通过两个互补细胞同步方案研究细胞周期调控的基因表达

Summary

我们报告两个细胞同步协议，提供一个上下文，用于研究与细胞周期的特定阶段相关的事件。我们表明，这种方法可用于分析未受扰动细胞周期中特定基因的调节，或暴露于影响细胞周期的试剂。

Abstract

细胞周期的基因表达程序代表了解细胞周期依赖性过程及其在疾病如癌症中的作用的关键步骤。细胞周期调节基因表达分析取决于细胞同步到特定阶段。在这里，我们描述了一种利用两种互补同步协议的方法，通常用于研究细胞周期中基因表达的周期性变化。两种方法均基于在一个限定点瞬时阻断细胞周期。羟基脲（HU）治疗的同步方案导致晚期G1 /早期S期的细胞停滞，并且从HU介导的停止释放提供通过S和G2 / M均匀进展的细胞群体。通过胸苷和诺考达唑（Thy-Noc）治疗的同步方案阻止早期有丝分裂中的细胞，并从Thy-Noc介导的停止释放提供了适合于G1期和S期的同步细胞群体尝试学习。两种方法的应用都需要监测细胞周期分布特征，这通常在细胞碘化丙啶（PI）染色后进行，流式细胞仪介导的DNA含量分析。我们表明，两个同步协议的组合使用是一种可靠的方法来清楚地确定在细胞周期中差异调节的基因（ 即 E2F1和E2F7）的转录谱，从而更好地了解它们在细胞周期中的作用流程。此外，我们显示，这种方法对于基于药物治疗（ 即丝裂霉素C，抗癌剂）的机制的研究是有用的，因为它允许区分对基因毒性因子起反应性的基因仅受细胞周期扰动影响的基因由代理人强加。

Introduction

通过细胞周期的所有阶段的过渡与紧密调节的基因表达程序相结合。认为在整个细胞周期中协调基因转录的"开"和"关"是在复杂的转录调节系统的控制之下，不仅调节时间，而且调节基因表达的水平。已知解除关键细胞周期成分的调节有助于几种疾病的发展，并且是肿瘤发生的已知标志^1,2 。在酵母和哺乳动物细胞中进行的全基因组转录组学分析显示，大量基因在细胞周期中表现出周期性的基因表达模式，表明细胞周期内的转录波动反映了给定基因产物的时间需求在精确的阶段^{3，4 ， 5} 。

研究细胞周期调节基因表达的主要任务是将细胞同步到特定的细胞周期阶段。细胞同步有助于解释基因表达模式与特定细胞周期相变的关联，并且导致更好地了解许多基因的调节和功能。细胞同步对于研究抗癌药物的作用机制也是重要的，因为已知化学治疗剂影响基因表达以及细胞周期动力学^6,7 。然而，通常难以确定由这些药剂治疗引起的基因表达差异是否是对治疗的直接反应，或者仅仅是细胞周期特征变化的结果。为了区分这些可能性，基因表达应该在已经存在的细胞中进行分析在加入化疗药物之前同步化。

除了一些原代细胞例如新鲜分离的淋巴样细胞，其构成在G0-8中同步的均质细胞群体， 体外

Protocol

细胞周期进展的细胞同步，释放和监测

1. 基于胸腺嘧啶和诺考达唑（Thy-Noc）的同步和释放的有丝分裂的U2OS细胞
   1. 准备所需的细胞培养基。 U2OS细胞通常在补充有10％（体积/体积）FBS（任选的:1％青霉素/链霉素）的DMEM-谷氨酰胺培养基中生长。在无菌条件下进行所有培养基制备和操作，并在使用前将补充培养基（从现在称为"完全培养基"）升温至37℃。
   2. 在10毫升完全培养基中每100毫升培养皿中种子2×10 ^6个 U2OS细胞。为了计算所需的培养皿数量，考虑到每个100毫米的培养皿通常提供足够的有丝分裂细胞来重新铺板6孔板的大约5个孔（0.2-0.25×10 ^6个细胞/孔）（参见图1B ）。每个选定时间点需要两口井在实验中（1孔用于RNA提取，1孔用于细胞周期监测）。另外，可以每个时间点收集第三个孔用于蛋白质分析。
      注意:晚上（晚上7点左右）的平​​板细胞，以便随后的步骤可以在后几天的工作时间内进行。包括2个异步生长细胞的孔以定义FACS分析补偿设置。
   3. 通过在37℃下在5％CO ₂的湿润气氛中孵育100毫米培养皿24小时使细胞附着。
   4. 对于胸苷块，通过将145.2mg胸苷粉末溶解在3mL H ₂ O（或等量的量）中制备200mM胸苷储液，并通过0.2μm孔径过滤器过滤灭菌溶液。稍....

Results

用于细胞同步的Thy-Noc和HU协议的示意图。

图1总结了U2OS细胞同步和随后的样品收集所需的步骤，以验证细胞周期的进展并进行基因表达分析。

Phospho-H3和PI染色是选择同步方法的良好评估参数。

由于培养细胞的固有异质性，必须对每个细胞系评估和优化细胞同步程序。通常使用Thy-Noc方案实现有丝分裂同步，并且可以用针对磷酸化组蛋白H3（pH3），典型的有丝分裂标记物特异性的抗体来评估用诺考达唑治疗后有丝分裂细胞的富集。井 pH3阳性细胞的鉴定允许区分有丝分裂细胞和不经历有丝分裂的4C-DNA含量的细胞（所有这些都通过PI染色被认为是"G2"群体）。在U2OS细胞中，Thy-N.......

Discussion

在细胞周期中涉及短暂和特异性作用的微调调节基因的分析需要均匀的细胞群体。许多研究人员通常使用长期建立的肿瘤细胞系用于这些目的，并且已经开发了多种方法以获得同步（或部分同步的）细胞群体，目的是在确定的细胞周期阶段中积累尽可能多的细胞。此外，已经作出了大量努力，以改进和优化建立良好的同步方式。然而，所有同步协议都有缺点，这可能归因于细胞培养物的异质性，同步程序的次优效率，或化学同步器在细胞功能中具有的二次效应等。应用单元同步协议时，必须考虑到这些限制。研究人员需要确定其最适合的同步方法ic细胞类型或实验。即使以完全相同的方式培养不同的细胞系，由于几个原因导致同步率可能不同。一方面，细胞周期的长度可以根据所选择的细胞系而变化;另一方面，由于每个细胞系^25的特定特征，相同的抑制剂可能对不同细胞系具有对比效应。此外，选择的抑制剂浓度和暴露时间必须总是调整到每个细胞系，以避免或最小化非所需的副毒性²⁶ 。即使在优化所有这些方面之后，在给定的细胞周期阶段中100％的细胞积累从未达到，并且在去除化学物质²⁷之后.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM，高葡萄糖，GutaMAX 补充剂	Thermo Fisher Scientific	61965-059
FBS，合格，欧盟批准，南美洲原产	Thermo Fisher Scientific	10270-106
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140-122
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x），酚红	Thermo Fisher Scientific	25200-072
胸苷	SIGMA	T1895-5G	新鲜制备。轻微的升温可能有助于溶解胸苷。
诺考达唑	SIGMA	M-1404	储备溶液在 DMSO 中储存在 -20 º小等分试样 C
羟基脲	SIGMA	H8627	新鲜制备
的丝裂霉素 C 来自链霉菌	SIGMA	M4287	1.5 mM 储备溶液，溶于无菌 H2O 中避光并储存在 4 ºC
二甲基亚砜	SIGMA	D2650
碘化丙啶	SIGMA	P4170	无菌 PBS 储备溶液，浓度为 5 mg/ml，以 4 º 储存;C 避光保护。
PBS pH 7.6			自制
乙醇	PANREAC	A3678,2500
氯仿	SIGMA	C2432
柠檬酸钠	PANREAC	131655
Triton X-100	SIGMA	T8787
RNAse A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
TRIzol 试剂	LifeTechnologies	15596018
RNeasy Mini 试剂盒	QIAGEN	74106
高容量 cDNA 逆转录试剂盒	Thermo Fisher Scientific	4368814
抗细胞周期蛋白 E1 抗体	细胞信号传导	4129	以 1：1000 的比例稀释在 5% 牛奶中，o/n，4 ºC
抗细胞周期蛋白 B1 抗体	细胞信号转导	4135	在 5% 牛奶中以 1：1000 稀释，粒数为 4 ºC
抗 β-肌动蛋白	SIGMA	A-5441	5% 牛奶中以 1：3000 稀释，1 小时，室温
抗 pH3 （Ser 10） 抗体	Millipore	06-570	在方案中指定
二抗兔 AlexaFluor 488 抗体	Invitrogen	R37116	在方案中指定
二抗小鼠 HRP 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-3697	在 5% 牛奶中以 1：3000 稀释，1 小时，RT
Forward E2F1 抗体（人）                   TGACATCACCAACGTCCTTGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
反向 E2F1 抗体（人类）                   CTGTGCGAGGTCCTGGGTC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
正向 E2F7 抗体（人类）                   GGAAAGGCAACAGCAAACTCT	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
反向 E2F7 抗体（人类）                   TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGAGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
转发 p21Cip1 antibody （human）                   AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
反向 p21Cip1 antibody （human）                   TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
正向 TBP 抗体（人类）参考基因	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
反向 TBP 抗体（人）	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site 正
向 Oxa1L 抗体（人类）参考基因  CACTTGCCAGAGATCCAGAAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool （https://eu.idtdna.com/site）
反向 Oxa1L  抗体（人）   CACAGGGAGAATGAGAGGTTTTTATAG	Biolegio		由 PrimerQuest 设计 工具 （https://eu.idtdna.com/site）
Power SYBRGreen PCR 预混液	Thermo Fisher Scientific	4368702
FACS 管	Sarstedt	551578
MicroAmp 光学 96 孔反应板	Thermo Fisher Scientific	N8010560
康宁 100 mm TC 处理培养皿	康宁
Corning Costar 细胞培养板 6 孔	康宁	3506
冷冻台式微量离心机	Eppendorf	5415 R
冷冻台式离心机 Jouan CR3.12	Jouan	743205604
NanoDrop Lite 分光光度计	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
BD FACSCalibur流式细胞仪	BD Bioscience
QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统	Thermo Fisher Scientific	A28567