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方法文章

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

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DOI：

10.3791/55745

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2017年6月6日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。

摘要

细胞周期的基因表达程序是理解细胞周期依赖性过程及其在癌症等疾病中作用的关键步骤。细胞周期调控的基因表达分析依赖于将细胞同步至特定阶段。本文描述了一种常用的方法，该方法结合了两种互补的同步化方案，用于研究细胞周期中基因表达的周期性变化。这两种方案均基于暂时性地将细胞周期阻滞在某一特定节点。通过羟基脲（hydroxyurea, HU）处理的同步化方案可使细胞停滞在G1晚期/S期早期，解除HU诱导的阻滞后，细胞群体能够均一地进入并行进于S期和G2/M期。通过胸苷和诺考达唑（thymidine and nocodazole, Thy-Noc）处理的同步化方案则将细胞阻滞在有丝分裂早期，解除Thy-Noc诱导的阻滞后，可获得适合用于G1期及S期进入研究的同步化细胞群体。这两种方案的应用均需监测细胞周期分布情况，通常在使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）对细胞染色后，通过流式细胞术分析DNA含量来实现。我们表明，联合使用这两种同步化方案是一种可靠的方法，可清晰确定在细胞周期中差异调控的基因（即 E2F1 和 E2F7）的转录谱，从而更深入理解这些基因在细胞周期过程中的作用。此外，我们还表明，该方法适用于基于药物治疗机制的研究（即 丝裂霉素C，一种抗癌剂），因为它能够区分对基因毒性药物有响应的基因与仅受药物所引起的细胞周期扰动影响的基因。

引言

细胞周期各阶段的转换与严格调控的基因表达程序相偶联。这种协调 "开和关" 细胞周期中基因转录的调控被认为由复杂的转录调控系统控制，这些系统不仅调节基因表达的时机，还调控其表达水平。关键细胞周期组分的失调已被证实与多种疾病的发生相关，并且是肿瘤发生的一个明确标志。1,2基因组范围的转录组分析在酵母和哺乳动物细胞中均已表明，大量基因在细胞周期中表现出周期性的基因表达模式，提示细胞周期中的转录波动反映了特定基因产物在精确时相中的时间需求3,4,5.

研究细胞周期调控基因表达的一个主要任务是将细胞同步至特定的细胞周期时相。细胞同步有助于解析基因表达模式与特定细胞周期时相转换之间的关联，从而加深对众多基因调控机制与功能的理解。细胞同步对于研究抗癌药物作用机制也具有重要意义，因为已知化疗药物既会影响基因表达，也会影响细胞周期动力学6,7。然而，通常难以确定经这些药物处理后所导致的基因表达差异是药物处理的直接反应，还是仅仅源于细胞周期分布变化的间接结果。为了....

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方案

1. 细胞周期同步化、释放及细胞周期进程监测

  1. 基于胸腺嘧啶和诺考达唑（Thy-Noc）的U2OS细胞有丝分裂同步化及释放
    1. 配制所需的细胞培养基。U2OS细胞常规培养于添加了10%（体积比）胎牛血清（FBS）的DMEM-谷氨酰胺培养基中（可选：1%青霉素/链霉素）。所有培养基的配制和操作均须在无菌条件下进行，并将添加了补加物的培养基（以下简称 "完全培养基"使用前将温度升至 37 °C。
    2. 种子 2 × 106 每100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基接种U2OS细胞。为计算所需培养皿数量，需注意每个100 mm培养皿通常可提供足够的有丝分裂细胞，用于重铺约5个6孔板孔（0.2 - 0.25 x 10⁶细胞/孔）。6 细胞/孔）（参见 图1B每个选定时间点需要设置两个孔（一个用于RNA提取，一个用于细胞周期监测）。此外，每个时间点可额外收集第三个孔用于蛋白质分析。
      ​注意：在晚上（约19点）接种细胞，以便后续步骤可在接下来的工作日工作时间内进行。额外设置2个未同步生长的细胞孔，用于确定流式细胞术分析的补偿参数。
    3. 让细胞贴壁，即将100 mm培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 24 小时。
    4. 对于胸腺嘧啶核苷阻断，通过将145....

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结果

细胞同步化中Thy-Noc和基于HU的方案的示意图。

图1总结了为实现U2OS细胞同步化并随后进行样品收集所需的步骤，以验证细胞周期的进程并开展基因表达分析。

磷酸化H3和PI染色是选择同步化方法的良好评估参数。

由于培养细胞本身具有异质性，每种细胞系都必须评估并优化其细胞同步化方案。有丝分裂的同步化通常采用胸苷-诺考达唑（Thy-Noc）法实现，而经诺考达唑处理后有丝分裂细胞的富集效果可通过特异性识别磷酸化组蛋白H3（pH3）的抗体进行评估，pH3是一种典型的有丝分裂标志物。通过鉴定pH3阳性细胞，可区分处于有丝分裂期的细胞与具有4C DNA含量但未进入有丝分裂的细胞（后者在碘化丙啶（PI.......

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讨论

分析在细胞周期中具有短暂且特定作用的精细调控基因，需要使用均一的细胞群体。许多研究人员通常使用长期建立的肿瘤细胞系来实现这一目的，并已开发出多种方法以获得同步（或部分同步）的细胞群体，旨在将尽可能多的细胞富集于特定的细胞周期阶段。此外，人们已投入大量努力以改进和优化这些成熟的同步化方法。然而，所有细胞同步化方案均存在局限性，这些局限性可能源于细胞培养物的异质性、同步化操作效率欠佳，或化学同步剂对细胞功能产生的继发性影响等。在应用细胞同步化方案时，必须充分考虑这些限制因素。研究人员需要为其特定的细胞类型或实验选择最合适的同步化方法。即使以完全相同的方式培养不同的细胞系，其最终的同步化效果也可能因多种原因而存在差异。一方面，细胞周期的长度可能因所选细胞系的不同而有所变化；另一方面，由于各细胞系自身的特性不同，同一种抑制剂可能在不同细胞系中产生截然不同的效应25。此外，所选用的抑制剂浓度和处理时间必须针对每种细胞系进行优化，以避免或最小化非预期的细胞毒性副作用26。即使在对上述所有因素进行优化之后，也无法实现100%的细胞在某一特定细胞周期阶段的富.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Zubiaga实验室和Altmeyer实验室成员提供的有益讨论和技术支持。本工作得到了西班牙教育部基金（SAF2015-67562-R，MINECO/FEDER，UE）、巴斯克政府（IT634-13 和 KK-2015/89）以及巴斯克大学 UPV/EHU（UFI11/20）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高糖，含GutaMAX补充剂Thermo Fisher Scientific61965-059
FBS，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源Thermo Fisher Scientific10270-106
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红Thermo Fisher Scientific25200-072
胸苷SIGMAT1895-5G现配现用。轻微加热有助于溶解胸苷。
诺考达唑SIGMAM-1404以DMSO配制储存液，分装成小份，-20 ºC保存
羟基脲SIGMAH8627现配现用
来自头状链霉菌（Streptomyces caespitosus）的丝裂霉素CSIGMAM4287以无菌H2O配制1.5 mM储存液，避光，4 ºC保存
二甲基亚砜SIGMAD2650
碘化丙啶SIGMAP4170以无菌PBS配制5 mg/mL储存液，4 ºC避光保存
PBS，pH 7.6实验室自配
乙醇PANREACA3678,2500
氯仿SIGMAC2432
柠檬酸钠PANREAC131655
吐温X-100SIGMAT8787
RNase AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol试剂LifeTechnologies15596018
RNeasy Mini试剂盒QIAGEN74106
高容量cDNA反转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4368814
抗Cyclin E1抗体Cell Signaling4129以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 ºC过夜孵育
抗Cyclin B1抗体Cell Signaling4135以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 ºC过夜孵育
抗-β-肌动蛋白抗体SIGMAA-5441以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时
抗pH3（Ser 10）抗体Millipore06-570按实验方案说明使用
二抗：抗兔IgG-AlexaFluor 488InvitrogenR37116按实验方案说明使用
二抗：抗鼠IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时
人E2F1引物（正向）                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F1引物（反向）                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F7引物（正向）                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人E2F7引物（反向）                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人p21Cip1 引物（正向）                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人p21Cip1 引物（反向）                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人TBP引物（正向），内参基因                    Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人TBP引物（反向）                    Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人Oxa1L引物（正向），内参基因   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
人Oxa1L引物（反向）     CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                Biolegio使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）
Power SYBR Green PCR主混合液Thermo Fisher Scientific4368702
FACS管 Sarstedt551578
MicroAmp光学96孔反应板Thermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC处理培养皿Corning
Corning Costar 6孔细胞培养板Corning3506
台式制冷微量离心机Eppendorf5415 R
台式制冷离心机Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite分光光度计Thermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur流式细胞仪BD Bioscience
QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher ScientificA28567

参考文献

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

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