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方法文章

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

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⸱

DOI：

10.3791/55722

⸱

2017年7月18日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

本文内容

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摘要

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。

摘要

本研究中，我们采用外周血细胞（PBCs）作为种子细胞，通过无整合方法经由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞。在形成拟胚体（EB）并扩增成纤维样细胞后，iPSCs在无血清且无异源成分的条件下诱导软骨向分化21天。软骨细胞诱导完成后，通过形态学、免疫组织化学、生物化学分析以及软骨向分化标志物的实时定量PCR检测对细胞表型进行评估。软骨化细胞团呈阿利新蓝和甲苯胺蓝阳性染色。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学染色亦为阳性。与hiPSCs和成纤维样细胞相比，软骨化细胞团中硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量以及软骨向分化标志物COLLAGEN 2 （COL2）、COLLAGEN 10（COL10）、SOX9和AGGRECAN均显著上调。这些结果表明，PBCs可作为种子细胞用于生成个体化且成本效益高的iPSCs，以实现软骨修复。

引言

软骨组织的自我修复和再生能力非常有限。目前用于恢复软骨和关节功能的各种外科干预和生物治疗方法，效果均不理想。近年来干细胞技术的发展有望彻底改变整个软骨修复领域1。多种干细胞已被研究作为种子细胞，其中人诱导多能干细胞（hiPSCs）似乎是前景最为广阔的选择，因其能够提供多种患者特异性细胞，且不会引发排斥反应2。此外，它们能够克服成体细胞增殖能力有限的问题，持续保持自我更新和多向分化潜能。同时，还可通过基因靶向技术改变其基因型，从而获得特定类型的软骨细胞。

成纤维细胞已被广泛用于诱导多能干细胞（iPSCs）的生成，因为其重编程潜能已得到深入研究。然而，仍存在一些需要克服的局限性，例如患者取材时的疼痛性活检以及对 体外 成纤维细胞的扩增，可能导致基因突变3最近发现，PBCs 在重编程方面具有优势4此外，它们常被广泛使用且储量丰富。这些材料有可能将研究重点从皮肤转移。然而，据我们所知，关于PBC重编程后分化为软骨细胞的报道尚十分有限。

在本研究中，我们利用外周血细胞（PBCs）作为替代来源，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），然后通过团块培养系统将iPSCs向软骨细胞谱系分化，以模拟软骨细胞的形成过程。

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方案

从外周血细胞（PBCs）生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案可参见我们之前的研究5。本研究已获本机构机构审查委员会批准。

1. 胚状体（EB）形成

  1. 配制50 mL hiPSC培养基：在Knockout Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加15% Knockout血清替代物（KSR）、5% 胎牛血清（FBS）、1× 非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和8 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
  2. 配制50 mL EB形成培养基：DMEM添加15% KSR、5% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
  3. 配制50 mL基础培养基：DMEM添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
  4. 配制10 mL dispase溶液，浓度为1 mg/mL，溶于无血清DMEM培养基中。
  5. 将hiPSCs接种于含饲养层细胞的60 mm组织培养皿中（即， 一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞。当细胞融合度达到80-90%时，使用dispase消化并解离细胞，每4-5天以1:3比例传代人诱导多能干细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 培养箱
  6. 当iPSC细胞融合度达到80-90%时，使用火焰拉制的玻璃针将未分化的hiPSC集落切割成较小的片段（直径约50-100 µm）。通常，使用60 mm培养皿中的hiPSC集落来在100 mm培养皿中生成拟胚体（EB）。
    1. 将少于100个微小菌落碎片接种于含10 mL拟胚体形成培养基的100 mm非黏附型培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2 培养箱
  7. 每2天将初始培养基约25%更换为等量的基础培养基。倾斜培养皿使胚胎体（EBs）沉降，小心吸除上层3 mL培养基，加入4 mL新鲜基础培养基，注意勿扰动EBs。
    注意：在显微镜下，EBs 在形态学上表现为菌落碎片，呈具有光滑边界的圆形外观。
  8. 在非黏附型培养皿中培养10天后，使用前将新的100 mm组织培养皿用4 mL 0.1%明胶在37 °C孵育30 min进行包被。
  9. 将培养基和拟胚体从100 mm非黏附性培养皿转移至15 mL锥形管中。静置4–5分钟使拟胚体沉降。小心吸除上清液，保留少于0.5 mL的含拟胚体培养基。
  10. 将少于100个EBs接种至含10 mL基础培养基的100 mm明胶包被的组织培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。2 培养箱

2. 细胞沉淀形成与软骨细胞分化

  1. 配制10 mL 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。配制80 mL 基础培养基：DMEM，添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
  2. 配制10 mL软骨诱导分化培养基：在DMEM（高糖）中添加10%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（ITS）、0.1 µM地塞米松、1 mM抗坏血酸、1%丙酮酸钠和10 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）。
  3. 48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。
    注意：培养10天后，成纤维样细胞应已从胚体（EBs）中长出并扩展。
    1. 在使用前，将100 mm培养皿用4 mL 0.1%明胶于37 °C孵育30分钟进行包被。弃去细胞上清液，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次。
    2. 用3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化细胞5分钟，加入4 mL基础培养基中和。
  4. 通过移液吹打5-10次并将细胞悬液过70 µm尼龙筛网，使细胞解离为单细胞。将细胞悬液在200 x g离心5分钟。用10 mL基础培养基将细胞重新接种至新的100 mm胶原蛋白包被的组织培养皿中。
  5. 48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。
    注意：细胞呈现出均一的成纤维细胞样形态。
  6. 当达到约90-100%汇合度时（即， 约5-7天后，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37 °C消化5分钟收集细胞。加入4 mL基础培养基中和。通过移液吹打5次使细胞充分解离为单细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 放置 3 × 105 将细胞置于15 mL聚丙烯管中，在室温下以200 × g离心5分钟。用1 mL软骨诱导分化培养基重悬细胞。
  7. 以 300 × g 离心 3 分钟，重新沉淀细胞，并保持细胞呈小团状沉淀。将离心管置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 孵育21天。不要将瓶盖拧紧，以允许气体交换。
  8. 每隔三天更换四分之三的培养基，加入新鲜的软骨诱导分化培养基。
    注意：培养21天后，应形成hiPSC软骨细胞团（hiPSC-Chon）。人源间充质干细胞（MSCs）作为阳性对照，同样在软骨分化培养基中培养21天，以形成软骨细胞团（hMSC-Chon）。

3. 软骨形成分化分析

  1. 配制10 mL 10%中性缓冲福尔马林。
  2. 配制 50 mL 0.1% 阿尔新蓝试剂和 50 mL 1% 甲苯胺蓝试剂。
  3. 配制1 mL一抗溶液：含针对胶原蛋白II的兔多克隆抗体（1:50）或针对胶原蛋白X的小鼠单克隆抗体（1:50）。同时配制抗兔或抗小鼠的二抗。
  4. 配制1 mL木瓜蛋白酶溶液：在PBS中加入10 U/mL木瓜蛋白酶、0.1 M醋酸钠、2.4 mM EDTA和5 mM L-半胱氨酸。
  5. 配制100 mL二甲基亚甲蓝（DMMB）染料溶液：100 µL 16 mg/L 1,9-二甲基亚甲蓝、40 mM 甘氨酸、40 mM NaCl 和 9.5 mM HCl，pH 3.0。
  6. 通过团块切片的阿利新蓝和甲苯胺蓝染色评估软骨形成分化。
    1. 将一个hiPSC-Chon细胞团或hMSC-Chon细胞团置于1 mL 10%中性缓冲福尔马林中固定24小时。
    2. 将沉淀物转移至含有1 mL 70%乙醇的H2O. 用1 mL梯度乙醇系列对沉淀物进行脱水处理（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每个梯度 3 分钟。
    3. 用1 mL纯二甲苯将沉淀物澄清三次。将沉淀物置于65 °C烘箱中，用石蜡浸润1小时。将沉淀物包埋于7 x 7 x 5 mm的石蜡块中。3 常规组织学步骤，使用底模6.
    4. 用切片机切出厚度约为 4 µm 的相邻切片7将切片贴附于玻璃载片上。
    5. 将载玻片置于60 °C烘箱中干燥2 h。使用100%二甲苯分三次脱蜡（每次3 min）。
    6. 使用梯度递减的酒精系列进行再水化（即， 100, 100, 95, 95, 70, 50 和 25% H₂O2O，每次3分钟）后，再用去离子水最终冲洗5分钟。
    7. 用0.1%阿尔新蓝试剂或1%甲苯胺蓝染色4-5小时，然后用蒸馏水冲洗。
    8. 使用梯度乙醇系列进行脱水（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每步 3 分钟，随后在 100% 二甲苯中连续透明三步。封片后在显微镜下观察。
  7. 进行免疫组织化学染色。
    注意：额外的组织沉淀切片将通过免疫组织化学进一步评估。
    1. 脱蜡和复水后，将切片置于1 mM EDTA（pH 8.0，经高压灭菌水配制）中煮沸。在略低于沸点的温度下静置8分钟，随后让切片在室温下冷却。
    2. 用去离子水冲洗载玻片3次。将切片置于3% H2O2 在室温下用甲醇溶液孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
    3. 用去离子水冲洗载玻片，并将其浸入DPBS中5分钟。在载玻片的切片上加入50–100 µL适当稀释（1:50）的一抗溶液，然后于室温下在湿盒中孵育1小时。
    4. 用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。将样品与相应的二抗孵育（即， 室温下孵育15分钟（使用抗兔或抗鼠二抗）。
    5. 用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。在显微镜下进行DAB检测。
    6. 用DPBS洗涤载玻片3次（每次2分钟）。将载玻片浸入苏木精溶液中1-2分钟，对细胞核进行复染。随后用梯度乙醇脱水（25%、50%、75%、90%、95%、100%和100%；每步3分钟），接着用二甲苯连续透明3次。最后封片，并在显微镜下观察。
  8. 检测sGAG含量。
    1. 在60 °C的木瓜蛋白酶溶液中消化软骨生成小球2小时。
    2. 使用dsDNA检测试剂盒和荧光计系统测定DNA含量。通过将sGAG与DMMB染料溶液混合，在525 nm波长下测定吸光度以测量sGAG含量。8.
    3. 根据鲨鱼软骨素硫酸标准曲线计算sGAG的浓度。
  9. 对hiPSC-Chon细胞球体进行软骨形成分化标志物的实时PCR分析。
    1. 加入500 µL预冷的裂解试剂至一个离心管中，收集3-4个相同的软骨生成微球。充分涡旋混匀。室温孵育样品5分钟。
    2. 加入0.1 mL氯仿。将样品涡旋振荡15秒，室温孵育3分钟。在4 °C、12,000 x g条件下离心15分钟。将上层水相（约250 µL）转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    3. 向样品中加入25 µL乙酸钠和1 µL糖原。加入250 µL异丙醇以沉淀RNA，充分混匀。室温孵育10分钟。
    4. 在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。完全移除上清液。用 500 µL 75% 乙醇将 RNA 沉淀洗涤两次。
    5. 在 7,500 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。彻底去除残留乙醇，将 RNA 沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。用 10 µL 无核酸酶水溶解 RNA。
    6. 使用逆转录系统将RNA转化为cDNA。利用qPCR试剂盒预混液（2×）和实时PCR系统对cDNA样品进行实时PCR扩增。9.
      注意：引物序列如下：
      h聚集蛋白聚糖-F:TCGAGGACAGCGAGGCC
      hAGGRECAN-R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA；
      hβ-肌动蛋白-F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC
      hβ-肌动蛋白-R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC；
      hCOL2-F：TGGACGATCAGGCGAAACC；
      hCOL2-R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT；
      hSOX9-F：AGCGAACGCACATCAAGAC；
      hSOX9-R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG；
      hCOL10-F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT；
      hCOL10-R：GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT

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结果

hiPSCs 的软骨分化：

使用拟胚体形成培养基和基础培养基将人诱导多能干细胞（hiPSCs）向间充质谱系进行分化。采用多步培养方法（图1）。首先，hiPSCs通过拟胚体（EB）形成进行自发分化，持续10天（D10；图2A）。其次，细胞从拟胚体中迁移并继续培养10天（D10+10）。在这两个阶段中，iPSCs逐渐失去其原始形态，转变为纺锤形形态（图2B），传代后进一步变为成纤维细胞样形态。第三，细胞在传代后以单层形式扩增（图2C），此过程中排除残留的未分化细胞。随后，在单层培养5-7天后，细胞进一步扩增并定向分化为成纤维细胞样细胞（D10+10+7）。第四，当hiPSC来源的成纤维细胞样细胞（hiPSC-F）融合度达到约9...

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讨论

本文提供了一种通过诱导性多能干细胞（iPSCs）从外周血细胞（PBCs）生成软骨细胞的实验方案。由于PBCs在临床领域更为常见且应用广泛，因此可作为重编程的一种潜在替代来源。在本研究中，采用游离型载体（EV）将PBCs重编程为iPSCs，该方法基于Zhang et al.11建立的技术。这种无整合方法避免了病毒介导的基因毒性整合问题，被认为在临床领域具有广泛的应用前景12,13。本研究中从血细胞获得无整合iPSCs的重编程效率令人满意，仅需2 mL外周血即可产生超过30个iPSC克隆。因此，PBCs有望成为用于软骨组织工程及其他临床应用的iPSCs种子细胞来源。

从人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行软骨分化的主要步骤包括：拟胚体（EB）形成、EB细胞迁移生长、单层培养以及三维团块培养。未分化的hiPSC克隆使用火焰拉制的玻璃针切割成较小的片段。尽管机械法技术要求较高，但相较于酶消化法（如dispas...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢张小斌提供的质粒。同时感谢高韶荣和王倩菲在实验过程中给予的热心帮助。本研究受到国家自然科学基金（编号：81101346、81271963、81100331）、北京市215高层次人才项目（编号：2014-3-025）、北京朝阳医院基金（编号：CYXX-2017-01）以及中国科学院青年创新促进会（Y.L.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Knockout DMEMInvitrogen10829018用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基的基础培养基
Knockout 血清替代物（KSR）Invitrogen10828028一种成分更明确、不含胎牛血清（FBS）的培养基添加剂，用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基
胎牛血清（FBS）Hyclonesh30070.03用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基，为细胞培养提供优良性能
非必需氨基酸ChemiconTMS-001-C作为所有细胞培养基中的生长添加剂，用于促进细胞生长和提高细胞活力
L-谷氨酰胺InvitrogenTMS-002-C细胞培养所需的一种氨基酸
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Peprotech100-18B一种用于维持 hiPSC 多能性和自我更新能力的细胞因子
分散酶（Dispase）Invitrogen17105041用于 hiPSC 传代培养时的细胞解离
DMEMGibcoC11960用于间充质干细胞（MSC）培养基的基础培养基
0.1% 明胶MilliporeES-006-B用于促进细胞在培养皿表面的贴附
0.25% 胰蛋白酶/EDTAGibco25200072用于细胞解离
DPBSGibco14190250一种平衡盐溶液，用于细胞洗涤或试剂配制
2-巯基乙醇invitrogen21985023作为所有细胞培养基中的生长添加剂
ITSinvitrogen41400045胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，用于软骨向分化
抗坏血酸Sigma4403又称维生素 C，有助于细胞活跃生长，并具有抗氧化特性
丙酮酸钠Gibco11360070添加至细胞培养基中，作为葡萄糖之外的能量来源
转化生长因子-β1PeprotechAF-100-21C一种调控细胞增殖、生长及软骨向分化的细胞因子
兔多克隆抗 II 型胶原抗体Abcamab34712该抗体可与 II 型胶原反应，而 II 型胶原为软骨组织特异性表达
小鼠单克隆抗 X 型胶原抗体Abcamab49945该抗体可与 X 型胶原反应，X 型胶原为肥大软骨细胞的产物
PermountFisher ScientificSP15-100用于载玻片的封片及长期保存
甲苯胺蓝Sigma89640用于检测蛋白聚糖
阿利新蓝Amresco#0298用于检测氨基葡萄糖聚糖
木瓜蛋白酶SigmaP4762-25MG用于消化软骨向分化形成的细胞团块
二甲基亚甲基蓝Sigma341088-1G用于定量糖胺聚糖
鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐SigmaC4384-250MG用于绘制标准曲线以测定 sGAG 含量
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ32851 (100)用于测定 DNA 含量
TRIzolInvitrogen15596018用于从细胞中提取 RNA
逆转录系统PromegaA3500用于将 RNA 转化为 cDNA
SYBR FAST qPCR 试剂盒预混液KapaKK4601用于实时 PCR

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.

The corresponding author was updated from:

Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences

The corresponding author is now listed as:

Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞
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