利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

摘要

本方案描述了利用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx I-V）及其超复合物的方法，以揭示其组装和结构信息。该天然凝胶可进一步用于免疫印迹、凝胶内活性检测以及通过电洗脱进行纯化，从而对各个复合物进行更深入的表征。

摘要

线粒体电子传递链（ETC）将多种燃料分解所产生的能量转化为细胞的生物能量货币ATP。ETC由5个巨大的蛋白质复合物组成，这些复合物还可进一步组装成称为呼吸体（C-I、C-III和C-IV）和合成体（C-V）的超复合物，从而提高电子传递和ATP生成的效率。五十多年来，已有多种方法被用于测量ETC功能，但这些方案无法提供有关单个复合物及超复合物组装状态的信息。本方案描述了天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）技术，该方法在二十多年前被改良用于研究ETC复合物的结构。天然电泳可将ETC复合物以其有活性的形式分离开来，随后可通过免疫印迹、凝胶内活性检测（IGA）以及电洗脱纯化等方法对这些复合物进行分析。通过将天然PAGE结果与其他线粒体检测方法的结果相结合，可以获得关于ETC活性、其动态组装与解聚过程，以及这些过程如何调控线粒体结构与功能的更全面的认识。本文还将讨论这些技术的局限性。总之，如下所述的天然PAGE结合免疫印迹、IGA和电洗脱技术，是研究线粒体ETC超复合物功能特性与组成成分的一种强有力的方法。

引言

以ATP形式存在的线粒体能量不仅对细胞存活至关重要，也参与调控细胞死亡。通过氧化磷酸化生成ATP需要功能完整的电子传递链（ETC；复合物I至IV）和线粒体ATP合酶（Cx-V）。近期研究表明，这些大型蛋白质复合物会组装成称为呼吸体和合成体的超复合物。^1,2分析这些大型复合物和超复合物的组装、动态变化及活性调控具有挑战性。虽然使用氧电极测量耗氧量以及利用分光光度计进行酶活性检测可提供有关电子传递链（ETC）复合物活性的有价值信息，但这些方法无法提供参与的蛋白质复合物或超复合物的存在、大小及亚基组成的相关信息。然而，蓝色及透明天然电泳（分别为BN和CN PAGE）的发展³ 已创建一种强大工具，用于揭示这些重要呼吸复合物在生理和病理条件下，其复杂组成与组装/去组装过程，以及超分子结构动态调控方面的关键信息⁴.

这些复合物组装成更高阶的超复合物，似乎能够调控线粒体的结构与功能⁵。例如，呼吸体（respirasome）的组装可提高电子传递效率以及线粒体内膜上质子驱动力的生成⁵。此外，合成体（synthasome）的组装不仅可提高ATP的生成效率以及能量当量向细胞质的转移效率

方案

所有实验均使用C57BL/6N小鼠（野生型）的心脏进行。小鼠在颈椎脱位前先用CO₂进行麻醉，所有操作均严格遵循罗切斯特大学实验动物医学部的规定，并符合州法律、联邦法规及美国国立卫生研究院（NIH）政策的要求。该实验方案已获得罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会（动物资源大学委员会）的批准。

1. CN-PAGE 和 BN-PAGE

注意：用于 BN-PAGE 和 CN-PAGE 的所有设备必须无去垢剂残留。为确保这一点，需先用 0.1 M 盐酸清洗所有设备，再用去离子 H₂O 充分冲洗。

1. 准备
   1. 配制阳极缓冲液，含25 mM咪唑，pH 7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
   2. 配制用于CN或BN PAGE的阴极缓冲液。
      1. 对于CN PAGE，使用7.5 mM咪唑和50 mM三羟甲基氨基丙烷乙酸（tricine）；每升缓冲液中加入0.5 g脱氧胆酸钠和0.2 g月桂基麦芽糖苷。调节pH至7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
      2. 对于BN PAGE，使用7.5 mM咪唑和50 mM三羟甲基氨基丙烷乙酸（tricine），调节pH至7.0（4 °C条件下）。4 °C保存。
      3. 对于浅蓝色BN阴极缓冲液，使用7.5 ....

结果

为了观察线粒体超复合物，实验使用了从小鼠中新鲜分离的线粒体^17,18。线粒体超复合物对反复冻融循环敏感，容易发生解体，尽管某些研究人员可能可以接受这种影响。如果因储存需要必须进行冷冻，则为确保最佳效果，样品冻融次数不应超过一次。

为了通过 BN-PAGE 可视化线粒体电子传递链（ETC）复合物，将分离自心脏线粒体的 100 µg 蛋白质上样至 4–10% 的凝胶中（图 1A）。电泳过程中，上样缓冲液和阴极缓冲液中的考马斯亮蓝足以标记蛋白质复合物。超级复合物在数字增强对比度后可见（未显示）。对于 CN-PAGE，将两份分离自线粒体的 20 µg 蛋白质样品上样至 3–8% 的 CN 凝胶中并进行分离（图 1B）。CN-P.......

讨论

功能完整的电子传递链（ETC）是线粒体生成ATP所必需的。电子传递链的各复合物能够形成两种类型的超复合物：呼吸体（Cx-I、-III 和 -IV）¹ 和合成体（Cx-V）²。每个复合物的正确组装对于维持电子传递链的完整性至关重要，而电子传递链以超复合物形式进行组织被认为可提高整体电子传递效率^5,22。目前对这些超复合物的组装与解离机制尚不完全清楚，但本文所介绍的实验方案可能有助于更深入地理解这些过程。

研究电子传递链（ETC）组装的主要挑战在于这些蛋白质复合物的尺寸。例如，线粒体呼吸体可能由复合物I（Cx-I，约880 kDa）以及一个或多个复合物III（Cx-III，460 kDa）和复合物IV（Cx-IV，200 kDa，以二聚体形式发挥活性）分子组成，形成分子量约为2,000 kDa的超复合物。此外，复合物V（Cx-V）的分子量约为600 kDa，但已被证明可组装成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Protean II mini-gel chamber	Biorad	1658004	用于灌注和运行微型凝胶电泳的完整套装
Protean XL maxi-gel	Biorad	1653189	用于灌注和运行大型凝胶电泳的完整套装
梯度混合器，Hoefer SG15	VWR	95044-704	用于灌注微型凝胶梯度
梯度混合器，大型凝胶	VWR	GM-100	用于灌注大型凝胶梯度
转膜试剂盒	Biorad	1703930	用于将蛋白质湿法转移至膜上的完整套装
电洗脱仪型号 422	Biorad	1652976	从天然或 SDS-PAGE 凝胶中电洗脱蛋白质
玻璃板	Biorad	1653308	短板
玻璃板	Biorad	1653312	间隔板
玻璃板	Biorad	1651823	内板
玻璃板	Biorad	1651824	外板
电源	Biorad	1645070	适用于天然电泳的电源
ECL-Western	Thermo Scientific	32209	化学发光底物
SuperSignal-West Dura	Thermo Scientific	34075	增强型化学发光底物
胶片/自显影胶片	GE Health care	28906845	用于记录 Western 印迹结果
胶片处理器 CP1000	Agfa	NC0872640
Canon Power Shot 640	Canon	NA	用于拍摄凝胶、膜和印迹图像
Canon Power Shot 640 相机遮光罩	Canon		为在透射光台上拍照提供相机遮光保护
丙烯酰胺/双丙烯酰胺	Biorad	1610148	40% 预混溶液
甘氨酸	Sigma	G7403
SDS（十二烷基硫酸钠）	Invitrogen	15525-017
Tris 碱	Sigma	T1503	缓冲液
Tricine	Sigma	T0377
脱氧胆酸钠	Sigma	D66750	去垢剂
EDTA	Sigma	E5134
蔗糖	Sigma	S9378
MOPS	Sigma	M1254	缓冲液
咪唑	Sigma	I15513	缓冲液
月桂基麦芽糖苷	Sigma	D4641	去垢剂
Coomassie G250	Biorad	161-0406
氨基己酸	Sigma	O7260
Native  分子量标准品	GE Health care	17-0445-01	用于天然电泳的高分子量校准试剂盒
名称	公司	货号	备注
NADH	Sigma	N4505
硝基蓝四氮唑	Sigma	N6639
Tris HCl	Sigma	T3253
ATP	Sigma	A2383
名称	公司	货号	备注
硝酸铅（Pb(NO3)2）	Sigma	228621
寡霉素	Sigma	O4876
名称	公司	货号	备注
丽春红 S	Sigma	P3504
抗-ATP5A	Abcam	ab14748	ATP合酶亚基ATP5A抗体
抗-NDUFB6	Abcam	ab110244	复合物I亚基NDUFB6抗体
抗-VDAC	Calbiochem	529534	VDAC抗体
ECL HRP标记抗体	GE Health Care	NA931V	ATP5A、NDUFB6和VDAC的二抗
封闭试剂	Biorad	170-6404
BSA
氯化钠	Sigma	S9888
氯化钾	Sigma	P9541
EGTA	Sigma	E3889
名称	公司	货号	备注
银染试剂盒	Invitrogen	LC6070