DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

摘要

利用亲脂性的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）染色技术，可对Ambystoma mexicanum进行血管灌注，从而便于清晰观察其血管系统。

摘要

灌注技术已使用数个世纪，用于观察组织的血液循环。墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种蝾螈物种，已成为再生研究的重要模型。目前对这些动物在再生过程中如何实现再血管化的机制仍知之甚少。本文报道了一种通过灌注高氯酸1,1’-二十八碳-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青（DiI）来可视化墨西哥钝口螈血管系统的简单方法。DiI 是一种亲脂性羰花青染料，可瞬间插入内皮细胞的质膜中。灌注过程使用蠕动泵进行，使 DiI 通过主动脉进入循环系统。在灌注过程中，染料流经墨西哥钝口螈的血管，并在接触时整合到血管内皮细胞的脂双层中。对于一条八英寸长的墨西哥钝口螈，灌注过程大约需要一小时。使用 DiI 灌注后，可立即通过共聚焦荧光显微镜观察墨西哥钝口螈。当使用绿色荧光滤光片激发时，DiI 会发出红橙色光。该 DiI 灌注方法可用于观察墨西哥钝口螈的血管结构，或展示再生组织中再血管化的模式。

引言

血管系统的可视化在理解多种生物体的结构与功能方面起着至关重要的作用。自16世纪起^th 自列奥纳多·达·芬奇以来的几个世纪中，循环系统的模型与图形表征一直被研究¹使用石蜡和橡胶模具对组织进行灌注，以构建血管系统的三维模型，从而可用于器官发生和发病机制的研究^1,2树脂和蜡可用染料（如印度墨水或胭脂红）染色，以便于观察^1,2然而，这些技术引发了许多问题，因为其高黏度阻碍了对目标组织的充分灌注¹随着该领域的发展日益成熟，共聚焦显微镜和电子显微镜的应用逐渐普及，使得灌注技术从铸型模具转向血管系统的液体灌注，其中一些方法能够在不破坏原始组织的情况下实现血管的灌注与成像³DiI 是一种荧光碳菁染料，此类染料可实现动物灌注，且不会损伤血管组织。

碳菁类染料是一类脂溶性染料，接触后可嵌入细胞膜中。这类染料能够简便且即时地对血管内皮细胞进行染色，随后可在荧光共聚焦显微镜下观察。DiI 可通过细胞脂质膜中的侧向扩散进行移动，这一点已在神经元的标记与示踪研究中得到证实^4....

方案

所有墨西哥钝口螈实验均依照布莱根妇女医院（BWH）机构动物护理与使用委员会的规定进行。

1. 设置灌注实验

1. 将一只成年墨西哥钝口螈放入盛有0.1%三卡因溶液（MS222）的塑料容器中，麻醉15-20分钟，或直至完全麻醉。确保容器中三卡因溶液的量足以完全浸没墨西哥钝口螈。
   注意：所有操作必须遵循机构动物护理指南。在BWH，当墨西哥钝口螈对足部夹捏测试无反应时，即认为已完全麻醉，这意味着轻捏足部时无反射性运动。
   警告：尽管三卡因是专用于水生生物的麻醉剂，但仍应避免皮肤直接接触三卡因溶液。
2. 设置墨西哥钝口螈灌注工作站。
   1. 将吸水垫放置在平坦、水平的表面上，吸水面朝上。
   2. 在聚苯乙烯泡沫框架上切割一个合适大小和形状的孔洞，使麻醉后的墨西哥钝口螈能够仰卧其中。将框架放在吸水垫上。
      注意：可在框架正下方额外放置一些纸巾以增强吸水性。
   3. 将灌注管路安装到蠕动泵上。将泵设置为0.7 ml/min的流速，顺时针方向流动。
   4. 用0.7x PBS和5%葡萄糖按1:4的比例配制稀释液。
   5. 在50 mL锥形管中，将10 mL稀释液与200 µL DiI储备液混合。盖紧后通过倒置混匀。用铝箔纸包裹该管，以避免工作液暴露于光线下。
      注意：体积应根据墨西哥钝口螈的大小按比....

结果

通过DiI染色，可以轻松观察蝾螈的血管系统。经脂溶性染料灌注后的动物，其血管在荧光共聚焦显微镜下立即可见。图1.1-1.5为灌注流程的示意图。使用亮粉色染料灌注后，成功完成灌注的蝾螈整体呈现粉红色。在共聚焦显微镜下使用绿色荧光滤光片时，血管网络会显示出红色荧光信号。当灌注成功时，DiI染色可遍及全身组织，包括尾部、四肢、鳃和眼睛（分别见图2A、图2B、图2C、图2D）。灌注失败则表现为血管无红色染色或染色呈斑块状分布。

讨论

通过使用亲脂性羰花青染料DiI灌注，可成功实现墨西哥钝口螈血管系统的可视化。在本研究中，我们描述了一种利用蠕动泵对墨西哥钝口螈进行DiI灌注的新型实验方案。我们还展示了随后使用荧光共聚焦显微镜观察墨西哥钝口螈血管系统的方法。本方案借鉴了Li et al.⁷中报道的大鼠DiI灌注方案，但由于大鼠与墨西哥钝口螈之间存在显著差异，因此需对该方案进行修改，以适用于墨西哥钝口螈模型。

本研究介绍了一种通过DiI灌注来成功可视化墨西哥钝口螈血管系统的方法。由于蝾螈与啮齿类动物在解剖结构和生理特性上存在差异，因此在灌注过程的关键环节——包括穿刺针插入位置、灌注方式以及所用试剂等方面，均需进行相应调整。为了实现成功的灌注，我们尽量减少了对墨西哥钝口螈血管系统的损伤。在打开胸腔时，操作需谨慎，以充分暴露心脏和主动脉，同时避免对主要血管造成任何损伤或撕裂。限制手术剪的使用可防止意外剪切大血管，而小切口则有助于控制心脏和主动脉的暴露程度。当将DiI注射针经由主动脉而非直接插入心腔进行灌注时，灌注成功率显著提高。与小鼠不同，墨西哥钝口螈具有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蠕动泵	Marshall Scientific	RD-RP1
灌注管路	Excelon Lab &和真空管	436901705	大小 S1A
27g 蝴蝶针	EXELint 医疗产品	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
蒸馏水
HCl	AmericanBio	7647-01-0
葡萄糖	ThermoFischer	A2494001
1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′高氯酸四甲基吲哚羰花青	Sigma Aldrich	468495
乙醇（100% vol/vol）	Sigma Aldrich	64-17-5
手术镊	Medline	MDG0748741
聚苯乙烯泡沫框架			任何带有蝾螈形状的聚苯乙烯泡沫方块  剪下
手术剪	Medline	DYND04025
手术刀	Medline	MDS15210
吸水垫	Avacare Medical	PKUFSx
纸巾
标准一次性移液管	Fisherbrand	50216954
铁架台	Adafruit	291
甲磺酸三卡因	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine 粉末
成年墨西哥钝口螈
MgSO₄4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO₃3	Sigma Aldrich	S5761-500G
塑料容器			适用于不同体型的墨西哥钝口螈
多聚甲醛	Sigma Aldrich	30525-89-4
墨西哥钝口螈
徕卡显微镜	Leica	M165 FC
ET-CY3 荧光滤光片	Leica	M205FA/M165FC
MS-222