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方法文章

利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

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DOI：

10.3791/55738

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2017年6月1日

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

本文内容

摘要

本方案描述了利用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx I-V）及其超复合物的方法，以揭示其组装和结构信息。该天然凝胶可进一步用于免疫印迹、凝胶内活性检测以及通过电洗脱进行纯化，从而对各个复合物进行更深入的表征。

摘要

线粒体电子传递链（ETC）将多种燃料分解所产生的能量转化为细胞的生物能量货币ATP。ETC由5个巨大的蛋白质复合物组成，这些复合物还可进一步组装成称为呼吸体（C-I、C-III和C-IV）和合成体（C-V）的超复合物，从而提高电子传递和ATP生成的效率。五十多年来，已有多种方法被用于测量ETC功能，但这些方案无法提供有关单个复合物及超复合物组装状态的信息。本方案描述了天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）技术，该方法在二十多年前被改良用于研究ETC复合物的结构。天然电泳可将ETC复合物以其有活性的形式分离开来，随后可通过免疫印迹、凝胶内活性检测（IGA）以及电洗脱纯化等方法对这些复合物进行分析。通过将天然PAGE结果与其他线粒体检测方法的结果相结合，可以获得关于ETC活性、其动态组装与解聚过程，以及这些过程如何调控线粒体结构与功能的更全面的认识。本文还将讨论这些技术的局限性。总之，如下所述的天然PAGE结合免疫印迹、IGA和电洗脱技术，是研究线粒体ETC超复合物功能特性与组成成分的一种强有力的方法。

引言

以ATP形式存在的线粒体能量不仅对细胞存活至关重要，也参与调控细胞死亡。通过氧化磷酸化生成ATP需要功能完整的电子传递链（ETC；复合物I至IV）和线粒体ATP合酶（Cx-V）。近期研究表明，这些大型蛋白质复合物会组装成称为呼吸体和合成体的超复合物。1,2分析这些大型复合物和超复合物的组装、动态变化及活性调控具有挑战性。虽然使用氧电极测量耗氧量以及利用分光光度计进行酶活性检测可提供有关电子传递链（ETC）复合物活性的有价值信息，但这些方法无法提供参与的蛋白质复合物或超复合物的存在、大小及亚基组成的相关信息。然而，蓝色及透明天然电泳（分别为BN和CN PAGE）的发展3 已创建一种强大工具，用于揭示这些重要呼吸复合物在生理和病理条件下，其复杂组成与组装/去组装过程，以及超分子结构动态调控方面的关键信息4.

这些复合物组装成更高阶的超复合物，似乎能够调控线粒体的结构与功能5。例如，呼吸体（respirasome）的组装可提高电子传递效率以及线粒体内膜上质子驱动力的生成5。此外，合成体（synthasome）的组装不仅可提高ATP的生成效率以及能量当量向细胞质的转移效率2，还能将线粒体内膜塑造成管状嵴结构6,7。对小鼠胚胎心脏发育过程中超复合物组装的研究表明，心脏中含复合物I（Cx-I）的超复合物的生成始于胚胎第13.5天左右8。其他研究显示，由于衰老或缺血/再灌注损伤，心脏中含复合物I的超复合物含量会下降9,10，或可能在神经退行性疾病的发展过程中发挥作用11。

本方案描述了可用于研究电子传递链（ETC）复合物及超复合物组装与活性的天然凝胶PAGE方法。通过在CN或BN聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质复合物，可评估线粒体超复合物的近似分子量。CN PAGE还可直接在凝胶中显示所有线粒体复合物的酶活性（即凝胶内活性检测；IGA）12。本研究通过IGA显示呼吸体（respirasomes）的活性，突出Cx-I氧化NADH的能力，并通过IGA检测到由Cx-V的ATP水解活性所揭示的合成体（synthasomes）的存在。含有Cx-I和Cx-V的多种复合物及超复合物也可通过将蛋白质转移至硝酸纤维素膜并进行免疫印迹加以验证。该方法的优势在于，BN或CN PAGE通常根据蛋白质复合物的生理大小和组成进行分离，而转移至膜上后仍可保持条带的原有模式。对BN或CN PAGE中的蛋白质复合物的分析还可采用二维电泳（参见Fiala et al.13 的示例）或蔗糖密度梯度离心14,15。为进一步分析某一特定条带，可将其从BN PAGE中切下，并在天然条件下通过电洗脱纯化该蛋白质复合物中的蛋白质。天然电洗脱可在数小时内完成，相较于蛋白质从凝胶被动扩散至周围缓冲液的方法（如参考文献16所述），可显著缩短处理时间。

总之，这些方法描述了多种可用于进一步表征线粒体膜中高分子量超级复合物的技术途径。

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方案

所有实验均使用C57BL/6N小鼠（野生型）的心脏进行。小鼠在颈椎脱位前先用CO2进行麻醉，所有操作均严格遵循罗切斯特大学实验动物医学部的规定，并符合州法律、联邦法规及美国国立卫生研究院（NIH）政策的要求。该实验方案已获得罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会（动物资源大学委员会）的批准。

1. CN-PAGE 和 BN-PAGE

注意：用于 BN-PAGE 和 CN-PAGE 的所有设备必须无去垢剂残留。为确保这一点，需先用 0.1 M 盐酸清洗所有设备，再用去离子 H2O 充分冲洗。

  1. 准备
    1. 配制阳极缓冲液，含25 mM咪唑，pH 7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
    2. 配制用于CN或BN PAGE的阴极缓冲液。
      1. 对于CN PAGE，使用7.5 mM咪唑和50 mM三羟甲基氨基丙烷乙酸（tricine）；每升缓冲液中加入0.5 g脱氧胆酸钠和0.2 g月桂基麦芽糖苷。调节pH至7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
      2. 对于BN PAGE，使用7.5 mM咪唑和50 mM三羟甲基氨基丙烷乙酸（tricine），调节pH至7.0（4 °C条件下）。4 °C保存。
      3. 对于浅蓝色BN阴极缓冲液，使用7.5 mM咪唑和50 mM三羟甲基氨基丙烷乙酸（tricine）。调节pH至7.0（4 °C条件下），每升缓冲液中加入20 mg考马斯亮蓝（Coomassie）。4 °C保存。
    3. 配制提取缓冲液（EB），含50 mM NaCl、50 mM咪唑、2 mM氨基己酸和1 mM EDTA。调节pH至7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
    4. 配制3×凝胶缓冲液（用于BN和CN凝胶），含75 mM咪唑和1.5 M氨基己酸。调节pH至7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
    5. 配制上样缓冲液（LB）：0.01 g亮蓝G250（Ponceau S）、5 g甘油和5 mL H2O。室温保存。
    6. 通过将50 mg考马斯亮蓝（Coomassie）加入1 mL 500 mM 6-氨基己酸中配制考马斯亮蓝溶液。调节pH至7.0（4 °C条件下），4 °C保存。
    7. 在H2O中配制20 mM和200 mM月桂基麦芽糖苷溶液。分装成200 µL等份，冷冻保存。使用前解冻去垢剂。
3 % 至 8 %（mini）4 % 至 10 %（maxi）
0.5 凝胶（轻）0.5 凝胶（重）0.5 凝胶（轻）0.5 凝胶（重）
AAB（mL）0.421.32.57.7
CN/BN 缓冲液（mL）1.61.68.58.5
H2O（mL）2.71.4146.3
甘油（g）00.4702.5
体积（mL）4.724.772525
APS（µL）27276565
TEMED（µL）441010

表1：制备1块小型或大型PAGE凝胶所需试剂用量。 本表中列出的体积是针对1块小型或1块大型凝胶（厚度为1.5 mm）的用量。丙烯酰胺（AAB）的体积基于40%的储存液。其中“轻”和“重”指AAB的浓度。APS和TEMED是在梯度混合器的每列加入AAB溶液后添加的。

  1. 凝胶的制备与电泳运行
    注意：对于CN胶，使用3-8%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺（AAB）梯度；对于BN胶，使用4-10%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺（AAB）梯度。 表1 总结缓冲液、AAB、H 的用量2O、甘油、过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），用于小型凝胶（85 mm 宽 × 73 mm 高 × 1.5 mm 厚）或大型凝胶（160 mm 宽 × 200 mm 高 × 1.5 mm 厚）。带有 CN 或 BN 凝胶的玻璃板组件可置于含数毫升 1× 凝胶缓冲液的密封袋中，或用浸湿 1× 凝胶缓冲液的纸巾包裹后冷藏保存。凝胶在一周内保持稳定，可用于后续实验。
    1. 倒入凝胶时，将梯度混合器置于较高的搅拌台上，以确保凝胶能够依靠重力流入已准备好的凝胶室。
    2. 用较浓的AAB溶液（浓度较高）填充梯度混合器的流出室，体积为4.77 mL（mini）或25 mL（maxi）。
    3. 轻轻打开重相室与轻相室之间的活塞连接，使一滴溶液流至另一侧。
      注意：此操作可排出连接管和旋塞中的气泡，以防两室之间发生液体流动。若两侧腔室均已注满液体，则无法进行此操作，因为压力平衡会阻碍气泡通过。
    4. 在梯度混合器的另一个室中加入4.72/25 mL（迷你/最大）的轻溶液。
    5. 在装有重溶液的流出室中放入一个搅拌子，开始搅拌。搅拌速度应以不产生气泡为宜。
    6. 向每个槽中快速加入APS和TEMED以启动聚合反应。
    7. 打开梯度混合器两个腔室之间的连接，混合数秒后，再打开流出室以倾倒凝胶。
      注意：重力将使两个腔室中的溶液以相同速率流出，轻溶液与重溶液的混合会逐渐降低丙烯酰胺的密度，从而形成从凝胶底部到顶部密度递减的梯度。请将梯度混合器中的全部内容物用于灌注凝胶。
      1. 最后，小心地将梳子插入凝胶内部的加样孔中，以避免产生气泡和层间混合。
    8. 立即用乙醇清洗梯度混合器以去除所有凝胶，再用水冲洗，然后倒入第二块凝胶。让凝胶聚合（通常迷你凝胶所需时间少于20分钟）。
    9. 将凝胶安装到电极组件夹中，向中心/上层室加入CN或浅蓝色BN阴极缓冲液。等待数分钟检查是否泄漏，然后向外部/下层室加入阳极缓冲液。
      1. 轻轻拔出样品梳，然后使用注射器或移液器用阴极缓冲液冲洗加样孔。
      2. 在4 °C的冷室中或完全用冰包裹的情况下电泳。
        1. 对于CN微型PAGE，先以100 V电泳1小时，然后以200 V继续电泳直至完成，通常还需1-1.5小时。或者，可在30-40 V条件下过夜运行CN微型PAGE。
          注意：此处重点是高分子量蛋白质复合物，因此分子量小于140 kDa的蛋白质复合物会跑出凝胶。若需保留低分子量复合物，可采用较短的电泳运行时间。
        2. 对于BN胶最大PAGE，使用100 V电压，运行凝胶过夜（约18小时）。
          注意：电流将非常低（< 15 mA），因此需要使用能够满足这些条件的电源。此时，凝胶可用于免疫印迹分析（IGA）或免疫印迹（immunoblotting）。在某些情况下，可将凝胶置于玻璃板上，用剃刀片切割出特定的条带或泳道，用于电洗脱。
  2. 样品制备
    注意：必须从线粒体内膜中提取膜结合的线粒体超复合体。为保持线粒体超复合体的完整性，应使用 freshly isolated mitochondria 或仅冻融一次的样品。以下计算/体积适用于迷你胶（厚度为1.5 mm的凝胶中，10孔梳的加样孔可容纳35–40 µL）和大胶（15孔梳的加样孔可容纳200 µL）。此外，保留每份样品的部分等分试样（通常为10 µL），用于在变性SDS凝胶上电泳，以检测电压依赖性阴离子通道（VDAC），作为上样对照。
    1. 加入适量（例如， 在微量离心管中加入10–50 µg蛋白（用于小型凝胶）或50–200 µg蛋白（用于大型凝胶）的分离线粒体或组织匀浆液，于4 °C下以17,000 × g离心10–15分钟。
      注意：此步骤会去除部分可溶性线粒体基质蛋白和/或细胞质蛋白。
    2. 吸弃上清液，并加入所需体积的裂解缓冲液用于上样。在冰上轻轻重悬沉淀。如需要，此时可加入通用蛋白酶抑制剂混合物。
      注意：根据所用设备，迷你胶使用30 µL，大胶使用100 µL，蛋白质与缓冲液体积比不超过2 µg蛋白质比1 µL缓冲液。
    3. 加入去垢剂（例如， 2 µg 月桂基麦芽糖苷/1 µg 蛋白质；更多信息请参见代表性结果与讨论部分。
      注意：通常使用月桂基麦芽糖苷，但也可使用皂苷。
    4. 冰上孵育20分钟。孵育开始时及孵育过程中偶尔轻柔混匀，通过吹打或振荡试管实现。
    5. 在 4 °C 条件下以 17,000 x g 离心 10 分钟，以去除任何膜和组织碎片。
    6. 将上清液转移至新离心管中。对于CN样品，每10 µL样品体积加入1 µL LB；迷你胶样品总体积应约为40 µL，大胶样品总体积应约为130 µL。对于BN样品，加入考马斯亮蓝染料，使染料与去垢剂的质量比为1:4（w/w）。
    7. 将30 µL和120 µL的样品分别加入迷你胶或大胶的加样孔中。每个样品剩余的10 µL用于变性SDS凝胶电泳，以检测VDAC作为上样对照。
    8. 为制备分子量标准蛋白，将1瓶高分子量校准混合物（详见材料表）溶解于60 µL BN/CN凝胶缓冲液中，并加入120 µL H20 和 20 µL 的 LB。每孔上样 15 µL。
    9. 按照步骤1.2.9.2中所述运行凝胶。

2. Cx-I 和 Cx-V 的凝胶内活性检测

注意：实验在室温下进行。对发育中的条带进行拍照、扫描或成像以作记录。（重要）完成免疫印迹分析（IGA）后，蛋白质无法再转移到硝酸纤维素膜上。

  1. Cx-I 检测
    1. 准备。
      1. 配制 5 mM Tris 溶于 H2O 的检测缓冲液，pH 为 7.4；室温保存。
      2. 将 10 mg NADH 溶解于 1 mL 检测缓冲液中。分装为 100 µL 每份，-20 °C 保存备用；避免反复冻融。
      3. 称取 25 mg 四氮唑蓝（Nitroblue tetrazolium）至微量离心管中。
      4. 通过将 5 mL 乙酸稀释于 95 mL H2O 中配制固定液；室温保存。
    2. 进行检测。
      1. 将 10 mL 检测缓冲液与 25 mg 四氮唑蓝（终浓度：2.5 mg/mL）及 100 µL 10 mg/mL NADH（终浓度：0.1 mg/mL）混合。将此混合液加入整块凝胶、某泳道或从 CN 凝胶中切下的目标区域。
        注意：该步骤可在透明塑料或玻璃容器中进行。请注意，此检测不能在 BN PAGE 后进行。
      2. 在轻柔振荡（摇床）条件下，观察蓝色条带的形成，时间超过 > 3 分钟。
      3. 用 10–20 mL 乙酸溶液固定凝胶，或用 pH 7.4 的 5 mM Tris 溶液洗涤以终止反应。拍照记录结果（参见材料表）。
  2. Cx-V 检测
    注意：Cx-V 检测应使用两块相同的 CN 或 BN 凝胶进行，其中一块需加入 5 µg/mL 寡霉素（oligomycin，一种 Cx-V 抑制剂），以证明 Cx-V 非依赖性活性。
    1. 准备。
      1. 配制含 35 mM Tris 和 270 mM 甘氨酸的检测缓冲液；在室温下调节 pH 至 8.3。将缓冲液以 50 mL 每份分装后冷冻保存，但冻融后需重新检查 pH。
      2. 配制 1 M MgSO4 溶于 H2O 的溶液；4 °C 保存至使用。
      3. 称取 27.28 mg Pb(NO3)2 至微量离心管中。
      4. 称取 60 mg ATP 至微量离心管中。
      5. 将 1 mg 寡霉素溶解于 1 mL 乙醇中。-20 °C 保存至使用。
      6. 通过将 50 mL 甲醇与 50 mL H2O 混合配制固定液；室温保存。
    2. 进行检测。
      1. 将一块凝胶、某泳道或从 BN 或 CN 凝胶中切下的目标区域，在 10–20 mL 检测缓冲液中于室温下孵育 2 小时，轻柔振荡（摇床），并可选择性加入 ± 5 µg/mL 寡霉素（乙醇中 1 mg/mL 溶液，50–100 µL）。
      2. 孵育后，弃去原缓冲液，加入 14 mL 新鲜检测缓冲液，并依次加入：190 µL 1 M MgSO4（终浓度 14 mM）、27.28 mg Pb(NO3)2（终浓度 5 mM）、60 mg ATP（终浓度 8 mM），以及必要时加入 75 µL 寡霉素。
      3. 继续在轻柔振荡（摇床）条件下孵育，并观察白色沉淀的出现；经寡霉素处理的凝胶上出现的条带代表非 Cx-V 依赖性活性。
        注意：沉淀的出现可能需要数小时。
      4. 使用含甲醇的固定液（例如，50% 甲醇）固定凝胶，因为酸性溶液会溶解铅沉淀。拍摄结果照片。
        注意：铅沉淀不会干扰凝胶的考马斯亮蓝染色。

3. 蛋白质转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜

  1. 配制含有 25 mM Tris 和 200 mM 甘氨酸的转移缓冲液。将 pH 调至 8.3，并加入 0.0005 g/L SDS 和 200 mL/L 甲醇。室温保存。
    1. 使用剃刀或剪刀将硝酸纤维素膜或 PVDF 膜（孔径：0.45 µm）裁剪至略大于凝胶的尺寸。
      注：硝酸纤维素膜可用于 Ponceau S 染色以评估蛋白上样量，而 PVDF 膜可产生更清晰的条带。
  2. 操作步骤。
    1. 将硝酸纤维素膜、滤纸和海绵在转移缓冲液中浸泡至少 10 分钟。若使用 PVDF 膜，先将其置于 100% 甲醇中 15 秒，或根据制造商建议处理，然后再放入转移缓冲液中。将转移装置的开放型夹板放入盛有转移缓冲液的平底容器中。
    2. 将海绵和 1–2 层滤纸放置在夹板背面。去除气泡。
    3. 将凝胶置于滤纸上。通过剪去凝胶和/或膜的一角来标明凝胶的方向。
    4. 将膜覆盖在凝胶上。彻底去除气泡。
    5. 在膜上方再放置滤纸和一块海绵。确保此“三明治”结构中无任何气泡。
    6. 合上夹板，并将其放入转移装置的夹板架中。
    7. 以 25 V 电压转移蛋白约 12–18 小时。

4. 免疫印迹

  1. 准备
    1. 通过将25 mL乙酸和0.5 g Ponceau S加入475 mL H₂O中，配制500 mL Ponceau染色液2O；室温保存（可重复使用）。
    2. 配制含200 mM NaCl、25 mM Tris-Base和2.7 mM KCl的Tris缓冲盐水（TBS），调节pH至8.0，室温保存。
    3. 通过向TBS中加入0.5 mL/L Tween 20配制TBST缓冲液；室温保存。
    4. 将5 g脱脂奶粉溶于100 mL TBST中，配制封闭液。4 °C保存，3天内使用。
    5. 将3 g牛血清白蛋白（BSA，V组分）溶解于100 mL TBST中，配制BSA/TBST溶液。4 °C保存，3天内使用。
  2. 实验方案
    1. 转膜完成后，将膜放入Ponceau S溶液中以显示所有已转移的蛋白质。用铅笔标记膜上蛋白Marker的位置，并通过拍照或扫描记录Ponceau S染色后的膜。
    2. 用 TBS 在温和振荡条件下洗涤膜，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。
    3. 用脱脂奶粉/TBST 在室温下封闭膜 1-2 小时，或在低温冰箱中过夜，同时轻轻振荡。
    4. 用TBST在温和振荡条件下洗涤膜10分钟。
    5. 在4℃轻柔振荡条件下，与一抗孵育过夜。将抗体稀释（例如， 1:1,000 稀释的抗 ATP5A 和抗 NDUFB6 抗体，溶于 BSA/TBST 中。
      注意：大多数抗体在与天然凝胶的膜孵育过夜时可产生更强的信号。
    6. 用TBST在温和振荡条件下洗涤膜10分钟。
    7. 在室温下轻柔振荡孵育二抗至少60分钟。用脱脂奶粉/TBST缓冲液将抗体稀释（1:5,000 至 1:50,000）。
    8. 用TBST在室温下轻轻振荡洗涤膜3次，每次10分钟。
    9. 在最后一次洗涤期间，根据生产商的说明制备增强型化学发光（ECL）底物。
    10. 根据制造商提供的说明，将膜与ECL底物孵育。
    11. 使用ECL底物生产商提供的说明书检测膜上的信号。

5. 电洗脱

  1. 准备。
    1. 配制洗脱缓冲液：25 mM 三羟甲基甘氨酸、3.75 mM 咪唑（4 °C 时 pH 7.0）和 5 mM 6-氨基己酸。
      注意：操作电洗脱仪和膜帽时应始终佩戴手套，以防止外源蛋白污染。
  2. 在使用电洗脱仪进行天然电洗脱的前一天，执行以下步骤：
    1. 将膜帽（截留分子量：3.5 kDa）在洗脱缓冲液中于 60 °C 浸泡 1 小时。将膜帽转移至新鲜的洗脱缓冲液中，并在冰箱中浸泡 12 小时或更长时间。
      注意：3.5 kDa 的截留分子量可防止可能从目标蛋白复合物中容易解离的小分子蛋白丢失。
    2. 用乙醇彻底清洗电洗脱模块、玻璃管、槽体和盖子，然后用水冲洗，并让设备自然晾干。
  3. 在进行天然电洗脱当天，执行以下操作。
    1. 将烧结滤片放入每个待用玻璃管的底部（磨砂面）。如有必要，可将玻璃管置于洗脱缓冲液中，从管内将滤片推至管底。
    2. 将带有滤片的玻璃管插入电洗脱仪的模块中。用洗脱缓冲液润湿密封圈，并将玻璃管滑入到位。确保所有玻璃管的顶部与密封圈齐平。
    3. 用堵头封闭空的密封圈孔位。
    4. 将湿润的膜帽置于硅胶接头底部，并用洗脱缓冲液充满接头。缓慢地用移液器上下吹打接头内的缓冲液，以去除透析膜周围的任何气泡。
    5. 将充满缓冲液的接头滑入玻璃管底部。清除玻璃管内滤片上出现的所有气泡。
    6. 向每根玻璃管中加入洗脱缓冲液。
    7. 将 BN-PAGE 胶中切下的条带放入玻璃管中（参见步骤 1.2.9.3）。将较大的胶块切成较小的片段。确保玻璃管内填充高度约为 1 cm。
    8. 将整个模块放入槽体中。
    9. 向槽体中加入约 600 mL 冷的洗脱缓冲液。确保硅胶适配器帽浸没在缓冲液中，以防止透析膜处产生气泡。
    10. 在槽体底部放置一个搅拌子。
      注意：搅拌可防止气泡附着在透析膜底部。
    11. 在低温室中以 350 V 电压进行 4 小时的蛋白洗脱。
    12. 洗脱完成后，将电洗脱模块从缓冲液槽中取出，放入水槽或容器中。
    13. 如果使用了堵头，应将其移除以排空上部缓冲液室；否则，使用大容量移液器移除缓冲液。
    14. 从每根玻璃管中移除缓冲液并弃去。确保硅胶适配器保持原位，且滤片下方的液体不受扰动或震荡。
    15. 小心地将硅胶适配器连同膜帽一起从玻璃管底部取下。用移液器将硅胶帽内的内容物（约 400 µL）转移至微量离心管中。再用 200 µL 洗脱缓冲液冲洗硅胶帽，并将冲洗液加入同一微量离心管中。对所有玻璃管重复此操作。
    16. 由于膜帽可重复使用，应将其保存在含有 0.5 mg/mL 叠氮化钠的洗脱缓冲液中，并置于冰箱中冷藏保存。
      注意：洗脱液中蛋白浓度较低，可使用离心过滤装置进行浓缩。

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结果

为观察线粒体超复合物，采用从小鼠中 freshly 分离的线粒体17,18。线粒体超复合物对反复冻融循环敏感，可能导致其解体，尽管部分研究人员可能认为此情况尚可接受。若因储存需要必须冷冻，则为确保最佳效果，样品冻融次数不应超过一次。

为了通过蓝非变性凝胶电泳（BN PAGE）观察线粒体电子传递链（ETC）复合物，将分离自心脏线粒体的100 µg蛋白质上样至4-10%的凝胶中（图1A）。在电泳过程中，上样缓冲液和阴极缓冲液中的考马斯亮蓝足以标记蛋白质复合物。超级复合物需经数字方式增强对比度后可见（未显示）。对于CN PAGE，将两份分离线粒体来源的20 µg蛋白质样品上样至3-8%的CN凝胶中并进行分离（图1B）。CN ...

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讨论

功能完整的电子传递链（ETC）是线粒体生成ATP所必需的。电子传递链的各复合物能够形成两种类型的超复合物：呼吸体（Cx-I、-III 和 -IV）1 和合成体（Cx-V）2。每个复合物的正确组装对于维持电子传递链的完整性至关重要，而电子传递链以超复合物形式进行组织被认为可提高整体电子传递效率5,22。目前对这些超复合物的组装与解离机制尚不完全清楚，但本文所介绍的实验方案可能有助于更深入地理解这些过程。

研究电子传递链（ETC）组装的主要挑战在于这些蛋白质复合物的尺寸。例如，线粒体呼吸体可能由复合物I（Cx-I，约880 kDa）以及一个或多个复合物III（Cx-III，460 kDa）和复合物IV（Cx-IV，200 kDa，以二聚体形式发挥活性）分子组成，形成分子量约为2,000 kDa的超复合物。此外，复合物V（Cx-V）的分子量约为600 kDa，但已被证明可组装成...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国心脏协会创始人分会 [12GRNT12060233] 和罗切斯特大学强儿童研究中心资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Protean II mini-gel chamberBiorad1658004用于灌注和运行微型凝胶电泳的完整套装
Protean XL maxi-gelBiorad1653189用于灌注和运行大型凝胶电泳的完整套装
梯度混合器，Hoefer SG15VWR95044-704用于灌注微型凝胶梯度
梯度混合器，大型凝胶VWRGM-100用于灌注大型凝胶梯度
转膜试剂盒Biorad1703930用于将蛋白质湿法转移至膜上的完整套装
电洗脱仪型号 422Biorad1652976从天然或 SDS-PAGE 凝胶中电洗脱蛋白质
玻璃板Biorad1653308短板
玻璃板Biorad1653312间隔板
玻璃板Biorad1651823内板
玻璃板Biorad1651824外板
电源Biorad1645070适用于天然电泳的电源
ECL-Western Thermo Scientific32209化学发光底物
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075增强型化学发光底物
胶片/自显影胶片GE Health care28906845用于记录 Western 印迹结果
胶片处理器 CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNA用于拍摄凝胶、膜和印迹图像
Canon Power Shot 640 相机遮光罩 Canon为在透射光台上拍照提供相机遮光保护
丙烯酰胺/双丙烯酰胺Biorad161014840% 预混溶液
甘氨酸SigmaG7403
SDS（十二烷基硫酸钠）Invitrogen15525-017
Tris 碱SigmaT1503缓冲液
TricineSigmaT0377
脱氧胆酸钠SigmaD66750去垢剂
EDTASigmaE5134
蔗糖SigmaS9378
MOPSSigmaM1254缓冲液
咪唑SigmaI15513缓冲液
月桂基麦芽糖苷SigmaD4641去垢剂
Coomassie G250Biorad161-0406
氨基己酸SigmaO7260
Native  分子量标准品GE Health care 17-0445-01用于天然电泳的高分子量校准试剂盒
名称公司货号备注
NADHSigmaN4505
硝基蓝四氮唑SigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP  SigmaA2383
名称公司货号备注
硝酸铅（Pb(NO3)2）Sigma228621
寡霉素SigmaO4876
名称公司货号备注
丽春红 SSigmaP3504
抗-ATP5AAbcamab14748ATP合酶亚基ATP5A抗体
抗-NDUFB6Abcamab110244复合物I亚基NDUFB6抗体
抗-VDACCalbiochem529534VDAC抗体
ECL HRP标记抗体GE Health CareNA931VATP5A、NDUFB6和VDAC的二抗
封闭试剂Biorad170-6404
BSA
氯化钠SigmaS9888
氯化钾SigmaP9541
EGTASigmaE3889
名称公司货号备注
银染试剂盒InvitrogenLC6070

参考文献

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