会在绝对辨别分析中扭曲或掩盖结果^2,3,5,30,32。某些品系的小鼠在较短的记忆保持间隔（如1小时或4小时）下可能表现出较低的辨别值，这可能在检测记忆损伤时掩盖真实结果。相反，某些品系在较长的记忆保持间隔（如24小时）下可能具有较高的辨别值，这可能掩盖记忆增强效应^4,5,30。除了品系差异外，还需考虑其他生物学因素，包括年龄、性别和疾病状...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旷场实验箱	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	提供灰色、白色或黑色
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	行为追踪系统
EthoVisionXT 12	Noldus		行为追踪系统；需要三点追踪
视频摄像机	任意品牌		视频摄像机应正上方安装于装置上方
70% 乙醇	Fisher Scientific	BP2818-4	在开始测试前以及每次试验之间，应仔细清洁每个物体。装置的地板和墙壁也应进行清洁。