从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

摘要

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。

摘要

本研究中，我们采用外周血细胞（PBCs）作为种子细胞，通过无整合方法经由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞。在形成拟胚体（EB）并扩增成纤维样细胞后，iPSCs在无血清且无异源成分的条件下诱导软骨向分化21天。软骨细胞诱导完成后，通过形态学、免疫组织化学、生物化学分析以及软骨向分化标志物的实时定量PCR检测对细胞表型进行评估。软骨化细胞团呈阿利新蓝和甲苯胺蓝阳性染色。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学染色亦为阳性。与hiPSCs和成纤维样细胞相比，软骨化细胞团中硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量以及软骨向分化标志物COLLAGEN 2 （COL2）、COLLAGEN 10（COL10）、SOX9和AGGRECAN均显著上调。这些结果表明，PBCs可作为种子细胞用于生成个体化且成本效益高的iPSCs，以实现软骨修复。

引言

软骨组织的自我修复和再生能力非常有限。目前用于恢复软骨和关节功能的各种外科干预和生物治疗方法，效果均不理想。近年来干细胞技术的发展有望彻底改变整个软骨修复领域¹。多种干细胞已被研究作为种子细胞，其中人诱导多能干细胞（hiPSCs）似乎是前景最为广阔的选择，因其能够提供多种患者特异性细胞，且不会引发排斥反应²。此外，它们能够克服成体细胞增殖能力有限的问题，持续保持自我更新和多向分化潜能。同时，还可通过基因靶向技术改变其基因型，从而获得特定类型的软骨细胞。

成纤维细胞已被广泛用于诱导多能干细胞（iPSCs）的生成，因为其重编程潜能已得到深入研究。然而，仍存在一些需要克服的局限性，例如患者取材时的疼痛性活检以及对 体外 成纤维细胞的扩增，可能导致基因突变³最近发现，PBCs 在重编程方面具有优势⁴此外，它们常被广泛使用且储量丰富。这些材料有可能将研究重点从皮肤转移。然而，据我们所知，关于PBC重编程后分化为软骨细胞的报道尚十分有限。

在本研究中，我们利用外周血细胞（PBCs）作为替代来源，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），然后通过团块培养系统将iPSCs向软骨细胞谱系分化，以模拟软骨细胞的形成过程。

方案

从外周血细胞（PBCs）生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案可参见我们之前的研究⁵。本研究已获本机构机构审查委员会批准。

1. 胚状体（EB）形成

1. 配制50 mL hiPSC培养基：在Knockout Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加15% Knockout血清替代物（KSR）、5% 胎牛血清（FBS）、1× 非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和8 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
2. 配制50 mL EB形成培养基：DMEM添加15% KSR、5% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
3. 配制50 mL基础培养基：DMEM添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
4. 配制10 mL dispase溶液，浓度为1 mg/mL，溶于无血清DMEM培养基中。
5. 将hiPSCs接种于含饲养层细胞的60 mm组织培养皿中（即， 一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞。当细胞融合度达到80-90%时，使用dispase消化并解离细胞，每4-5天以1:3比例传代人诱导多能干细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。₂ 培养箱
6. 当iPSC细胞融合度达到80-90%时，使用火焰拉制的玻璃针将未分化的hiPSC集落切割成较小的片段（直径约50-100 µm）。通常，使用60 mm培养皿中的hiPSC集落来在100 mm培养皿中生成拟胚体（EB）。
   1. 将少于100个微小菌落碎片接种于含10 mL拟胚体形成培养基的100 mm非黏附型培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。₂ 培养箱
7. 每2天将初始培养基约25%更换为等量的基础培养基。倾斜培养皿使胚胎体（EBs）沉降，小心吸除上层3 mL培养基，加入4 mL新鲜基础培养基，注意勿扰动EBs。
   注意：在显微镜下，EBs 在形态学上表现为菌落碎片，呈具有光滑边界的圆形外观。
8. 在非黏附型培养皿中培养10天后，使用前将新的100 mm组织培养皿用4 mL 0.1%明胶在37 °C孵育30 min进行包被。
9. 将培养基和拟胚体从100 mm非黏附性培养皿转移至15 mL锥形管中。静置4–5分钟使拟胚体沉降。小心吸除上清液，保留少于0.5 mL的含拟胚体培养基。
10. 将少于100个EBs接种至含10 mL基础培养基的100 mm明胶包被的组织培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。₂ 培养箱

2. 细胞沉淀形成与软骨细胞分化

1. 配制10 mL 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。配制80 mL 基础培养基：DMEM，添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
2. 配制10 mL软骨诱导分化培养基：在DMEM（高糖）中添加10%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（ITS）、0.1 µM地塞米松、1 mM抗坏血酸、1%丙酮酸钠和10 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）。
3. 48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。
   注意：培养10天后，成纤维样细胞应已从胚体（EBs）中长出并扩展。
   1. 在使用前，将100 mm培养皿用4 mL 0.1%明胶于37 °C孵育30分钟进行包被。弃去细胞上清液，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次。
   2. 用3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化细胞5分钟，加入4 mL基础培养基中和。
4. 通过移液吹打5-10次并将细胞悬液过70 µm尼龙筛网，使细胞解离为单细胞。将细胞悬液在200 x g离心5分钟。用10 mL基础培养基将细胞重新接种至新的100 mm胶原蛋白包被的组织培养皿中。
5. 48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。
   注意：细胞呈现出均一的成纤维细胞样形态。
6. 当达到约90-100%汇合度时（即， 约5-7天后，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37 °C消化5分钟收集细胞。加入4 mL基础培养基中和。通过移液吹打5次使细胞充分解离为单细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
   1. 放置 3 × 10⁵ 将细胞置于15 mL聚丙烯管中，在室温下以200 × g离心5分钟。用1 mL软骨诱导分化培养基重悬细胞。
7. 以 300 × g 离心 3 分钟，重新沉淀细胞，并保持细胞呈小团状沉淀。将离心管置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中₂ 孵育21天。不要将瓶盖拧紧，以允许气体交换。
8. 每隔三天更换四分之三的培养基，加入新鲜的软骨诱导分化培养基。
   注意：培养21天后，应形成hiPSC软骨细胞团（hiPSC-Chon）。人源间充质干细胞（MSCs）作为阳性对照，同样在软骨分化培养基中培养21天，以形成软骨细胞团（hMSC-Chon）。

3. 软骨形成分化分析

1. 配制10 mL 10%中性缓冲福尔马林。
2. 配制 50 mL 0.1% 阿尔新蓝试剂和 50 mL 1% 甲苯胺蓝试剂。
3. 配制1 mL一抗溶液：含针对胶原蛋白II的兔多克隆抗体（1:50）或针对胶原蛋白X的小鼠单克隆抗体（1:50）。同时配制抗兔或抗小鼠的二抗。
4. 配制1 mL木瓜蛋白酶溶液：在PBS中加入10 U/mL木瓜蛋白酶、0.1 M醋酸钠、2.4 mM EDTA和5 mM L-半胱氨酸。
5. 配制100 mL二甲基亚甲蓝（DMMB）染料溶液：100 µL 16 mg/L 1,9-二甲基亚甲蓝、40 mM 甘氨酸、40 mM NaCl 和 9.5 mM HCl，pH 3.0。
6. 通过团块切片的阿利新蓝和甲苯胺蓝染色评估软骨形成分化。
   1. 将一个hiPSC-Chon细胞团或hMSC-Chon细胞团置于1 mL 10%中性缓冲福尔马林中固定24小时。
   2. 将沉淀物转移至含有1 mL 70%乙醇的H₂O. 用1 mL梯度乙醇系列对沉淀物进行脱水处理（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每个梯度 3 分钟。
   3. 用1 mL纯二甲苯将沉淀物澄清三次。将沉淀物置于65 °C烘箱中，用石蜡浸润1小时。将沉淀物包埋于7 x 7 x 5 mm的石蜡块中。³ 常规组织学步骤，使用底模⁶.
   4. 用切片机切出厚度约为 4 µm 的相邻切片⁷将切片贴附于玻璃载片上。
   5. 将载玻片置于60 °C烘箱中干燥2 h。使用100%二甲苯分三次脱蜡（每次3 min）。
   6. 使用梯度递减的酒精系列进行再水化（即， 100, 100, 95, 95, 70, 50 和 25% H₂O₂O，每次3分钟）后，再用去离子水最终冲洗5分钟。
   7. 用0.1%阿尔新蓝试剂或1%甲苯胺蓝染色4-5小时，然后用蒸馏水冲洗。
   8. 使用梯度乙醇系列进行脱水（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每步 3 分钟，随后在 100% 二甲苯中连续透明三步。封片后在显微镜下观察。
7. 进行免疫组织化学染色。
   注意：额外的组织沉淀切片将通过免疫组织化学进一步评估。
   1. 脱蜡和复水后，将切片置于1 mM EDTA（pH 8.0，经高压灭菌水配制）中煮沸。在略低于沸点的温度下静置8分钟，随后让切片在室温下冷却。
   2. 用去离子水冲洗载玻片3次。将切片置于3% H₂O₂ 在室温下用甲醇溶液孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
   3. 用去离子水冲洗载玻片，并将其浸入DPBS中5分钟。在载玻片的切片上加入50–100 µL适当稀释（1:50）的一抗溶液，然后于室温下在湿盒中孵育1小时。
   4. 用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。将样品与相应的二抗孵育（即， 室温下孵育15分钟（使用抗兔或抗鼠二抗）。
   5. 用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。在显微镜下进行DAB检测。
   6. 用DPBS洗涤载玻片3次（每次2分钟）。将载玻片浸入苏木精溶液中1-2分钟，对细胞核进行复染。随后用梯度乙醇脱水（25%、50%、75%、90%、95%、100%和100%；每步3分钟），接着用二甲苯连续透明3次。最后封片，并在显微镜下观察。
8. 检测sGAG含量。
   1. 在60 °C的木瓜蛋白酶溶液中消化软骨生成小球2小时。
   2. 使用dsDNA检测试剂盒和荧光计系统测定DNA含量。通过将sGAG与DMMB染料溶液混合，在525 nm波长下测定吸光度以测量sGAG含量。⁸.
   3. 根据鲨鱼软骨素硫酸标准曲线计算sGAG的浓度。
9. 对hiPSC-Chon细胞球体进行软骨形成分化标志物的实时PCR分析。
   1. 加入500 µL预冷的裂解试剂至一个离心管中，收集3-4个相同的软骨生成微球。充分涡旋混匀。室温孵育样品5分钟。
   2. 加入0.1 mL氯仿。将样品涡旋振荡15秒，室温孵育3分钟。在4 °C、12,000 x g条件下离心15分钟。将上层水相（约250 µL）转移至新的1.5 mL微量离心管中。
   3. 向样品中加入25 µL乙酸钠和1 µL糖原。加入250 µL异丙醇以沉淀RNA，充分混匀。室温孵育10分钟。
   4. 在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。完全移除上清液。用 500 µL 75% 乙醇将 RNA 沉淀洗涤两次。
   5. 在 7,500 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。彻底去除残留乙醇，将 RNA 沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。用 10 µL 无核酸酶水溶解 RNA。
   6. 使用逆转录系统将RNA转化为cDNA。利用qPCR试剂盒预混液（2×）和实时PCR系统对cDNA样品进行实时PCR扩增。⁹.
      注意：引物序列如下：
      h聚集蛋白聚糖-F:TCGAGGACAGCGAGGCC
      hAGGRECAN-R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA；
      hβ-肌动蛋白-F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC
      hβ-肌动蛋白-R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC；
      hCOL2-F：TGGACGATCAGGCGAAACC；
      hCOL2-R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT；
      hSOX9-F：AGCGAACGCACATCAAGAC；
      hSOX9-R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG；
      hCOL10-F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT；
      hCOL10-R：GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT

结果

hiPSCs 的软骨分化：

使用拟胚体（EB）形成培养基和基础培养基将人诱导多能干细胞（hiPSCs）向间充质谱系进行分化。采用多步培养方法（图1）。首先，hiPSCs通过拟胚体形成进行自发分化，持续10天（D10；图2A）。其次，细胞从拟胚体中迁移并继续培养10天（D10+10）。在这两个阶段中，iPSCs逐渐失去其原始形态，转变为纺锤形形态（图2B），传代后进一步变为成纤维细胞样形态。第三步，在传代后以单层方式扩增细胞（图2C），此过程中去除残留的未分化细胞。随后，在单层培养5–7天后，细胞进一步扩增并定向分化为成纤维细胞样细胞（D10+10+7）。第四步，当hiPSC来源的成纤维细胞样细胞（hiPSC-F）融合度达到...

讨论

本文提供了一种通过诱导性多能干细胞（iPSCs）从外周血细胞（PBCs）生成软骨细胞的实验方案。由于PBCs在临床领域更为常见且应用广泛，因此可作为重编程的一种潜在替代来源。在本研究中，采用游离型载体（EV）将PBCs重编程为iPSCs，该方法基于Zhang et al.¹¹建立的技术。这种无整合方法避免了病毒介导的基因毒性整合问题，被认为在临床领域具有广泛的应用前景^12,13。本研究中从血细胞获得无整合iPSCs的重编程效率令人满意，仅需2 mL外周血即可产生超过30个iPSC克隆。因此，PBCs有望成为用于软骨组织工程及其他临床应用的iPSCs种子细胞来源。

从人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行软骨分化的主要步骤包括：拟胚体（EB）形成、EB细胞迁移生长、单层培养以及三维团块培养。未分化的hiPSC克隆使用火焰拉制的玻璃针切割成较小的片段。尽管机械法技术要求较高，但相较于酶消化法（如dispas...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基的基础培养基
Knockout 血清替代物（KSR）	Invitrogen	10828028	一种成分更明确、不含胎牛血清（FBS）的培养基添加剂，用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基
胎牛血清（FBS）	Hyclone	sh30070.03	用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基，为细胞培养提供优良性能
非必需氨基酸	Chemicon	TMS-001-C	作为所有细胞培养基中的生长添加剂，用于促进细胞生长和提高细胞活力
L-谷氨酰胺	Invitrogen	TMS-002-C	细胞培养所需的一种氨基酸
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	100-18B	一种用于维持 hiPSC 多能性和自我更新能力的细胞因子
分散酶（Dispase）	Invitrogen	17105041	用于 hiPSC 传代培养时的细胞解离
DMEM	Gibco	C11960	用于间充质干细胞（MSC）培养基的基础培养基
0.1% 明胶	Millipore	ES-006-B	用于促进细胞在培养皿表面的贴附
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25200072	用于细胞解离
DPBS	Gibco	14190250	一种平衡盐溶液，用于细胞洗涤或试剂配制
2-巯基乙醇	invitrogen	21985023	作为所有细胞培养基中的生长添加剂
ITS	invitrogen	41400045	胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，用于软骨向分化
抗坏血酸	Sigma	4403	又称维生素 C，有助于细胞活跃生长，并具有抗氧化特性
丙酮酸钠	Gibco	11360070	添加至细胞培养基中，作为葡萄糖之外的能量来源
转化生长因子-β1	Peprotech	AF-100-21C	一种调控细胞增殖、生长及软骨向分化的细胞因子
兔多克隆抗 II 型胶原抗体	Abcam	ab34712	该抗体可与 II 型胶原反应，而 II 型胶原为软骨组织特异性表达
小鼠单克隆抗 X 型胶原抗体	Abcam	ab49945	该抗体可与 X 型胶原反应，X 型胶原为肥大软骨细胞的产物
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	用于载玻片的封片及长期保存
甲苯胺蓝	Sigma	89640	用于检测蛋白聚糖
阿利新蓝	Amresco	#0298	用于检测氨基葡萄糖聚糖
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762-25MG	用于消化软骨向分化形成的细胞团块
二甲基亚甲基蓝	Sigma	341088-1G	用于定量糖胺聚糖
鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐	Sigma	C4384-250MG	用于绘制标准曲线以测定 sGAG 含量
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32851 (100)	用于测定 DNA 含量
TRIzol	Invitrogen	15596018	用于从细胞中提取 RNA
逆转录系统	Promega	A3500	用于将 RNA 转化为 cDNA
SYBR FAST qPCR 试剂盒预混液	Kapa	KK4601	用于实时 PCR