骨髓间充质干细胞质膜囊泡的制备及其在潜在细胞质置换治疗中的应用

摘要

与衰老相关的疾病与细胞质多种组分的缺陷有关。本文介绍了一种从骨髓间充质干细胞制备质膜囊泡的实验方案。该技术有望作为一种细胞质替代疗法，用于改善甚至逆转与衰老相关的表型。

摘要

我们此前已报道过通过机械挤出法从哺乳动物细胞中生成质膜小泡（PMVs）。将PMVs与线粒体缺陷型Rho0细胞融合后，可在正常培养条件下恢复其有丝分裂活性。动脉粥样硬化、2型糖尿病、阿尔茨海默病和癌症等衰老相关疾病已被证实与多种细胞类型的细胞质及细胞器在机械和功能上的多重缺陷有关。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中一类独特的细胞群体，具有自我更新能力并能维持其多向分化潜能。通过PMVs介导，将自体年轻BMSCs的细胞质补充至衰老细胞中，为改善甚至逆转与年龄相关的表型提供了一种有前景的策略。本实验方案详细描述了如何通过孔径为3 µm的聚碳酸酯膜挤出法从BMSCs制备PMVs，利用共聚焦显微镜检测PMVs中线粒体的存在及其膜电位的维持情况，通过离心法浓缩PMVs，并进行后续操作 在体 向小鼠腓肠肌注射PMVs。

引言

在基因、酶和细胞替代疗法的建立方面已投入大量努力，由此取得了重大突破，甚至实现了临床应用^1,2,3最近，一种基于细胞核移植技术的、颇具争议的线粒体替换疗法已被应用 体外 高龄女性或携带致死性线粒体DNA突变女性的受精⁴在动脉粥样硬化、2型糖尿病、阿尔茨海默病和癌症等年龄相关性疾病中发现的缺陷通常具有多方面因素。已有文献记载，脂滴的积累、淀粉样蛋白的沉积、未折叠蛋白在内质网中的滞留，以及蛋白酶体、自噬体和线粒体的功能障碍，均会促进这些疾病的发生或加重。^{5,6,7,8,9,10,11}目前尚无针对细胞质和细胞器功能障碍进行直接修复的机制，而这种功能障碍会导致细胞衰老和老化表型。

方案

8至12周龄的BALB/c小鼠购自中国上海实验动物中心（中国上海），并在特定无病原体和空调控制的动物设施中饲养。动物护理和实验操作均遵循汕头大学制定的《实验室动物使用与护理指南》。

1. 仪器装置的组装

1. 为确保无菌，使用前开启超净台的紫外灯照射 30 分钟。
2. 拧开一次性 25 mm 滤器单元，将单元的上盖和底座浸入盛有 75% 乙醇的 200 mL 玻璃杯中，浸泡 30 分钟。该单元由医用级聚丙烯制成。
3. 使用镊子夹取单元的上盖和底座，手动甩去残留乙醇，并在超净台内静置晾干 10 分钟。
4. 用 PBS 润湿一张 19 mm 聚碳酸酯膜，小心将其放置在滤器底座支撑基质的上方。该聚合物膜表面光滑平整，带有经核孔蚀刻的 3 µm 孔径微孔。
5. 将上盖与底座拧紧，重新组装滤器单元。确保膜未从中心位置移位。
6. 取下 1 mL 胰岛素注射器的针头，吸取 1 mL PBS。将注射器连接至滤器单元，推动 PBS 穿过滤器，以润湿组件并检测是否存在泄漏。

2. 质膜囊泡（PMVs）的制备

1. 建立骨髓间充质干细胞（BMSC）培养，方法如Nemeth所述 等¹⁵，置于含15% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，在6孔....

结果

成功制备PMVs的关键在很大程度上取决于滤器单元的正确组装（图1），可通过推动1 mL PBS缓冲液穿过膜来测试组装是否正确。若出现泄漏，需重新组装滤器单元并再次测试。然而，只有在推动细胞穿过膜时，泄漏才能被可靠地检测到。如果在普通显微镜下使用10X物镜观察时仅检测到少量PMVs，或PMVs的尺寸大多在约1 µm左右，则表明由于组装不当，大部分细胞被截留在滤器单元内部。当使用20X物镜在相差显微镜下观察时，直径约为3 µm的PMVs占主导地位（图2）。由于纳米级尺寸的PMVs不易被观察到，因此在数量上大尺寸PMVs所占比例较低。研究发现，快速按压注射器有助于减少膜碎片的产生，这些碎片显然无法形成球形PMVs。此外，在第一次挤出液中发现了较小尺寸（小于1 µm）的PMVs，而较大尺寸的PMVs则主要在第二次挤出液中获得。

PMVs 最独特的特征是包裹了细胞核以外的细胞组分

讨论

本文提出的细胞质置换疗法相较于其他已报道的方法（如基因治疗、分子治疗和细胞治疗）具有独特优势。由骨髓间充质干细胞（BMSCs）产生的去核细胞质微泡（PMVs）不仅包裹了干性基因的产物，还包含完整的细胞器，这些成分对于改善与细胞衰老相关的老化表型至关重要。当年轻细胞的细胞质被递送至衰老细胞时，功能失调的细胞机制可能得到短暂缓解；同时，表观基因组可能被重编程并恢复活力，从而产生持久效果。此外，外源性线粒体可能具有更快的增殖速率，这一点已在我们先前的研究中有所提示¹²。替换受损线粒体至关重要，因为线粒体功能障碍已被证实与多种衰老相关疾病密切相关¹¹。另外，与干细胞不同，去核的PMVs无法增殖，因此几乎不会引发癌症发展的担忧。最后，PMVs中缺乏细胞核DNA，也降低了因DNA随机整合而导致基因组损伤的风险。

在正常或应激条件下，培养的细胞会产生多种膜性细胞外囊泡（EV）。外泌体来源于晚期内体，大多数哺乳动物细胞均可将其释放为直径30-120 nm的细胞外囊泡^1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IsoporeTM 膜	Millipore	TSTP04700	3 mm 孔径
一次性滤器	Xinya，中国上海	25 mm	医用级聚丙烯
胰岛素注射器	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Molecular Probes	M7514	Green FM，1 μM
JC-1	Beyotime，中国海门	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime，中国海门	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75,000
荧光显微镜	Nikon	Eclipse TE 2000	配备 CCD 相机
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	用于细胞转染