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方法文章

通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力

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⸱

DOI：

10.3791/55736

⸱

2017年6月3日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular and System Medicine, National Health Research Institutes

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。

摘要

细胞可以通过外泌体进行通讯，外泌体是直径约100 nm的细胞外囊泡（EVs），含有蛋白质、脂质和核酸。非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞（NAMEC）来源的细胞外囊泡可通过差速超速离心法从NAMEC培养基中分离获得。根据其密度，可通过在110,000 × g条件下进行超速离心来纯化EVs。通过连续密度梯度离心可进一步分离超速离心所得的EV制备物，以避免可溶性蛋白的污染。纯化后的EVs可进一步通过纳米颗粒追踪分析进行评估，该方法可测定制备物中囊泡的大小和数量。大小在50至150 nm之间的细胞外囊泡即为外泌体。乳腺上皮细胞可摄取NAMEC来源的EVs/外泌体，该过程可通过流式细胞术和共聚焦显微镜进行检测。某些乳腺干细胞特性（例如，乳腺腺体形成能力）可通过NAMEC来源的EVs/外泌体从具有干细胞特性的NAMECs转移至乳腺上皮细胞。分离得到的原代EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞在移植至小鼠脂肪垫后无法形成乳腺腺体，而EpCAMlo/CD49fhi基底型乳腺上皮细胞在移植后可形成乳腺腺体。EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞摄取NAMEC来源的EVs/外泌体后，可在移植至脂肪垫后生成乳腺腺体。来源于具有干细胞特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体可将乳腺腺体形成能力转移至EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞。

引言

外泌体可通过在细胞间转移膜蛋白、胞质蛋白、脂质和RNA来介导细胞间通讯1外泌体介导的通讯已被证实参与多种生理和病理过程（即， 抗原呈递，耐受性的建立2，以及肿瘤进展3外泌体的内容物通常与其来源细胞相似。因此，外泌体可携带来源细胞的特定特性，并将这些特性传递给摄取它们的细胞4.

外泌体是直径为50至150 nm的双层膜囊泡，具有特定标志物（例如，CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix 和 TSG101）。因此，必须通过多种方法从不同方面对外泌体进行表征。透射电子显微镜可用于观察外泌体等膜囊泡4,5。纳米颗粒追踪分析（NTA）和动态光散射分析（DLS）可用于测定纯化后外泌体的大小和数量4。外泌体的脂质膜成分可通过密度梯度法进行验证。外泌体标志物（如 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix 和 TSG1016,7）可通过蛋白质印迹法（Western blotting）进行检测。

乳腺基底细胞在植入脂肪垫后具有生成乳腺的能力，而腔面细胞则无此能力8,9,10。因此，乳腺基底细胞也被称为乳腺重建单位。利用乳腺基底细胞与腔面细胞的模型，可研究细胞外囊泡（EVs/外泌体）在不同细胞群体之间传递细胞特性的能力。本研究展示了利用来源于乳腺基底上皮细胞的细胞外囊泡（EVs/外泌体），将乳腺成腺能力从乳腺基底上皮细胞传递给乳腺腔面上皮细胞的方法。腔面乳腺上皮细胞在摄取基底细胞分泌的EVs/外泌体后，获得了基底细胞的特性，并能够形成乳腺腺体4。

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方案

所有涉及动物的研究均遵循经机构动物护理委员会批准的方案。

1. 细胞外囊泡/外泌体的分离与验证

  1. 使用新鲜的无血清培养基培养乳腺上皮基底细胞 NAMECs4，培养基成分为：500 mL MCDB 170（pH 7.4）+ 500 mL 含碳酸氢钠（0.2438%）的 DMEM/F12；EGF（5 ng/mL）；氢化可的松（0.5 µg/mL）；胰岛素（5 µg/mL）；牛垂体提取物（BPE；35 µg/mL）；以及 GW627368X（1 µg/mL），置于 15 cm 培养皿中。
  2. 用血细胞计数板计数细胞后，在第 0 天将 1.2 × 106 个细胞接种于 12 mL 培养基中，每 15 cm 培养皿培养 4 天4。
  3. 培养 4 天后，使用台式离心机在 300 × g 条件下离心培养基 5 分钟。将上清液转移至锥形管中（图 1）。
  4. 在台式离心机中以 2,000 × g 离心上清液 20 分钟。将上清液转移至超速离心管中，弃去沉淀中的死细胞和细胞碎片（图 1）。
  5. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心上清液 30 分钟。将上清液转移至新的超速离心管中（图 1）。
  6. 在 4 °C 条件下以 110,000 × g 离心上清液 60 分钟。弃去上清液，将 EV/外泌体沉淀重悬于 PBS 中（图 1）。
  7. 在 4 °C 条件下以 110,000 × g 再次离心上清液 60 分钟。弃去上清液，将 EV/外泌体沉淀重悬于 PBS 中（图 1）。将从 240–480 mL NAMEC 条件培养基中分离得到的沉淀重悬于 100 µL PBS 中。
  8. 使用 BCA 蛋白定量法测定 EV 悬液的蛋白浓度。确保浓度约为 20–40 µg/100 µL。于 -20 °C 保存以用于后续分析。
  9. 采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定 EV/外泌体的浓度和粒径，方法参照 Gardiner et al.11 的先前描述。将 EV/外泌体（20 µg/100 µL）用 PBS 稀释 10,000 倍后进行 NTA 分析。
    注意：NTA 分析结果反映的是所检测囊泡的数量和大小。
  10. 采用透射电子显微镜（TEM）对 EV/外泌体进行成像，方法参照 Lin et al4 的先前描述。

2. 使用密度梯度纯化外泌体

  1. 将步骤1.7中获得的110,000 g沉淀重悬于40%（w/v）碘克沙醇PBS溶液中（2 mL）。随后依次在超速离心管中叠加30%、20%、10%和5%（w/v）的碘克沙醇PBS溶液（各2 mL），形成密度梯度。
  2. 在4 °C条件下，以200,000 × g离心8小时。
  3. 用移液器从离心管顶部开始，逐层收集每层梯度组分（共10个组分；每份1 mL）。
  4. 通过SDS-PAGE12和Western blot分析各组分中外泌体标志物（例如，CD81、CD9、CD63和Tsg101）的存在情况。取每份组分50 µL上样至含0.1%（w/v）SDS的10%凝胶中，利用凝胶电泳分离各组分中的蛋白质。
  5. 将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜，并在4 °C下，用针对外泌体标志物（例如，CD81、CD9、CD63和Tsg101）及内参蛋白GAPDH的一抗溶液孵育过夜（材料表）。
    注意：该结果可用于确定含有外泌体的组分。

3. 细胞外囊泡/外泌体标记

  1. 将步骤1.7中获得的EVs/外泌体悬浮于10 µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）中，每100 µL含20 µg外泌体蛋白。同时制备一个仅含CFSE和PBS的平行样本，以相同方式处理，作为后续EV/外泌体摄取实验的阴性对照。将混合物在37 °C下孵育30分钟。
  2. 将EVs/外泌体悬浮于50倍体积的PBS中，在4 °C下以110,000 × g离心60分钟。弃去上清液，将EV/外泌体沉淀重新悬浮于PBS中。重复步骤3.2一次。
  3. 将EVs/外泌体以每100 µL含20 µg外泌体蛋白的浓度悬浮于PBS中，然后通过0.22 µm滤膜过滤，再将EVs/外泌体加入细胞中。

4. 细胞外囊泡/外泌体摄取实验

  1. 配制培养基：将500 mL MCDB 170（pH 7.4）与500 mL含碳酸氢钠（0.2438%）的DMEM/F12混合，并加入EGF（5 ng/mL）、氢化可的松（0.5 µg/mL）、胰岛素（5 µg/mL）和BPE（35 µg/mL）4。在EV/外泌体处理前一日，将人乳腺上皮HMLE细胞以每孔1 × 106个细胞接种于6孔板中。向HMLE细胞的培养基中加入2 µg/mL经步骤3.3获得的CFSE荧光标记EV/外泌体，孵育2–6小时。阴性对照组的HMLE细胞则使用步骤3.1中平行制备的样品进行处理。
  2. 孵育2至6小时后，在室温下用4 mL PBS洗涤细胞两次。
  3. 用0.25%胰蛋白酶消化细胞10分钟，将细胞重悬于含0.2% FBS的PBS中。使用荧光细胞分析仪通过细胞内的荧光强度测定EV/外泌体的摄取情况4。利用共聚焦显微镜对经EV/外泌体或阴性对照处理的细胞进行成像。
    注意：细胞中的绿色荧光源于EV/外泌体的摄取。显微镜参数设置详见图6的图注。

5. 小鼠原代乳腺上皮细胞的分离

  1. 通过向10 cm培养皿中加入12 mL 0.1%明胶溶液制备明胶包被培养皿。将培养皿置于37 °C培养箱中孵育30分钟。吸除明胶溶液，并将培养皿盖打开，置于超净工作台中干燥4小时，直至明胶涂层完全干燥。
  2. 使用剪刀分离12周龄未交配C57BL/6雌性小鼠的第2、3、4和5对乳腺组织（图2），并用剃刀将乳腺组织切成约2 mm2的小块。
  3. 将来自10只小鼠的乳腺组织混合物加入含0.2% IV型胶原酶、0.2%胰蛋白酶、5%胎牛血清（FBS）、5 µg/mL庆大霉素及1×青霉素-链霉素的50 mL DMEM/F12培养基中，在37 °C、120 rpm振荡条件下消化60分钟。
  4. 以350 × g离心10分钟，沉淀上皮类器官。
  5. 将上皮类器官重悬于4 mL含0.1 mg/mL DNase I的DMEM/F12培养基中，室温孵育5分钟，随后加入6 mL DMEM/F12，终体积为10 mL。
  6. 室温下以400 × g离心10分钟，弃去上清液。
  7. 将沉淀重悬于10 mL DMEM/F12培养基中，开始离心，当转速达到400 × g时立即踩刹车。弃去上清液。
    注意：踩刹车可使上皮类器官快速沉淀，而作为单细胞的成纤维细胞仍保留在上清液中。
  8. 重复步骤5.6和5.7共5–7次。每次离心后，取少量悬液滴加至血细胞计数板，在显微镜下观察类器官混合物中成纤维细胞的去除情况（图3）。
  9. 将类器官接种至步骤5.1中制备的明胶包被培养皿中，使用含1× ITS、5% FBS、50 µg/mL庆大霉素、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）及1×青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基培养48小时。
  10. 48小时后，更换为不含FBS的新鲜培养基（含1× ITS、50 µg/mL庆大霉素、10 ng/mL EGF及1×青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基），以去除培养体系中的漂浮细胞。
  11. 确认在3天内，乳腺上皮细胞从贴壁的上皮类器官中迁移并形成单层细胞。

6. 小鼠原代基底/管腔乳腺上皮细胞的分离

  1. 培养3天后，使用含有蛋白酶和胶原酶活性的天然酶混合物处理小鼠原代乳腺细胞20分钟，以解离细胞。用含5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中和酶活性。
  2. 将细胞悬液在室温下以450 × g离心10分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 mg/mL的dispase溶液中，孵育20分钟。用含5% FBS的PBS中和酶活性。
  3. 将悬液在室温下以450 × g离心10分钟，弃去上清液。
  4. 将细胞重悬于含0.2% FBS的100 µL PBS中，调整细胞浓度至107个细胞/mL，并在冰上避光孵育1小时，同时加入稀释后的抗CD49f和抗EpCAM抗体。
  5. 用PBS洗涤细胞，然后在冰上避光孵育30分钟，加入荧光标记的二抗。
  6. 洗涤细胞后，将其重悬于含0.2% FBS的PBS中。
  7. 利用流式细胞分选仪分选EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞4。

7. 细胞外囊泡/外泌体处理

  1. 将步骤 6.7 中分选得到的 EpCAMhi/CD49flo 乳腺管腔上皮细胞接种于明胶包被的 6 孔板中（每孔 2 × 105 个细胞），然后用 PBS 或步骤 1.7 中获得的 2 µg/mL NAMEC 来源的 EVs/外泌体进行处理。
  2. 为确保 EVs/外泌体在长期培养中的生物学效应，每隔两天更换一次含有 PBS 或 2 µg/mL NAMEC 来源 EVs/外泌体的新鲜培养基。在 10 天处理期间，不要对小鼠原代管腔细胞进行传代。

8. 乳腺上皮细胞的脂肪垫注射

  1. 使用2-3%异氟烷吸入麻醉一只3周龄雌性C57BL/6小鼠。
  2. 将麻醉后的小鼠仰卧放置。用剃刀/脱毛膏去除腹部中线处的毛发，并用70%酒精和聚维酮碘交替擦拭三次，清洁手术区域。
  3. 用剪刀沿腹侧胸腹股沟区域做一条1.5 cm的纵向切口，然后交替暴露右侧和左侧第4th 乳腺脂肪垫
  4. 用剪刀去除脂肪垫中的腺体实质，清理每个脂肪垫。找到脂肪垫中的淋巴结，然后切除淋巴结下方的全部腺体实质。
    注意：应保留三分之二的脂肪垫。
  5. 使用天然酶混合物解离步骤 7.2 获得的细胞（参见 材料表）进行10分钟的蛋白水解和胶原水解酶消化。用含5% FBS的PBS中和酶活性。
  6. 在室温下以 450 × g 离心悬浮液 10 分钟，弃去上清液。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 15 µL 含有所需细胞剂量（104-102 细胞/垫
  7. 使用连接27G针头的100 µL玻璃注射器，将15 µL乳腺上皮细胞悬液注射至脂肪垫中。
  8. 对另一侧的脂肪垫重复步骤 8.4–8.7。
  9. 使用伤口夹闭合皮肤。

9. 乳腺全组织制片

  1. 用 CO 处死小鼠2 另于细胞注射后8周实施颈椎脱位处死（步骤8.7）。
  2. 使用剪刀从胸区至腹股沟区沿皮肤层做一纵向切口，随后暴露右侧和左侧第4th 乳腺脂肪垫。移除第4个th 乳腺图2).
  3. 将脂肪垫铺展在玻璃显微镜载片上，于室温下用Kahle固定液（4%甲醛，30%乙醇和2%冰醋酸）固定过夜。
    注意：Kahle固定液具有刺激性，应在化学通风橱中进行此步骤。
  4. 将脂肪垫在250 mL 70% EtOH中洗涤15分钟，随后在250 mL dH₂O中洗涤2O，5 分钟。用胭脂红明矾染色液（1 g 胭脂红和 2.5 g 硫酸铝钾溶于 500 mL 去离子水）对脂肪垫进行染色。2在室温下过夜。
  5. 用250 mL 70% EtOH洗涤脂肪垫15分钟，再用250 mL 95% EtOH洗涤15分钟，最后用250 mL 100% EtOH洗涤15分钟。
  6. 用二甲苯清洗脂肪垫数天，当脂肪垫变得透明时，停止二甲苯孵育。
    注意：二甲苯具有刺激性。请在化学通风橱中进行此步骤。
  7. 使用封片剂封片，并利用数字切片扫描仪以2,400 dpi分辨率采集脂肪垫的图像。

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结果

由于已有研究表明阻断PGE2/EP4 信号转导触发乳腺基底样干细胞释放细胞外囊泡/外泌体4本研究介绍了一种从乳腺上皮基底细胞（NAMEC）培养物中分离诱导型细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法。由于NAMEC在无血清培养基中培养，因此不存在来源于血清的预先存在的EVs/外泌体13对于在含血清培养基中培养的细胞，收集细胞外囊泡/外泌体之前，必须在使用该培养基培养来源细胞前，通过110,000 × g超速离心去除培养基中预先存在的外泌体5通过差速超速离心法，可从诱导4天的NAMEC条件培养基的110,000 × g沉淀中分离出EVs/外泌体，如图所示。 图1110,000 × g 沉淀中分离出的囊泡数量和大小可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行测定。通过差速超速离心法分离得到的 110,000 × g 沉淀组分主要包含约 100 nm...

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讨论

外泌体通常携带其来源细胞的特征，且其释放量可受刺激因素诱导4。可通过收集细胞培养基，并进行差速超速离心，以获取细胞外囊泡（EV）/外泌体（图1）。目前对于分离EV/外泌体的理想方法尚无统一共识。本研究中所采用的最佳方法取决于后续应用14。超速离心法是一种相对快速的EV/外泌体分离方法，可保持EV/外泌体的生物学活性。然而，通过超速离心法获得的囊泡通常为多种EV的混合物，其中包含通过内体途径产生的外泌体和/或通过细胞膜出芽方式产生的囊泡。

通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对囊泡大小进行分析（图4A），发现在差速超速离心中于110,000 × g 条件下纯化的囊泡主要大小为50–150 nm，符合外泌体的尺寸特征。NTA结果表明，来源于NAMEC的外泌体可在差速超速离心过程中于110,000 × g 条件下从培养基中分离获得。然而，本文所介绍的NTA和透射电子显微镜（TEM）...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了国家卫生研究院（05A1-CSPP16-014，H.J.L.）和科学技术部（MOST 103-2320-B-400-015-MY3，H.J.L.）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K 超速离心机Beckman393253
SW28 Ti 转子Beckman342204
SW41 转子Beckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10用于纳米颗粒追踪分析（NTA）
Optiprep Sigma-AldrichD1556水中 60% (w/v) 碘克沙醇溶液（无菌）
CD81 抗体GeneTexGTX101766在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 
CD9 抗体GeneTexGTX100912在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 
CD63 抗体AbcamAb59479在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 
TSG101 抗体GeneTexGTX118736在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 
GAPDHGeneTexGTX100118在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:6,000 稀释，4 °C 过夜孵育 
CFSE（羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯）ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciences荧光细胞分析仪
IV 型胶原酶 Thermo17104019
胰蛋白酶Thermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146重组人胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸钠的混合物
Accutaseebioscience00-4555-56具有蛋白酶和胶原酶活性的天然酶混合物
分散酶 STEMCELL79135 mg/mL = 5 U/mL
抗 CD49f 抗体Biolegend3136111:50
抗 EpCAM 抗体Biolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciences细胞分选仪
胭脂红明矾Sigma-AldrichC1022
人乳腺上皮细胞（HMLE 细胞，NAMECs）由 Robert Weinberg 博士惠赠
PermountThermo Fisher Scientific SP15-500
碳酸氢钠Zymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
氢化可的松Sigma-AldrichSI-H0888
胰岛素 Sigma-AldrichSI-I9278
BPE（牛垂体提取物）Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15 cm 培养皿Falcon 353025
台式离心机Eppendorf Centrifuge 3415R
超速离心管Beckman344058
PBS（磷酸盐缓冲液） Corning46-013-CM
BCA 蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific 23228
透射电子显微镜HitachiHT7700
明胶 STEMCELL7903
10 cm 培养皿Falcon 353003
6 孔培养板Corning3516
雌性 C57BL/6 小鼠NLAC（国家实验动物中心）
FBS（胎牛血清）BioWest S01520
庆大霉素Thermo Fisher Scientific 15710072
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Corning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
异氟烷 HalocarbonNPC12164-002-25
甲醛MACRONH121-08
乙醇（EtOH）J.T. Baker800605
冰醋酸Panreac131008.1611
硫酸铝钾Sigma-Aldrich12625
二甲苯 Leica3803665
0.22 μm 滤膜Merck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP 伤口夹，9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP 伤口夹施夹器BD Biosciences427630
CellMask™ 深红色染料Thermo Fisher Scientific C10046质膜染色剂

参考文献

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