DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

摘要

利用亲脂性的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）染色技术，可对Ambystoma mexicanum进行血管灌注，从而便于清晰显示其血管系统。

摘要

灌注技术已使用数个世纪，用于观察组织的血液循环。墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种蝾螈物种，已成为再生研究的重要模型。目前对这些动物在再生过程中如何实现再血管化的了解仍较少。本文报道一种通过灌注高氯酸1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青（DiI）来可视化墨西哥钝口螈血管系统的简单方法。DiI 是一种亲脂性羰花青染料，可立即插入内皮细胞的质膜中。灌注使用蠕动泵进行，使 DiI 通过主动脉进入循环系统。在灌注过程中，染料流经墨西哥钝口螈的血管，并在接触时整合到血管内皮细胞的脂双层中。对于一条八英寸长的墨西哥钝口螈，灌注过程大约需要一小时。使用 DiI 灌注后，可立即通过共聚焦荧光显微镜观察墨西哥钝口螈。当使用绿色荧光滤光片激发时，DiI 会发出红橙色光。该 DiI 灌注方法可用于观察墨西哥钝口螈的血管结构，或展示再生组织中的再血管化模式。

引言

血管系统的可视化在理解多种生物的结构与功能中起着至关重要的作用。自16世纪起^th 自列奥纳多·达·芬奇以来的几个世纪中，循环系统的模型与图形表征一直被研究¹使用石蜡和橡胶模具对组织进行灌注，以构建血管系统的三维模型，从而可用于器官发生和发病机制的研究^1,2树脂和蜡可通过染料（如印度墨水或胭脂红）染色，以便于观察^1,2然而，这些技术引发了许多问题，因为其高黏度阻碍了对目标组织的充分灌注¹随着该领域技术的不断进步，共聚焦显微镜和电子显微镜的应用逐渐普及，使得灌注技术从传统的铸型模具方法转向对血管系统的液体灌注，其中一些技术能够在不破坏原始组织的前提下实现血管的灌注与成像。³DiI 是一种荧光碳菁染料，此类染料可实现动物灌注，同时不损伤血管组织。

碳菁染料是一类脂溶性染料，接触细胞膜后可嵌入其中。这类染料能够快速且即时地对血管内皮细胞进行染色，随后可在荧光共聚焦显微镜下观察。DiI可在细胞脂质膜中通过侧向扩散移动，这一点已在神经元的标记与示踪研究中得到证实⁴。从化学结构上看，DiI的两条烷基链赋予该染料对细胞膜的高亲和力，而其两个共轭环则构成荧光团，在绿色荧光滤光片激发下可发射红光⁴。DiI已被广泛应用于多种研究场景，包括对细胞质膜的成功标记以及神经元的顺行性和逆行性标记^5,6。此前，DiI也已在灌注实验方案中用于小鼠血管系统的可视化研究⁷。

墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种仅生活于墨西哥墨西哥城附近咸水湖中的蝾螈。由于成年个体能够再生完整的四肢、尾部（包括神经索）、部分心脏及其他内脏器官，以及眼部的部分结构，这些动物已成为研究再生过程的重要模型^8,9。此外，随着遗传学工具在墨西哥钝口螈中的最新应用，人们现在能够以前所未有的深度揭示驱动这些再生过程的分子与细胞机制⁸。完整肢体的再生需要广泛的再血管化过程，这一过程可能在再生中发挥超出血管传统功能（如提供氧气和营养）的重要作用。因此，理解组织再生背景下的再血管化过程至关重要。此前已有研究使用印度墨水对墨西哥钝口螈的血管进行可视化观察，尽管结果引人注目，但该方法在随后的几十年中未再被进一步探索¹⁰。我们尝试将一种原本为哺乳动物设计的DiI灌注方案进行改良，以实现对墨西哥钝口螈整个血管系统的完整灌注与可视化⁷。本方案详细描述了成功实施DiI染色技术对墨西哥钝口螈循环系统进行灌注和后续可视化的具体步骤。该方法可实现对稳态组织以及再生组织中通畅血管的精确可视化，为研究墨西哥钝口螈再血管化过程提供了一种新颖的技术手段。

方案

所有墨西哥钝口螈实验均按照布莱根妇女医院（BWH）机构动物护理和使用委员会的规定进行。

1. 设置灌注实验

1. 将一只成年墨西哥钝口螈放入盛有0.1%三卡因溶液（MS222）的塑料容器中，麻醉15-20分钟，或直至完全麻醉。确保容器中三卡因溶液的量足以完全浸没墨西哥钝口螈。
   注意：所有操作必须遵循机构动物护理指南。在BWH，当墨西哥钝口螈对足部夹捏测试无反应时，即认为其已完全麻醉，这意味着轻捏足部时无反射性运动。
   警告：尽管三卡因是专用于水生生物的麻醉剂，但仍应避免皮肤直接接触三卡因溶液。
2. 设置墨西哥钝口螈灌注工作站。
   1. 将吸水垫放置在平坦、水平的表面上，吸水面朝上。
   2. 在聚苯乙烯泡沫框架上切割一个合适大小和形状的孔洞，使麻醉后的墨西哥钝口螈能够仰卧其中。将框架放在吸水垫上。
      注意：可在框架正下方额外放置一些纸巾以增强吸水性。
   3. 将灌注管路安装到蠕动泵上。将泵设置为0.7 ml/min的流速，顺时针方向流动。
   4. 用0.7x PBS和5%葡萄糖按1:4的比例配制稀释液。
   5. 在50 mL锥形管中，将10 mL稀释液与200 µL DiI储备液混合。盖紧后通过倒置混匀。用铝箔纸包裹该管，以避免工作液暴露于光线下。
      注意：体积应根据墨西哥钝口螈的大小按比例调整。上述数值适用于体长（吻部至尾部）约15 cm的个体。此体型的动物可能尚未达到完全性成熟，因此此时可能无法确定性别。
   6. 用0.7x PBS填充一个50 mL锥形管。
      注意：PBS将用于预冲管路循环以及墨西哥钝口螈的放血。
   7. 将27号蝶形针连接至灌注管路的出口端。将蝶形针的两翼折叠在一起，并固定在夹具支架上。
   8. 将灌注管路的自由端放入装有0.7x PBS的50 mL锥形管中，启动灌注泵，直至整段管路充满液体。当整个管路充满PBS后暂停泵。
      注意：务必始终保持管路中无气泡，因为气泡会导致墨西哥钝口螈发生空气栓塞，从而阻碍完全灌注。
   9. 在聚苯乙烯泡沫框架的墨西哥钝口螈形状模具中放置一张纸巾。使用移液管将三卡因溶液浸湿纸巾。
      注意：在纸巾中央剪一个小方孔，以便在灌注过程中排出液体。
   10. 将麻醉后的墨西哥钝口螈仰卧放置于聚苯乙烯泡沫框架内的纸巾上。

2. 打开蝾螈胸腔

1. 使用手术镊夹住蝾螈胸部中央轴线处的皮肤，位置略低于肩线，然后向上提起。
2. 用手术刀在被提起的皮肤处做一个小切口。
3. 切除胸部的一块方形皮肤，以暴露两块软骨板。
   1. 去除皮肤，打开一个足够大的胸腔窗口，以便清晰观察心脏以及从心脏分出的大约 5 mm 的主动脉。
4. 使用镊子或闭合的剪刀小心撕开结缔组织，以避免切断任何主要血管。
5. 用镊子分别提起每一块软骨板，并用手术剪将其切除。
6. 用镊子小心夹住心包膜，轻轻提起，然后用手术剪刺破心包膜；切口深度应刚好足以刺穿极薄的心包膜，且切口大小应足以取出心包膜。注意不要剪到心脏。
7. 轻柔地去除心包膜，以暴露心脏和主动脉。
   注意：使用移液管定期用三卡因溶液冲洗胸腔和鳃部，以保持操作区域清洁，并维持蝾螈的麻醉状态。

3. 墨西哥钝口螈的灌注

1. 将装有蝶形针头的铁架台放置在聚苯乙烯泡沫框架旁边，使铁架台的臂部能够轻松操作，以便将针头插入蝾螈主动脉。插入时，针尖应朝向动物的头侧，并保持针头与主动脉平行，以避免穿透对侧血管壁。
2. 打开蠕动泵。0.7x PBS 应持续流经管路。
3. 将针头插入主动脉。
   1. 将镊子滑至主动脉弓下方，轻轻上提，以便于操作。
   2. 调整针头与夹具的位置，使针头沿主动脉长轴方向行进，指向头部。在插入针头时，用镊子在主动脉后方提供支撑。
      注意：针头应插入主动脉足够深度，以确保灌注过程中不会滑脱。对于一条15 cm的蝾螈，插入深度约为5 mm。务必使针头与主动脉完全对齐，避免贯穿性穿刺。贯穿性穿刺可能导致大出血，并降低灌注成功率。成功插入的标志是可见心脏心房明显扩张。
4. 迅速用剪刀划开一侧心房，使血液流出。
   1. 用三卡因溶液冲洗，防止血液在胸腔内积聚和形成血凝块。
5. 用约20–30 mL PBS对蝾螈进行灌注。 成功的灌注会使动物体色由浅粉色变为白色。
6. 暂停蠕动泵，将管路的自由端移入盛有15 mL DiI溶液的离心管中。重新启动泵，并注意避免管路中产生气泡。
7. 用全部DiI工作液对蝾螈进行灌注。
   注意：在成功的灌注中，蝾螈体色将变为DiI特有的亮粉色，这一变化在鳃部最为明显。
8. 完成DiI灌注后暂停泵，将管路自由端放入4%多聚甲醛（PFA）溶液中以固定组织。重新启动泵，至少灌注10 mL PFA。
   警示：PFA具有毒性，应妥善操作和处置。操作时需佩戴手套和护目镜，并在通风橱内配制溶液。使用PFA对蝾螈进行灌注以固定组织将导致动物死亡。

4. 结束灌注并进行可视化准备

1. 停止蠕动泵，并将针头从墨西哥钝口螈的主动脉中取出。
2. 将墨西哥钝口螈放置在塑料板上。
   注意：使用一个大号培养皿的一半效果较好，可向其上倒入少量三卡因（Tricaine）或磷酸盐缓冲液（PBS），以保持动物皮肤湿润，提高观察质量。
3. 将所有使用过的材料丢弃至指定的废物容器中。手术器械先用70%乙醇清洗，动物之间用玻璃珠灭菌器进行消毒，实验结束后通过高压灭菌进行彻底灭菌。用PBS溶液冲洗管路，随后排空、完全干燥并妥善保存以备后续使用。

5. 观察灌注的墨西哥钝口螈

1. 将墨西哥钝口螈置于荧光共聚焦显微镜下。
2. 关闭灯光，因为光照会妨碍对DiI染色血管的观察。
3. 使用绿色荧光发射滤光立方体（例如 使用共聚焦显微镜观察蝾螈血管系统时，采用ET-CY3染料，并以545 nm波长的激发光进行成像。
   注意：为获得高质量图像，可采用以下参数：曝光时间1.1 s，增益1x，饱和度1.0，放大倍数2X。

结果

通过DiI染色，可以轻松观察墨西哥钝口螈的血管系统。经脂溶性染料灌注后的动物，其血管在荧光共聚焦显微镜下立即可见。图1.1-1.5为灌注流程的示意图。使用亮粉色染料灌注后，成功完成灌注的墨西哥钝口螈整体呈现粉红色。在共聚焦显微镜下使用绿色荧光滤光片时，血管网络会显示出红色荧光信号。当灌注成功时，DiI染色可遍及全身组织，包括尾部、四肢、鳃和眼睛（分别见图2A、图2B、图2C、图2D）。灌注失败则表现为血管无红色染色或染色呈斑块状分布。

讨论

通过使用亲脂性羰花青染料DiI灌注，可成功实现墨西哥钝口螈血管系统的可视化。在本研究中，我们描述了一种利用蠕动泵对墨西哥钝口螈进行DiI灌注的新型实验方案。我们还展示了随后使用荧光共聚焦显微镜观察墨西哥钝口螈血管系统的方法。本方案改编自Li et al.⁷中报道的大鼠DiI灌注方法，但由于大鼠与墨西哥钝口螈之间存在显著差异，因此需要对该方案进行修改，以适用于墨西哥钝口螈模型。

本研究介绍了一种用于成功可视化墨西哥钝口螈血管系统的DiI灌注方法。由于蝾螈与啮齿类动物在解剖结构和生理特性上存在差异，因此灌注过程中的多个关键环节需要进行调整，包括针头插入位置、灌注方式以及所用试剂。为了实现成功的灌注，我们尽量减少对墨西哥钝口螈血管系统的损伤。在打开胸腔时，需小心操作以充分暴露心脏和主动脉，同时避免对主要血管造成任何损伤或撕裂。限制手术剪的使用可防止意外剪断主要血管，而较小的切口有助于控制心脏和主动脉的暴露程度。当将DiI注射针经由主动脉插入而非直接插入心脏腔室时，灌注成功率显著提高。与小鼠不同，墨西哥钝口螈具有三腔心脏，仅...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蠕动泵	Marshall Scientific	RD-RP1
灌注管路	Excelon 实验室 &和真空管	436901705	大小 S1A
27g 蝴蝶针	EXELint 医疗产品	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
蒸馏水
HCl	AmericanBio	7647-01-0
葡萄糖	ThermoFischer	A2494001
1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′高氯酸四甲基吲哚羰花青	Sigma Aldrich	468495
乙醇（100% vol/vol）	Sigma Aldrich	64-17-5
手术镊	Medline	MDG0748741
聚苯乙烯泡沫框架			任何带有蝾螈形状的聚苯乙烯泡沫方块  切除
手术剪	Medline	DYND04025
手术刀	Medline	MDS15210
吸水垫	Avacare Medical	PKUFSx
纸巾
标准一次性移液管	Fisherbrand	50216954
铁架台	Adafruit	291
甲磺酸三卡因	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine 粉末
成年墨西哥钝口螈
MgSO₄4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO₃3	Sigma Aldrich	S5761-500G
塑料容器			适用于不同体型的墨西哥钝口螈
多聚甲醛	Sigma Aldrich	30525-89-4
墨西哥钝口螈
徕卡显微镜	Leica	M165 FC
ET-CY3 荧光滤光片	Leica	M205FA/M165FC
MS-222