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方法文章

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

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DOI：

10.3791/55745

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2017年6月6日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。

摘要

细胞周期的基因表达程序是理解细胞周期依赖性过程及其在癌症等疾病中作用的关键步骤。细胞周期调控的基因表达分析依赖于将细胞同步至特定阶段。本文描述了一种常用的方法，该方法结合了两种互补的同步化方案，用于研究细胞周期中基因表达的周期性变化。这两种方案均基于暂时性地将细胞周期阻滞在某一特定节点。通过羟基脲（hydroxyurea, HU）处理的同步化方案可使细胞停滞在G1晚期/S期早期，解除HU诱导的阻滞后，细胞群体能够均一地进入并行进于S期和G2/M期。通过胸苷和诺考达唑（thymidine and nocodazole, Thy-Noc）处理的同步化方案则将细胞阻滞在有丝分裂早期，解除Thy-Noc诱导的阻滞后，可获得适合用于G1期及S期进入研究的同步化细胞群体。这两种方案的应用均需监测细胞周期分布情况，通常在使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）对细胞染色后，通过流式细胞术分析DNA含量来实现。我们表明，联合使用这两种同步化方案是一种可靠的方法，可清晰确定在细胞周期中差异调控的基因（即 E2F1 和 E2F7）的转录谱，从而更深入理解这些基因在细胞周期过程中的作用。此外，我们还表明，该方法适用于基于药物治疗机制的研究（即 丝裂霉素C，一种抗癌剂），因为它能够区分对基因毒性药物有响应的基因与仅受药物所引起的细胞周期扰动影响的基因。

引言

细胞周期各阶段的转换与严格调控的基因表达程序相偶联。这种协调 "开和关" 细胞周期中基因转录的调控被认为由复杂的转录调控系统控制，这些系统不仅调节基因表达的时机，还调控其表达水平。关键细胞周期组分的失调已被证实与多种疾病的发生相关，并且是肿瘤发生的一个明确标志。1,2基因组范围的转录组分析在酵母和哺乳动物细胞中均已表明，大量基因在细胞周期中表现出周期性的基因表达模式，提示细胞周期中的转录波动反映了特定基因产物在精确时相中的时间需求3,4,5.

研究细胞周期调控基因表达的一个主要任务是将细胞同步至特定的细胞周期时相。细胞同步有助于解析基因表达模式与特定细胞周期时相转换之间的关联，从而加深对众多基因调控机制与功能的理解。细胞同步对于研究抗癌药物作用机制也具有重要意义，因为已知化疗药物既会影响基因表达，也会影响细胞周期动力学6,7。然而，通常难以确定经这些药物处理后所导致的基因表达差异是药物处理的直接反应，还是仅仅源于细胞周期分布变化的间接结果。为了区分这两种可能性，应在添加化疗药物之前，先对细胞进行同步化处理，再分析其基因表达情况。

除某些原代细胞（如新分离的淋巴细胞，这类细胞为处于G0期的同质性细胞群体）外8-, 体外 已建立的细胞系在培养中呈异步生长。在常规培养条件下，这些异步增殖的细胞存在于细胞周期的各个时相，但主要集中在G1期。9因此，该背景条件无法为特定细胞周期阶段的功能或基因表达分析提供最佳实验环境。例如 G1、S 等）非转化的永生化细胞系（例如 成纤维细胞）可以通过所谓的生理学方法进行同步化10这些方法基于非转化细胞保留的原始细胞特性，例如细胞接触抑制和生长因子依赖性，以维持持续的细胞周期循环。去除血清并结合接触抑制可使非转化细胞停滞于G0/G1期。然而，细胞周期的同步化进入与进程通常需要进行传代培养，该过程还涉及人为的细胞脱离与重新接种。10最重要的是，该方法不适用于已转化细胞系的同步化，而目前广泛使用的绝大多数细胞系均属于此类，其特征是缺乏细胞接触介导的生长抑制或对生长因子撤除的响应。因此，显然需要采用其他方法来实现细胞周期特定阶段的高效同步化。总体而言，最常用的同步化方法基于使用化学或药物试剂对细胞周期中某一特定节点进行短暂抑制，通常为DNA合成或有丝分裂纺锤体的形成。通过抑制DNA合成可使细胞停滞于G1晚期或S期早期，从而实现细胞同步化。该目的可通过添加如皂苷（mimosine）等核苷酸生物合成抑制剂来实现。11,12，阿糖胞苷（aphidicolin），一种DNA聚合酶抑制剂13,14，羟基脲，一种核糖核苷酸还原酶抑制剂15,16 或过量的胸腺嘧啶核苷17,18另一方面，微管聚合抑制剂（如秋水仙碱或诺考达唑）能够阻断有丝分裂纺锤体的形成，导致细胞在早期M期同步化。19,20,21.

在本研究中，我们描述了一种基于瞬时化学抑制的双互补同步化方案，用于在 mRNA 水平上研究细胞周期调控基因的表达。该方法对于明确细胞周期相关基因在特定细胞周期过程中的作用至关重要。此外，该方案为研究抗癌治疗的影响提供了一个通用框架，可准确检测药物响应基因，并最大限度地减少因药物引起的细胞周期进程扰动而产生的误判。

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方案

1. 细胞周期同步化、释放及细胞周期进程监测

  1. 基于胸腺嘧啶和诺考达唑（Thy-Noc）的U2OS细胞有丝分裂同步化及释放
    1. 配制所需的细胞培养基。U2OS细胞常规培养于添加了10%（体积比）胎牛血清（FBS）的DMEM-谷氨酰胺培养基中（可选：1%青霉素/链霉素）。所有培养基的配制和操作均须在无菌条件下进行，并将添加了补加物的培养基（以下简称 "完全培养基"使用前将温度升至 37 °C。
    2. 种子 2 × 106 每100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基接种U2OS细胞。为计算所需培养皿数量，需注意每个100 mm培养皿通常可提供足够的有丝分裂细胞，用于重铺约5个6孔板孔（0.2 - 0.25 x 10⁶细胞/孔）。6 细胞/孔）（参见 图1B每个选定时间点需要设置两个孔（一个用于RNA提取，一个用于细胞周期监测）。此外，每个时间点可额外收集第三个孔用于蛋白质分析。
      ​注意：在晚上（约19点）接种细胞，以便后续步骤可在接下来的工作日工作时间内进行。额外设置2个未同步生长的细胞孔，用于确定流式细胞术分析的补偿参数。
    3. 让细胞贴壁，即将100 mm培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 24 小时。
    4. 对于胸腺嘧啶核苷阻断，通过将145.2 mg胸腺嘧啶核苷粉末溶解于3 mL H2O（或等量物质），并通过0.2 µm孔径滤器过滤溶液以灭菌。略微加热可能有助于胸腺嘧啶核苷溶解。向每个100 mm培养皿中加入100 μL新配制的200 mM储备液（终浓度为2 mM）。将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中用胸腺嘧啶核苷孵育20小时。2.
      ​注意：建议在晚上（约19点）处理细胞，以便有足够时间在次日依次进行胸苷释放和诺考达唑阻断。
    5. 为解除胸腺嘧啶阻断，在次日下午（15:00）移除含胸腺嘧啶的生长培养基；用预热的1×PBS洗涤细胞两次，每100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基。将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育5 h。2.
    6. 为实现有丝分裂细胞阻滞，将诺考达唑加入至终浓度为 50 ng/mL（8 pm）。通过将诺考达唑粉末溶于 DMSO 中配制储备液（例如 5 mg/mL），并于 -20 °C 冻存。在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中，用诺考达唑处理细胞，孵育时间不超过 10 - 11 小时。2.
    7. 早期M期（有丝分裂摇落法）解除诺考达唑阻滞，并在多个时间点收集样品（始于上午6-7点）。
      1. 通过轻轻摇晃每个培养皿并用含有诺考达唑的生长培养基轻柔吹打，使呈圆形（有丝分裂期）的细胞脱落。将每个100 mm培养皿中含脱落细胞的培养基收集至50 mL无菌离心管中，以300 × g离心5分钟（室温），然后加入1×洗涤液重悬细胞，重复洗涤两次  PBS洗涤后离心。建议使用冷PBS或含诺考达唑的PBS，以避免有丝分裂滑脱（详见讨论部分）。
      2. 将从每个100 mm培养皿收集的有丝分裂细胞用10 mL完全培养基重悬。为0 h时间点（约0.2–0.25 × 10⁶个细胞）保留2 mL用于RNA提取，另取2 mL用于FACS分析。6 每样本细胞数
      3. 将剩余的有丝分裂细胞重新接种至6孔板中，用于后续时间点的实验（每孔2 mL，接种量为0.2–0.25 × 10⁶个细胞）。6 细胞/孔
        注意：每个选定的时间点需要2个孔（1个用于RNA分析，1个用于FACS分析）。
    8. 在选定的时间点收集样品。建议每1.5至3小时取样一次，以获得充分的细胞周期进程曲线。
      1. RNA提取时，吸除培养基，用2 mL预热的1×PBS充分洗涤，然后加入1 mL适当的RNA提取试剂（例如 TRIzol）加入孔中（此最后一步需在化学安全柜中操作）。用移液器吹打混匀以脱离并裂解细胞，将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，室温孵育5分钟，随后将离心管置于-80 °C保存，直至后续使用。
      2. 进行FACS分析时，用2 mL预热的1×PBS充分洗涤，加入预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.3 mL/孔）以解离细胞，再加入1 mL完全培养基终止胰蛋白酶-EDTA反应，并将每份样品分别收集至15 mL离心管中。
        1. 离心细胞（300 × g，5 min，室温），保留细胞沉淀，弃去上清液。为固定细胞，将细胞沉淀用1 mL预冷的70%（v/v）乙醇（溶于1× PBS）轻轻涡旋重悬，冰上放置约15 min，随后置于4 °C保存，或进行后续FACS染色分析（见步骤1.4–1.5）。
  2. 基于羟基脲的U2OS细胞在G1/S边界的同步化与释放
    1. 按照步骤1.1所述配制完全细胞培养基。
    2. 接种 0.25 x 106 在6孔板中每孔接种U2OS细胞（每孔2 mL完全培养基）。为计算实验所需的孔数，需考虑每个选定的时间点需要2个孔（1个孔用于RNA提取，1个孔用于细胞周期监测），此外还需额外2个孔的非同步生长细胞，用于设定FACS分析的补偿参数。
    3. 让细胞贴壁：将6孔板在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育过夜（O/N）2.
    4. 次日早晨从各孔中移除完全培养基，每孔加入 2 mL 预热的无 FBS DMEM-谷氨酰胺培养基。将细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中继续培养 24 小时。2.
      ​注意：除2个孔（用于设定流式细胞术参数）外，其余各孔均需进行此步骤。如果仅通过羟基脲（HU）孵育即可实现高效同步化，则可省略血清剥夺步骤。
    5. 使用羟基脲（HU）诱导G1/S期细胞周期阻滞。
      1. 每次使用前配制新鲜的HU储存液（500 mM）。加入2 mL H2将O至76.06 mg的HU粉末溶解于溶剂中并充分混匀。使用孔径为0.2 µm的滤器过滤溶液以实现灭菌。取50 mL完全培养基与400 μL经滤膜除菌的HU储存液混合，得到终浓度为4 mM的HU培养基。
      2. 除用于设定流式细胞术参数所需的2个孔外，移除其余各孔中的培养基，并更换为新配制的含4 mM HU的完全培养基（2 mL/孔）。
      3. 在含 HU 的培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养细胞 24 小时2.
    6. 释放细胞脱离羟基脲诱导的阻滞。吸除含羟基脲的培养基，用预热的1×PBS缓冲液洗涤细胞两次（每次2 mL）。每孔加入2 mL完全培养基。收集0小时时间点的2个样本（1个用于RNA提取，1个用于流式细胞术验证细胞周期阻滞），另保留2个样本用于流式细胞术参数设置。将剩余孔板放入培养箱中继续培养。
    7. 每1.5至3小时收集一次样品，以获得充分的细胞周期进程分布。在每个时间点，按照1.1.8.1–1.1.8.2节所述进行样品处理（用于RNA提取和FACS分析）。
  3. DNA损伤剂处理
    注意：每当研究目的是阐明一种化合物的作用时（例如 为了研究基因毒性试剂（DNA损伤剂）对细胞周期事件的影响，可将前述任一种细胞同步化方法与基因毒性试剂处理相结合。在选择同步化方法时，需重点考虑希望分析的细胞周期时相。通常情况下，胸苷-诺考达唑（Thy-Noc）联合处理法适用于研究化合物对G1期或进入S期的影响，而羟基脲（HU）介导的同步化则更适用于研究S期向G2期过渡或进入有丝分裂阶段的相关影响。
    1. G1期或S期进入过程中基因毒性试剂作用的分析
      1. 按照1.1.2至1.1.6所述方法同步细胞。
      2. 释放细胞脱离诺考达唑，并按照1.1.7步骤所述重新接种细胞。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 孵育3小时，使细胞贴壁，然后再加入试剂（所需孵育时间可能因细胞系而异）。
      3. 按照1.1.8节所述方法添加试剂并采集样品。
    2. S-G2期或M期进入过程中基因毒性试剂作用的分析
      1. 按照1.2.2至1.2.5所述同步细胞
      2. 按照1.2.6节所述方法从HU中释放细胞，并立即加入试剂。
      3. 按照1.8节中所述方法采集样品。
  4. 通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析监测细胞周期同步化及进程
    注意：所有时间点采集的样本以及用于确定FACS设置所需的样本，在固定后（如1.1.8.2所述）均可在4 °C保存。实验中所有样本应同时进行PI溶液染色，随后进行FACS分析。PI可插入双链DNA的大沟中，在535 nm激发光下产生强烈的荧光信号，发射光峰值约为600 nm。由于PI也可与双链RNA结合，因此为获得最佳DNA分辨率，必须用RNase处理细胞。
    1. 现配现用的PI染色液。可通过将PI粉末溶于PBS中制备PI储存液（例如 5 mg/mL）。将储备液置于 4 °C 避光保存。染色液由 PI（140 μM）、柠檬酸钠（38 mM）和 Triton X-100（0.01% v/v）组成。
    2. 预热合适的表面（例如 37 °C
    3. 离心固定后的细胞（450 × g，5 分钟，室温），弃上清液（乙醇），用 1× PBS 洗涤一次。
    4. 再次离心细胞，弃去PBS，除用于FACS设置的一个样本外，其余每个样本加入300 μL PI染色液；该样本中加入PBS。
    5. 将细胞转移至流式管（5 mL 圆底聚苯乙烯管）中。
    6. 向每个样品中加入1 μL RNase A，混匀后于37 °C避光孵育30分钟。样品可在4 °C避光保存，最多保存2至3天。
    7. 通过流式细胞术分析样品中的DNA含量。使用经碘化丙啶（PI）染色的非同步样品确定FACS分析的补偿设置。利用空白样品（未加PI染色液）检测自发荧光。基于PI染色的DNA含量流式细胞术分析基本原理此前已有描述9.
  5. 通过双磷酸化组蛋白H3（Ser10）/碘化丙啶染色法测定有丝分裂指数
    注意：通过使用针对丝氨酸10位点磷酸化组蛋白H3（pH3）的特异性抗体，结合流式细胞术可轻松检测处于有丝分裂期的细胞。同时进行PI染色有助于确定细胞群体基于DNA含量的分布情况。为优化FACS仪器设置，需准备5个样本：空白对照、仅PI染色、仅pH3染色、仅二抗对照以及双染色样本。
    1. 离心固定细胞（450 × g，5 分钟，4 °C），弃上清液。以下步骤描述了在 15 mL 离心管中进行染色的操作。
    2. 加入1 mL PBS-T（PBS + 0.05% Tween-20）重悬细胞沉淀，离心（450 × g，5 min，4 °C）。弃上清液。
    3. 加入用 PBS-T + 3% BSA 稀释的抗 pH3 抗体（1:500），总体积为 100–200 µL，室温下振荡孵育 2 小时（或 4 °C 过夜）。
    4. 加入2 mL PBS-T（PBS + 0.05% Tween-20），离心（450 × g，5分钟，4 °C）。弃去上清液。
    5. 再次加入2 mL PBS-T重悬沉淀，离心后弃去上清液。
    6. 加入用 PBS-T + 3% BSA 稀释的二抗（针对所选 pH3 抗体，使用抗兔 AlexaFluor 488，稀释比例为 1:500），每样本 100–200 µL，室温下摇床孵育 1 小时（或 4 °C 过夜）。避光操作。
    7. 用 PBS-T（2 mL）按照步骤 1.5.4 中所述方法离心洗涤两次。
    8. 按照所述步骤进行PI染色（步骤1.4.1至1.4.6）。

2. 基因表达分析的样品采集与处理

  1. 从冷冻保存中取出含有RNA提取试剂的1.5 mL微量离心管样品，在化学安全柜中室温下解冻。
  2. 向每个样品中加入 400 µL 氯仿，剧烈振荡（切勿涡旋）直至充分混匀。室温孵育 5 分钟。
  3. 在台式微量离心机中以 ≥8,000 x g 离心 15 分钟（4 °C）。
  4. 将水相（上层）转移至新的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积（为简化操作，建议在实验的所有样品中收集相等的体积）。
  5. 向水相中边混合边缓慢加入等体积的100%乙醇（逐滴加入）。切勿离心。
  6. 使用商业RNA小量提取试剂盒进行后续步骤。将每个样本最多700 µL（包括可能形成的任何沉淀）移入2 mL收集管中的离心柱内（试剂盒提供）。
  7. 盖上管盖，离心（≥ 8,000 g，室温）15 秒。弃去穿流液。如有剩余样品，重复上一步骤。
  8. 按照制造商说明进行RNA洗涤和洗脱（每个样本用30 - 40 µl无核酸酶的H₂O洗脱）2O，以获得适合下一步实验的RNA浓度）。
  9. 通过吸光度测量确定样本的RNA浓度和纯度（a A260/280 2.0–2.1 的比值表明 RNA 样本纯度良好。将 RNA 样本储存于 -80 °C，直至用于 RT-qPCR 分析。
  10. 对于RNA逆转录为cDNA及后续定量PCR，每个样本取1 µg RNA，并根据制造商说明书配制逆转录反应体系。所得cDNA样本可保存于4 °C（数天内）或-20 °C（较长时间）。
    注意：实时PCR的样品制备、引物设计及其他相关事项已在文献中得到充分描述22,23.

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结果

细胞同步化的 Thy-Noc 和 HU 基本方案示意图。

图1 总结了为实现U2OS细胞同步化并随后进行样品收集所需的步骤，以验证细胞周期的进程并开展基因表达分析。

磷酸化H3和PI染色是选择同步化方法的良好评估参数。

由于培养细胞固有的异质性，每种细胞系均需评估并优化细胞同步化方案。有丝分裂的同步化通常采用胸苷-诺考达唑（Thy-Noc）法，通过诺考达唑处理后，可利用特异性识别磷酸化组蛋白H3（pH3）的抗体检测有丝分裂细胞的富集情况，pH3是一种典型的有丝分裂标志物。鉴定pH3阳性细胞有助于区分处于有丝分裂期的细胞与具有4C DNA含量但未进入有丝分裂的细胞（后者在碘化丙啶（PI）染色中...

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讨论

分析在细胞周期中具有短暂且特定作用的精细调控基因，需要使用均一的细胞群体。许多研究人员通常使用长期建立的肿瘤细胞系来实现这一目的，并已开发出多种方法以获得同步（或部分同步）的细胞群体，旨在将尽可能多的细胞富集于特定的细胞周期阶段。此外，人们已投入大量努力以改进和优化这些成熟的同步化方法。然而，所有细胞同步化方案均存在局限性，这些局限性可能源于细胞培养物的异质性、同步化操作效率欠佳，或化学同步剂对细胞功能产生的继发性影响等。在应用细胞同步化方案时，必须充分考虑这些限制因素。研究人员需要为其特定的细胞类型或实验选择最合适的同步化方法。即使以完全相同的方式培养不同的细胞系，其最终的同步化效果也可能因多种原因而存在差异。一方面，细胞周期的长度可能因所选细胞系的不同而有所变化；另一方面，由于各细胞系自身的特性不同，同一种抑制剂可能在不同细胞系中产生截然不同的效应25。此外，所选用的抑制剂浓度和处理时间必须针对每种细胞系进行优化，以避免或最小化非预期的细胞毒性副作用26。即使在对上述所有因素进行优化之后，也无法实现100%的细胞在某一特定细胞周期阶段的富...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Zubiaga实验室和Altmeyer实验室成员提供的有益讨论和技术支持。本工作得到了西班牙教育部基金（SAF2015-67562-R，MINECO/FEDER，UE）、巴斯克政府（IT634-13 和 KK-2015/89）以及巴斯克大学 UPV/EHU（UFI11/20）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高糖，含GutaMAX补充剂Thermo Fisher Scientific61965-059
FBS，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源Thermo Fisher Scientific10270-106
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红Thermo Fisher Scientific25200-072
胸苷SIGMAT1895-5G现配现用。轻微加热有助于溶解胸苷。
诺考达唑SIGMAM-1404以DMSO配制储存液，分装成小份，-20 ºC保存
羟基脲SIGMAH8627现配现用
来自头状链霉菌（Streptomyces caespitosus）的丝裂霉素CSIGMAM4287以无菌H2O配制1.5 mM储存液，避光，4 ºC保存
二甲基亚砜SIGMAD2650
碘化丙啶SIGMAP4170以无菌PBS配制5 mg/mL储存液，4 ºC避光保存
PBS，pH 7.6实验室自配
乙醇PANREACA3678,2500
氯仿SIGMAC2432
柠檬酸钠PANREAC131655
吐温X-100SIGMAT8787
RNase AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol试剂LifeTechnologies15596018
RNeasy Mini试剂盒QIAGEN74106
高容量cDNA反转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4368814
抗Cyclin E1抗体Cell Signaling4129以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 ºC过夜孵育
抗Cyclin B1抗体Cell Signaling4135以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 ºC过夜孵育
抗-β-肌动蛋白抗体SIGMAA-5441以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时
抗pH3（Ser 10）抗体Millipore06-570按实验方案说明使用
二抗：抗兔IgG-AlexaFluor 488InvitrogenR37116按实验方案说明使用
二抗：抗鼠IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时
人E2F1引物（正向）                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F1引物（反向）                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F7引物（正向）                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F7引物（反向）                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人p21Cip1 引物（正向）                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人p21Cip1 引物（反向）                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人TBP引物（正向），内参基因                    Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人TBP引物（反向）                    Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人Oxa1L引物（正向），内参基因   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人Oxa1L引物（反向）     CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
Power SYBR Green PCR主混合液Thermo Fisher Scientific4368702
FACS管 Sarstedt551578
MicroAmp光学96孔反应板Thermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC处理培养皿Corning
Corning Costar 6孔细胞培养板Corning3506
台式制冷微量离心机Eppendorf5415 R
台式制冷离心机Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite分光光度计Thermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur流式细胞仪BD Bioscience
QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher ScientificA28567

参考文献

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
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