利用重组腺相关病毒9型系统性递送微小RNA治疗啮齿类动物神经肌肉疾病

摘要

本文描述了在神经肌肉疾病的小鼠模型中，使用重组腺相关病毒9型递送microRNA的方法。在小鼠中单次外周给药即可在肌肉和运动神经元中实现miRNA的持续过表达，为在活体（in vivo）条件下研究miRNA的功能及其治疗潜力提供了机会。

摘要

通过内源性miRNA通路的RNA干扰通过转录后基因沉默调控蛋白质合成，从而调节基因表达。近年来，miRNA介导的基因调控在治疗由毒性功能获得机制引起的神经系统疾病方面展现出潜在应用前景。然而，向靶组织的有效递送限制了其应用。本研究采用脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）的转基因小鼠模型——一种由雄激素受体（AR）中多聚谷氨酰胺扩展引起的神经肌肉疾病——来验证一种新发现的靶向AR的miRNA（miR-298）的基因沉默效果。我们利用重组腺相关病毒9型（rAAV）载体过表达miR-298，以促进非分裂细胞的转导。在SBMA小鼠中单次尾静脉注射该载体后，可在骨骼肌和运动神经元中诱导miR-298持续且广泛地过表达，并改善小鼠的神经肌肉表型。

引言

miRNA 是一类非编码 RNA，长度为 21-23 个核苷酸，在基因表达调控以及多种细胞和代谢通路的控制中发挥重要作用。¹ 基因表达主要通过诱导转录后基因沉默或 mRNA 降解来实现调控。² miRNA 通常与编码基因的 3' 非翻译区（UTR）互补，但也有研究报道其可结合靶 mRNA 的 5'UTR 和编码区。³

随着对miRNA在人类疾病发病机制中作用的认识不断深入，对单个miRNA或miRNA家族进行药理学调控正逐渐成为一种可行的治疗策略。与其他RNA抑制策略相比，miRNA具有多种优势：由于分子量小，miRNA毒性较低、免疫原性较弱，并且易于递送进入细胞。^4,5,6 miRNA通常在细胞网络中具有多个靶点，因此在考虑向靶组织有效递送的同时，还需充分评估潜在的脱靶效应和安全性问题。

神经肌肉疾病是一类影响肌肉和运动神经元的获得性或遗传性疾病。骨骼肌的药物靶向递送是当前新兴的研究领域，其主要挑战在于如何在治疗窗内实现药物的广泛分布。⁷ 运动神经元更难靶向，主要是因为血脑屏障限制了药物的进入。

本研究使用了脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）的细胞培养和小鼠模型。SBMA 是一种由毒性功能获得机制引起的神经肌肉疾病，骨骼肌和运动神经元均会受累。^8,9 SBMA（肯尼迪病；OMIM #313200）是一种X连锁遗传病，其特征为肌肉无力和萎缩，由 AR 基因中的CAG重复序列扩增引起，该突变导致 AR 蛋白中出现延长的多聚谷氨酰胺链。¹⁰ 目前尚无针对该疾病的疾病修饰治疗手段。本研究中使用的转基因小鼠模型可重现该疾病的多种特征，包括性别特异性、运动神经元病理改变以及进行性肌肉萎缩。¹¹

在本研究中，我们的工作重点是鉴定一种能够直接下调突变AR转基因表达的miRNA，并设计一种安全高效的方法，将该miRNA递送至疾病小鼠模型的脊髓和骨骼肌。

在此，我们鉴定了一种尚未充分表征的miRNA，即miRNA-298（登录号 MIMAT0004901），¹² 直接降低SBMA模型中突变AR的表达水平。为了实现将miR-298递送至靶组织，我们采用病毒载体策略，使用重组腺相关病毒9型（rAAV9）。rAAV9能够穿越血脑屏障，并在包括神经元在内的非分裂细胞中介导长期的基因表达。¹³ 单次系统性给予AAV9-miR-298可在SBMA小鼠中实现miRNA的持续表达，有效转导肌肉和运动神经元，下调AR表达，并改善疾病表型。¹⁴ 该方法可用于实现miRNA或antagomir的过表达 体内.

方案

所有操作均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》（第8版，国家科学院出版社，2011年修订版）进行，并已获得美国国家神经疾病与卒中研究所动物护理委员会的批准。

1. AAV9-miRNA 设计策略与 miRNA 筛选

1. 利用miRWalk预测数据库筛选与目标基因mRNA 3'UTR区域相互作用的候选miRNA。¹⁵
   注意：将miRNA序列的最小种子序列长度限制为至少7个核苷酸。选择其他已建立的miRNA预测程序（如miRanda、miRDB、Targetscan）进行比较分析。根据这些筛选标准，本文中选择miR-185、miR-298、miR-873和miR-877进行进一步评估。
2. 从miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）获取所选miRNA的序列。
3. 将所选miRNA的pri-mir序列（60–70个核苷酸）及其两侧各250–300个核苷酸的侧翼基因组序列，或一个对照序列，克隆至适当的AAV顺式载体中。
   注意：侧翼序列对于pri-mir的正确表达和成熟miRNA的加工至关重要。选择一种双启动子rAAV顺式载体，其表达盒例如包含人延伸因子-1α（EIF1α）启动子，其后为所选miRNA或对照序列，以及人巨细胞病毒（CMV）启动子，其后为编码GFP荧光标签的cDNA。选用EIF1α启动子是因为其可确保稳定且均一的表达，并具有最低的沉默风险。根据具体应用，也可使用组织特异性或诱导型启动子。
4. 按照已发表的方案制备、纯化并测定AAV滴度。¹⁶
   注意：本研究中，将pri-mir克隆至AAV载体以及病毒生产均由外部厂商完成。

2. AAV-miRNA 质粒尾静脉注射

注意：此步骤需根据目标基因以及小鼠的年龄和体重进行调整。应依据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，结合小鼠的年龄和体重确定给药剂量范围、给药体积及最佳给药途径。注射后约2周起，靶组织中的GFP荧光信号和miRNA表达水平预计达到峰值。以下实验方案适用于成年早期的雄性小鼠。AAV应按照生物安全等级1（Biosafety Level 1）指南作为生物危害物进行操作。

1. 使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将AAV-miRNA质粒储备液分装为100-200 µL的等份，每毫升含10¹⁰-10¹¹个病毒基因组（vg/mL）。 操作AAV溶液时应穿戴实验室生物危害个人防护装备。
   注意：一旦解冻，分装液可在4 °C保存最多两周。病毒储备液可存放于-80 °C冰箱中。
2. 将小鼠固定在市售的固定装置中，例如适当尺寸的塑料管或锥形塑料薄膜管。
3. 用70%酒精擦拭尾部表面。
4. 在尾部下方放置温热垫（28-30 °C），持续30秒以促进血管扩张。也可选择使用红色加热灯（距离2-3英尺）或浸入温水中对动物进行加温。
5. 从尾部远端开始，将装有病毒分装液的针头（27-30 G）斜面向上，与尾部呈15°角插入静脉。注射前，确保针头正确插入。
   1. 若注射过程中感到阻力或皮下出现肿胀，应立即停止操作。拔出针头，并在先前注射部位上方重新穿刺。
      注意：也可通过轻轻回抽针管观察是否有血液进入来确认位置。强力回抽可能导致尾静脉塌陷。若注射时静脉变白，则表明针头已正确插入。
6. 完成注射后，等待数秒再拔出针头。
7. 观察注射部位是否出血。用两指对注射部位施加适度压力，直至出血停止。
8. 将动物放回笼中。

3. 行为学实验

注意：所有实验均由第三方在对处理措施设盲的情况下进行，通过唯一编码的试管隐藏处理信息。处理顺序经过随机化。在执行下述测试时，应控制实验条件（房间类型和一天中的时间），以减少变异。为获得可靠结果，该测试应在四周龄以上的小鼠中进行。小鼠在5周龄时，即病毒注射前，接受一次行为学评估，以获得正常表现的基线数据。病毒注射后，从注射后48小时开始，每周评估一次，直至40周龄。

1. 在开始实验前至少30分钟，将注射了AAV的小鼠带入一个安静、黑暗且无噪音或其他干扰的房间。在此适应期间不要打扰动物。
2. 让小鼠在新环境中适应30分钟，然后开始以下行为学检测（步骤3.3和3.4）。每次行为学检测之间应间隔10分钟。
3. 悬挂 wire 测试
   注意：该测试用于监测肌肉力量和运动功能障碍。
   1. 使用软垫作为缓冲。抓住小鼠尾巴，将其放置在金属丝网格架的中央位置。将网格架抬高至距离地面15–20英寸处，然后缓慢翻转网格，使动物能够调整其抓握姿势。
   2. 当网格完全倒置后，启动计时器并记录小鼠掉落所需的时间。
      注意：小鼠会用四肢悬挂在网格上。如果网格设置过低，小鼠可能无法悬挂。若小鼠在60秒内掉落，应将其重新放回网格，重置计时器，并重复此过程最多再进行两次尝试。记录其中最佳的一次表现。
   3. 当达到60秒的时间上限时，将动物放回笼中。
4. 足迹分析实验
   注意：吸水纸应构成一条长约70 cm、宽约5 cm、两侧墙高5 cm的狭窄跑道。
   1. 用一只手轻轻抓住小鼠，用刷子将红色墨水涂在其前肢脚掌上，蓝色墨水涂在后肢脚掌上。
   2. 将吸水纸平铺于狭窄跑道的底部。
   3. 让小鼠沿跑道从一端到另一端沿直线行走或奔跑，穿过吸水纸。
   4. 使用新的吸水纸重复该过程再进行两次。
   5. 测量前进方向上两个连续步态之间的距离。排除动物刚开始启动和即将结束时的前几个和后几个足迹。

4. 安乐死与组织采集

1. 使用安乐死舱或钟形罩。若使用钟形罩，应在通风橱内进行操作。
2. 将棉球浸透异氟烷后放入钟形罩中。使用物理隔板，防止动物直接接触麻醉材料。在此步骤完成后立即将动物放入钟形罩内。
   注意：不应预先在钟形罩内充入异氟烷，以避免动物发生低氧血症。
3. 持续暴露于异氟烷，直至呼吸停止后30秒。
4. 将小鼠从钟形罩中取出后，立即通过颈椎脱位法实施安乐死。
   注意：此步骤应尽快完成，以避免组织降解。
5. 先采集脊髓，随后采集股四头肌骨骼肌。
   1. 采集脊髓时，暴露小鼠背部，并用固定针将四肢向两侧固定于解剖板上。
   2. 用70%乙醇清洗解剖部位。
   3. 使用锋利的剪刀进行颈椎脱位。
   4. 沿中线切开皮肤。通过横向剪开或小心撕开皮肤的方式去除毛皮，然后将毛皮向上翻过头部。使用剪刀在肩胛骨下方以及脊柱C1-2区域（位于颅底附近）剪断，去除头部。
      1. 在腹侧切开腹壁肌肉，并依次向两侧横向延伸，直至暴露脊柱。
   5. 使用锋利的剪刀从颈段脊髓开始去除椎骨。通过在两侧横断椎弓的方式，去除椎骨的侧部结构。
   6. 完全去除椎骨后，释放出脊髓组织。
6. 采用以下方法，将采集的组织置于预冷的2-甲基丁烷中进行速冻：
   1. 取一个不锈钢容器，加入约一半体积的2-甲基丁烷，并将容器底部约四分之一浸入装有液氮的容器中。
   2. 用液氮预冷2-甲基丁烷1-2分钟。
   3. 用镊子夹取骨骼肌组织浸入2-甲基丁烷中，直至组织变白。立即转移至干冰中，随后于-80 °C保存。
7. 如需进行脊髓免疫染色，应在速冻前于室温下将组织包埋于石蜡块中，具体方法如前所述。¹⁷
8. 如需进行生物化学分析和miRNA定量¹，将采集的组织放入冻存管中，浸入液氮速冻，并于-80 °C保存。

结果

通过单次尾静脉注射，将10¹¹ vg的AAV9-miR-298病毒载体注入5周龄的脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠体内。这些小鼠携带含异常扩增的多聚谷氨酰胺链的人源雄激素受体（AR）转基因（AR97Q），并在10周龄时出现神经肌肉疾病的症状（体重减轻、驼背和肌肉萎缩）¹¹。在给药后2、4、8和12周分别采集腰段脊髓和股四头肌组织，用于miRNA定量、生化检测及免疫组织化学分析（图1）。治疗给药及后续分析均由对分组信息设盲的研究人员完成。

qRT-PCR 分析显示，治疗后两周和四周，miR-298 分别在骨骼肌和脊髓中表达，注射后 8 周骨骼肌中表达水平达到峰值，12 周时脊髓中表达水平达到峰值（图 2）。使用显微镜（Axiovert 100 M）在治疗 10 周后检测到肌肉组织和脊髓运动神经元中的绿色荧光信号，该信号表现为 GFP 与运动神经元标志物胆碱乙酰转移酶（ChAT）的共定位，此时小鼠开始出现疾病表型（图 2）。

采用相同的剂量方案，将一批脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠在7周龄时随机分为两组，通过尾静脉注射给予miR-298或模拟对照（mock），用于后续的生化分析和功能表征。注射后每周进行体重监测和行为学评估，持续至40周龄。qRT-PCR分析显示，miR-298治疗可降低病变组织中突变雄激素受体（AR）的表达水平（图3），并在注射后10周起观察到体重增加和运动功能改善（图4）。

图1：研究设计示意图。 提高miR-298的表达水平 体内 我们向SBMA小鼠注射了（A) 表达 GFP 以及 miR-298 或模拟序列的双启动子 AAV 载体质粒。B小鼠在7周龄（症状前阶段）通过单次尾静脉注射给药。在不同时间点采集一批脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）小鼠的脊髓和股四头肌组织，用于组织分布分析（绿色）。另一批SBMA小鼠在16周龄时接受治疗并处死，用于生化分析（红色）。从给药开始至40周龄期间，每周进行体重和行为学检测，以实现功能表征（蓝色）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：在小鼠中递送AAV9-miR-298。 根据本文所述方法，小鼠通过静脉注射接受AAV9-miR-298-GFP或AAV9-对照-GFP。在注射后2、4、8和12周，从小鼠腰段脊髓和股四头肌中提取总miRNA。通过qRT-PCR检测miR-298的表达水平，包括（A）股四头肌（n = 5）和（B）腰段脊髓（n = 5，P <0.01）。所有数据均以均值±标准误表示。在治疗后10周采集的组织中，AAV载体的广泛转导通过GFP染色定位得到验证，包括（C）股四头肌（原始放大倍数10X，比例尺=100 µm）和（D）腰段脊髓中的运动神经元（原始放大倍数40X，比例尺=10 µm；GFP（绿色）、ChAT（红色）和DAPI（蓝色））。该图改编自doi: 10.1038/mt.2016.13。¹⁴ 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：miRNA-298过表达在小鼠脊髓和股四头肌中下调突变型AR。 采用qRT-PCR检测经AAV9-miR-298-GFP或AAV9-mock-GFP处理的小鼠（A）腰段脊髓和（B）股四头肌中AR mRNA的表达水平。转录水平以snoRNA202为内参进行标准化（每组n = 5）。*P <0.05，**P <0.01。所有数据均表示为均值±标准误。该图改编自doi: 10.1038/mt.2016.13。¹⁴

图 4：miR-298 过表达改善运动功能并减轻体重下降。 行为学评估每周进行一次（w），时间范围为第 5 周至第 40 周。小鼠的体重（左）和悬线实验（右）表现（每组 n = 15）。所有数据均以均值 ± 标准误表示。该图改编自 doi: 10.1038/mt.2016.13。¹⁴

讨论

在此，我们展示了一种高效且易于操作的方法，通过尾静脉注射利用rAAV9作为病毒载体，筛选并递送miRNA，以靶向小鼠的骨骼肌和运动神经元。¹⁴ 与其他RNAi策略相比，miRNA的毒性和免疫原性较低。¹⁸ 此外，它们的小尺寸使其非常适合病毒载体有限的包装容量。² 计算算法和预测工具可用于鉴定潜在的miRNA-mRNA靶点。鉴定后，必须验证miRNA对靶基因表达的影响。一种常用方法是过表达特定miRNA 体外 并使用Western印迹法检测目标蛋白的表达水平。^14,19

已有多种研究采用病毒性和非病毒性策略来递送miRNA。¹³ 本文中我们使用腺相关病毒（AAV）作为基因递送工具。与其他病毒载体相比，AAV具有较低的免疫原性，能够实现长期的基因转移，并且对分裂和非分裂细胞均具有广泛的嗜性。¹⁸ 这种递送方法还可避免因化学修饰可能影响RNA分子功能性和特异性的问题。AAV存在多种血清型，主要由衣壳蛋白的组成决定。不同血清型在嗜性方面存在差异，可转导不同类型的细胞。在选择靶组织时，必须选用合适的血清型。我们选择了rAAV9，因其在外周给药后对中枢神经系统和骨骼肌具有较高的转导效率。^19,20 与成年动物相比，该方法在新生动物中表现出更高的转导效率，这可能归因于细胞外基质成分、神经元与胶质细胞比例以及血脑屏障成熟度的差异。^21,22

本方案中的一个重要步骤是表达载体的设计。与双顺反子载体相比，双启动子载体能够实现反向对称排列，从而实现miRNA和EGFP的高水平表达；而双顺反子载体由于第二个基因距离启动子较远，其表达水平通常低于第一个基因。因此，双启动子载体可通过免疫荧光法实现miRNA在小鼠组织中的定位。

静脉注射 AAV9 在靶组织、骨骼肌和运动神经元中实现了高效且均匀的转导。这种给药途径可使给药剂量进入体循环并穿过血脑屏障，对于靶向中枢神经系统的治疗尤为重要。此外，这是一种非侵入性的中枢神经系统递送方法。在出生后5周龄进行一次外周注射，2至4周后脊髓和肌肉中的 miR-298 表达水平升高。当使用单链基因组 AAV 载体时， 从头合成 第二条DNA链的合成可能导致转导延迟。²³

在单次给药后20周，经处理小鼠体内人源miR-298水平无法检测到，表明对于慢性疾病，可能需要多次注射才能获得治疗效果。然而，当需要终身重复给药时，miRNA随时间推移的降解可能成为限制因素。此外，机体对AAV载体产生的适应性免疫反应可能构成基因递送成功的另一障碍。²⁴ 因此，开发在免疫学上呈惰性的AAV载体，对于实现该递送系统的重复给药和长期疗效至关重要。²⁵

将miRNA用作治疗策略的一个局限性在于其脱靶效应的风险。miRNA可能通过不完全互补的碱基配对与其他基因转录本发生相互作用，从而带来该方法的安全性隐患。在将这一策略转化为安全有效的疗法之前，优化RNAi序列的设计（包括使用非经典miRNA如mirtron，后者可绕过微加工复合物）以及开展充分的长期安全性和耐受性研究至关重要。^26,27,28

本文所述方法最初是为miRNA过表达而开发的，但也可利用antagomir进行miRNA抑制治疗。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAzol 裂解试剂	Qiagen	79306	RNA提取前对脂肪组织和标准组织的裂解
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA 与总 RNA 的纯化
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒	赛默飞世尔科技	4366596	一种高度特异性的试剂盒，仅可定量成熟miRNA
snoRNA202 引物	赛默飞世尔科技	1232	小鼠中 Taqman miRNA 内参检测
miR-298 引物	赛默飞世尔科技	2190	小鼠中 Taqman miRNA-298 检测
抗GFP抗体	abcam	ab290	兔多克隆抗体抗 GFP - 染色质免疫沉淀级
红色印泥垫	Dovecraft 基础系列
蓝色印台	Dovecraft 基础系列
AAV9-GFP 载体	SignaGen Laboratories	SL100840	大规模 AAV 质粒构建、包装与纯化
mmu-miR-298-5p	赛默飞世尔科技	MC12525	mirVana miRNA 模拟物
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP	Vector Biosystems Inc