从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

摘要

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。

摘要

本研究中，我们采用外周血细胞（PBCs）作为种子细胞，通过无整合方法经由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞。在形成拟胚体（EB）并扩增成纤维样细胞后，iPSCs在无血清且无异源成分的条件下诱导软骨向分化21天。软骨细胞诱导完成后，通过形态学、免疫组织化学、生物化学分析以及软骨向分化标志物的实时定量PCR检测对细胞表型进行评估。软骨化细胞团呈阿利新蓝和甲苯胺蓝阳性染色。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学染色亦为阳性。与hiPSCs和成纤维样细胞相比，软骨化细胞团中硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量以及软骨向分化标志物COLLAGEN 2 （COL2）、COLLAGEN 10（COL10）、SOX9和AGGRECAN均显著上调。这些结果表明，PBCs可作为种子细胞用于生成个体化且成本效益高的iPSCs，以实现软骨修复。

引言

软骨组织的自我修复和再生能力非常有限。目前用于恢复软骨和关节功能的各种外科干预和生物治疗方法，效果均不理想。近年来干细胞技术的发展有望彻底改变整个软骨修复领域¹。多种干细胞已被研究作为种子细胞，其中人诱导多能干细胞（hiPSCs）似乎是前景最为广阔的选择，因其能够提供多种患者特异性细胞，且不会引发排斥反应²。此外，它们能够克服成体细胞增殖能力有限的问题，持续保持自我更新和多向分化潜能。同时，还可通过基因靶向技术改变其基因型，从而获得特定类型的软骨细胞。

成纤维细胞已被广泛用于诱导多能干细胞（iPSCs）的生成，因为其重编程潜能已得到深入研究。然而，仍存在一些需要克服的局限性，例如患者取材时的疼痛性活检以及对 体外 成纤维细胞的扩增，可能导致基因突变³最近发现，PBCs 在重编程方面具有优势⁴此外，它们常被广泛使用且储量丰富。这些材料有可能将研究重点从皮肤转移。然而，据我们所知，关于PBC重编程后分化为软骨细胞的报道尚十分有限。

在本研究中，我们利用外周血细胞（PBCs）作为替代来源，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），然后通过团块培养系统将iPSCs向软骨细胞谱系分化，以模拟软骨细胞的形成过程。

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方案

从外周血细胞（PBCs）生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案可参见我们之前的研究⁵。本研究已获本机构机构审查委员会批准。

1. 胚状体（EB）形成

1. 配制50 mL hiPSC培养基：在Knockout Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加15% Knockout血清替代物（KSR）、5% 胎牛血清（FBS）、1× 非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和8 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
2. 配制50 mL EB形成培养基：DMEM添加15% KSR、5% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
3. 配制50 mL基础培养基：DMEM添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。
4. 配制10 mL dispase溶液，浓度为1 mg/mL，溶于无血清DMEM培养基中。
5. 将hiPSCs接种于含饲养层细胞的60 mm组织培养皿中（即， 一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞。当细胞融合度达到80-90%时，使用dispase消化并解离细胞，每4-5天以1:3比例传代人诱导多能干细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。₂ 培养箱
6. <....

结果

hiPSCs 的软骨分化：

采用EB形成培养基和基础培养基将hiPSCs向间充质谱系分化。使用多步培养法（图1）。首先，hiPSCs通过拟胚体（EB）形成进行自发分化，持续10天（D10；图2A）。其次，细胞从EB中迁出并继续培养10天（D10+10）。在这两个阶段中，iPSCs逐渐失去原有的形态，转变为梭形形态（图2B），传代后进一步变为成纤维细胞样形态。第三步，在传代后进行单层扩增培养（图2C），此过程中排除残留的未分化细胞。随后，细胞在单层培养中进一步扩增，并在5–7天内定向分化为成纤维细胞样细胞（D10+10+7）。第四步，当hiPSC成纤维细胞样细胞（hiPSC-F）融合度达到约90%时，通过三维细胞团（pell.......

讨论

本文提供了一种通过诱导性多能干细胞（iPSCs）从外周血细胞（PBCs）生成软骨细胞的实验方案。由于PBCs在临床领域更为常见且应用广泛，因此可作为重编程的一种潜在替代来源。在本研究中，采用游离型载体（EV）将PBCs重编程为iPSCs，该方法基于Zhang et al.¹¹建立的技术。这种无整合方法避免了病毒介导的基因毒性整合问题，被认为在临床领域具有广泛的应用前景^12,13。本研究中从血细胞获得无整合iPSCs的重编程效率令人满意，仅需2 mL外周血即可产生超过30个iPSC克隆。因此，PBCs有望成为用于软骨组织工程及其他临床应用的iPSCs种子细胞来源。

从人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行软骨分化的主要步骤包括：拟胚体（EB）形成、EB细胞迁移生长、单层培养以及三维团块培养。未分化的hiPSC克隆使用火焰拉制的玻璃针切割成较小的片段。尽管机械法技术要求较高，但相较于酶消化法（如dispas.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基的基础培养基
Knockout 血清替代物（KSR）	Invitrogen	10828028	一种成分更明确、不含胎牛血清（FBS）的培养基添加剂，用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基
胎牛血清（FBS）	Hyclone	sh30070.03	用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基，为细胞培养提供优良性能
非必需氨基酸	Chemicon	TMS-001-C	作为所有细胞培养基中的生长添加剂，用于促进细胞生长和提高细胞活力
L-谷氨酰胺	Invitrogen	TMS-002-C	细胞培养所需的一种氨基酸
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	100-18B	一种用于维持 hiPSC 多能性和自我更新能力的细胞因子
分散酶（Dispase）	Invitrogen	17105041	用于 hiPSC 传代培养时的细胞解离
DMEM	Gibco	C11960	用于间充质干细胞（MSC）培养基的基础培养基
0.1% 明胶	Millipore	ES-006-B	用于促进细胞在培养皿表面的贴附
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25200072	用于细胞解离
DPBS	Gibco	14190250	一种平衡盐溶液，用于细胞洗涤或试剂配制
2-巯基乙醇	invitrogen	21985023	作为所有细胞培养基中的生长添加剂
ITS	invitrogen	41400045	胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，用于软骨向分化
抗坏血酸	Sigma	4403	又称维生素 C，有助于细胞活跃生长，并具有抗氧化特性
丙酮酸钠	Gibco	11360070	添加至细胞培养基中，作为葡萄糖之外的能量来源
转化生长因子-β1	Peprotech	AF-100-21C	一种调控细胞增殖、生长及软骨向分化的细胞因子
兔多克隆抗 II 型胶原抗体	Abcam	ab34712	该抗体可与 II 型胶原反应，而 II 型胶原为软骨组织特异性表达
小鼠单克隆抗 X 型胶原抗体	Abcam	ab49945	该抗体可与 X 型胶原反应，X 型胶原为肥大软骨细胞的产物
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	用于载玻片的封片及长期保存
甲苯胺蓝	Sigma	89640	用于检测蛋白聚糖
阿利新蓝	Amresco	#0298	用于检测氨基葡萄糖聚糖
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762-25MG	用于消化软骨向分化形成的细胞团块
二甲基亚甲基蓝	Sigma	341088-1G	用于定量糖胺聚糖
鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐	Sigma	C4384-250MG	用于绘制标准曲线以测定 sGAG 含量
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32851 (100)	用于测定 DNA 含量
TRIzol	Invitrogen	15596018	用于从细胞中提取 RNA
逆转录系统	Promega	A3500	用于将 RNA 转化为 cDNA
SYBR FAST qPCR 试剂盒预混液	Kapa	KK4601	用于实时 PCR