本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。
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通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
细胞可以通过外泌体进行通讯，外泌体是直径约100 nm的细胞外囊泡（EVs），含有蛋白质、脂质和核酸。非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞（NAMEC）来源的细胞外囊泡可通过差速超速离心法从NAMEC培养基中分离获得。根据其密度，可通过在110,000 × g条件下进行超速离心来纯化EVs。通过连续密度梯度离心可进一步分离超速离心所得的EV制备物，以避免可溶性蛋白的污染。纯化后的EVs可进一步通过纳米颗粒追踪分析进行评估，该方法可测定制备物中囊泡的大小和数量。大小在50至150 nm之间的细胞外囊泡即为外泌体。乳腺上皮细胞可摄取NAMEC来源的EVs/外泌体，该过程可通过流式细胞术和共聚焦显微镜进行检测。某些乳腺干细胞特性（例如，乳腺腺体形成能力）可通过NAMEC来源的EVs/外泌体从具有干细胞特性的NAMECs转移至乳腺上皮细胞。分离得到的原代EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞在移植至小鼠脂肪垫后无法形成乳腺腺体，而EpCAMlo/CD49fhi基底型乳腺上皮细胞在移植后可形成乳腺腺体。EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞摄取NAMEC来源的EVs/外泌体后，可在移植至脂肪垫后生成乳腺腺体。来源于具有干细胞特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体可将乳腺腺体形成能力转移至EpCAMhi/CD49flo腔面型乳腺上皮细胞。
引言
外泌体可通过在细胞间转移膜蛋白、胞质蛋白、脂质和RNA来介导细胞间通讯1外泌体介导的通讯已被证实参与多种生理和病理过程（即， 抗原呈递，耐受性的建立2，以及肿瘤进展3外泌体的内容物通常与其来源细胞相似。因此，外泌体可携带来源细胞的特定特性，并将这些特性传递给摄取它们的细胞4.
外泌体是直径为50至150 nm的双层膜囊泡，具有特定标志物（例如，CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix 和 TSG101）。因此，必须通过多种方法从不同方面对外泌体进行表征。透射电子显微镜可用于观察外泌体等膜囊泡4,5。纳米颗粒追踪分析（NTA）和动态光散射分析（DLS）可用于测定纯化后外泌体的大小和数量4。外泌体的脂质膜成分可通过密度梯度法进行验证。外泌体标志物（如 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix 和 TSG1016,7）可通过蛋白质印迹法（Western blott....
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方案
所有涉及动物的研究均遵循经机构动物护理委员会批准的方案。
1. 细胞外囊泡/外泌体的分离与验证
- 使用新鲜的无血清培养基培养乳腺上皮基底细胞 NAMECs4，培养基成分为：500 mL MCDB 170（pH 7.4）+ 500 mL 含碳酸氢钠（0.2438%）的 DMEM/F12；EGF（5 ng/mL）；氢化可的松（0.5 µg/mL）；胰岛素（5 µg/mL）；牛垂体提取物（BPE；35 µg/mL）；以及 GW627368X（1 µg/mL），置于 15 cm 培养皿中。
- 用血细胞计数板计数细胞后，在第 0 天将 1.2 × 106 个细胞接种于 12 mL 培养基中，每 15 cm 培养皿培养 4 天4。
- 培养 4 天后，使用台式离心机在 300 × g 条件下离心培养基 5 分钟。将上清液转移至锥形管中（图 1）。
- 在台式离心机中以 2,000 × g 离心上清液 20 分钟。将上清液转移至超速离心管中，弃去沉淀中的死细胞和细胞碎片（图 1）。
- 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心上清液 30 分钟。将上清液转移至....
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结果
由于已有研究表明阻断PGE2/EP4 信号转导触发乳腺基底样干细胞释放细胞外囊泡/外泌体4本研究介绍了一种从乳腺上皮基底细胞（NAMEC）培养物中分离诱导型细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法。由于NAMEC在无血清培养基中培养，因此不存在来源于血清的预先存在的EVs/外泌体13对于在含血清培养基中培养的细胞，收集细胞外囊泡/外泌体之前，必须在使用该培养基培养来源细胞前，通过110,000 × g超速离心去除培养基中预先存在的外泌体5通过差速超速离心法，可从诱导4天的NAMEC条件培养基的110,000 × g沉淀中分离出EVs/外泌体，如图所示。 图1110,000 × g 沉淀中分离出的囊泡数量和大小可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行测定。通过差速超速离心法分离得到的 110,000 × g 沉淀组分主要包含约 100 nm.......
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讨论
外泌体通常携带其来源细胞的特征，且其释放量可受刺激因素诱导4。可通过收集细胞培养基，并进行差速超速离心，以获取细胞外囊泡（EV）/外泌体（图1）。目前对于分离EV/外泌体的理想方法尚无统一共识。本研究中所采用的最佳方法取决于后续应用14。超速离心法是一种相对快速的EV/外泌体分离方法，可保持EV/外泌体的生物学活性。然而，通过超速离心法获得的囊泡通常为多种EV的混合物，其中包含通过内体途径产生的外泌体和/或通过细胞膜出芽方式产生的囊泡。
通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对囊泡大小进行分析（图4A），发现在差速超速离心中于110,000 × g 条件下纯化的囊泡主要大小为50–150 nm，符合外泌体的尺寸特征。NTA结果表明，来源于NAMEC的外泌体可在差速超速离心过程中于110,000 × g 条件下从培养基中分离获得。然而，本文所介绍的NTA和透射电子显微镜（TEM）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了国家卫生研究院（05A1-CSPP16-014，H.J.L.）和科学技术部（MOST 103-2320-B-400-015-MY3，H.J.L.）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K 超速离心机 | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti 转子 | Beckman | 342204 | |
| SW41 转子 | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | 用于纳米颗粒追踪分析（NTA） |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 水中 60% (w/v) 碘克沙醇溶液（无菌） |
| CD81 抗体 | GeneTex | GTX101766 | 在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| CD9 抗体 | GeneTex | GTX100912 | 在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| CD63 抗体 | Abcam | Ab59479 | 在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| TSG101 抗体 | GeneTex | GTX118736 | 在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:1,000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 在含 5% w/v 脱脂奶粉、1× TBS、0.1% Tween 20 的溶液中按 1:6,000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| CFSE（羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯） | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | 荧光细胞分析仪 | |
| IV 型胶原酶 | Thermo | 17104019 | |
| 胰蛋白酶 | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | 重组人胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸钠的混合物 |
| Accutase | ebioscience | 00-4555-56 | 具有蛋白酶和胶原酶活性的天然酶混合物 |
| 分散酶 | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| 抗 CD49f 抗体 | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| 抗 EpCAM 抗体 | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | 细胞分选仪 | |
| 胭脂红明矾 | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| 人乳腺上皮细胞（HMLE 细胞，NAMECs） | 由 Robert Weinberg 博士惠赠 | ||
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 碳酸氢钠 | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE（牛垂体提取物） | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm 培养皿 | Falcon | 353025 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | Centrifuge 3415R | |
| 超速离心管 | Beckman | 344058 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Corning | 46-013-CM | |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| 透射电子显微镜 | Hitachi | HT7700 | |
| 明胶 | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm 培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 6 孔培养板 | Corning | 3516 | |
| 雌性 C57BL/6 小鼠 | NLAC（国家实验动物中心） | ||
| FBS（胎牛血清） | BioWest | S01520 | |
| 庆大霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| 异氟烷 | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| 甲醛 | MACRON | H121-08 | |
| 乙醇（EtOH） | J.T. Baker | 800605 | |
| 冰醋酸 | Panreac | 131008.1611 | |
| 硫酸铝钾 | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| 二甲苯 | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm 滤膜 | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP 伤口夹，9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP 伤口夹施夹器 | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ 深红色染料 | Thermo Fisher Scientific | C10046 | 质膜染色剂 |
参考文献
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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