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方法文章

从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

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DOI：

10.3791/55747

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2017年7月23日

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

本文内容

摘要

采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道组织中分离上皮细胞。对表面结合蛋白进行生物素标记，并利用链霉亲和素磁珠纯化，用于后续实验应用。

摘要

Rhipicephalus microplus——即牛蜱——作为多种病原体的传播媒介，是畜牧业中在经济影响方面最重要的外寄生虫。为减轻其有害影响，人们致力于控制牛蜱，尤其关注疫苗候选分子的发现，例如位于蜱肠道上皮细胞表面的BM86蛋白。目前的研究重点是利用cDNA文库和基因组文库，筛选其他潜在的疫苗候选抗原。分离蜱肠道细胞对于研究蜱肠道上皮细胞膜表面蛋白的组成具有重要意义。本文介绍了一种新颖且可行的方法，用于从部分吸血的R. microplus蜱肠道内容物中分离上皮细胞。该方案采用TCEP和EDTA将上皮细胞从上皮下支撑组织中释放，并通过不连续密度梯度离心法将上皮细胞与其他类型的细胞分离。随后，利用链霉亲和素偶联的磁珠对蜱肠道上皮细胞的细胞表面蛋白进行生物素标记并分离，从而可用于后续的FACS或LC-MS/MS分析。

引言

Rhipicephalus microplus（牛蜱）是热带和亚热带地区对养牛业造成最大经济影响的体外寄生虫，因其可传播牛蜱热（巴贝斯虫病）、边虫病和马梨形虫病1,2,3,4。尽管已投入大量努力以控制牛蜱，减轻其有害影响，但传统方法（如使用化学杀螨剂）存在固有缺陷，例如在牛奶和肉类中残留化学物质，以及化学抗性蜱虫的流行率上升5,6,7。因此，人们已开始研究替代性的蜱虫防控方法，例如利用天然抗性牛种、生物防治（生物杀虫剂）以及疫苗4,5,6,7,8,9。

在寻找可作为疫苗候选分子的蛋白质过程中，当前的研究集中于蜱虫肠道。蜱虫中肠壁由单层上皮细胞构成，该细胞层附着于一层薄的基膜上，基膜外侧形成肌肉网络。光学显微镜和电子显微镜观察表明，中肠包含三种类型的细胞：储备细胞（未分化细胞）、分泌细胞和消化细胞。细胞类型的数量随生理阶段的不同而有显著变化。分泌细胞和消化细胞均起源于储备细胞18,19,20。

构建cDNA文库以分析蜱虫肠道的组分，已成功鉴定出如Bm86等抗原蛋白，并将其视为潜在的疫苗候选分子2,3,4。糖蛋白Bm86定位于蜱虫肠道细胞表面，可在接种疫苗的牛体内诱导产生针对牛蜱（R. microplus）的保护性免疫反应。免疫宿主产生的抗Bm86 IgG抗体被蜱虫摄取后，可识别蜱虫肠道细胞表面的该抗原，进而干扰蜱虫肠道组织的功能与完整性。基于Bm86抗原的疫苗已被证明可有效防控R. microplus和Rhipicephalus annulatus，其机制是通过减少饱血雌蜱的数量、体重及其繁殖能力，从而降低后续蜱虫世代的幼虫感染率4。然而，Bm86疫苗对所有蜱虫发育阶段并不都有效，且对某些地理株系的R. microplus效果不佳，因此在牛肉和乳制品行业中这些疫苗的应用仍十分有限2,4。

从蜱虫肠道中分离上皮细胞的能力是一项重要创新，将推动相关研究的发展，以确定不同环境条件下上皮细胞蛋白质膜的组成，包括其形态学和生理学特征。本文所述方法利用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和还原剂三(2-羧乙基)膦（TCEP），使上皮层与其下方的支撑组织分离10。在通过振荡实现组织的机械性解离后，再经Percoll不连续梯度离心，即可回收上皮层。本文介绍了一种可行且新颖的蜱虫肠道上皮细胞分离技术。随后可对这些上皮细胞表面分离得到的生物素标记细胞表面蛋白，进行FACS和/或LC-MS/MS分析等下游应用分析。

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方案

1. 从微小牛蜱（R. microplus）中解离肠道上皮组织

  1. 在实验当天从牛体上采集半吸血的蜱虫，并在从宿主移除后的24小时内进行解剖。
  2. 将一条胶带粘贴在92 mm × 16 mm培养皿底部。在胶带上滴加一滴强力胶，将蜱虫腹面朝下放置于胶水上，静置2分钟使其固定。
  3. 向培养皿中加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全浸没蜱虫。
  4. 使用11号手术刀片，从蜱虫复眼顶部开始，沿两侧向下方的环状结构（festoons）方向切割。
  5. 使用无菌镊子完整移除scutum（盾板）和alloscutum（后附盾板），以暴露内部器官。
  6. 移除细小的白色丝状结构（气管）及其他膜性组织，防止污染。
  7. 用镊子夹住肠道上部，从虫体残骸中拉出整个肠道。彻底清除残留的肠道组织，并确保未混入其他组织。
  8. 将肠道置于含蛋白酶抑制剂混合液（PIC）但不含氯化钙和硫酸镁的冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。用干冰速冻肠道，并在-20 °C下保存。
    注意：有关蜱虫肠道解剖及内部器官结构的详细信息，请参见D. Sonenshine所著《蜱虫生物学》第3.1章19。

2. 上皮细胞解离

  1. 将解剖好的肠道倒入置于50 mL离心管内的70 µm细胞筛中。
  2. 用50 mL冰浴的含蛋白酶抑制剂（PIC）的HBSS冲洗肠道组织，直至流出液澄清，肠道呈现白色或透明状。
  3. 将肠道重悬于30 mL冰浴的含PIC的HBSS中，轻轻混匀后，在4 °C下以500 × g离心10分钟，沉淀肠道组织。吸除上清液，并重复洗涤三次。
  4. 为分离肠上皮细胞，将肠道组织重悬于10 mL细胞培养基中（DMEM培养基，含2%胎牛血清（FCS）、0.5 mM EDTA、1 mM TCEP及PIC），在37 °C下以6 rpm缓慢旋转孵育60分钟。
  5. 将悬液先经250 µm细胞筛过滤，涡旋混匀滤过液后，再通过70 µm细胞筛过滤，收集滤过液。
  6. 在4 °C下以500 × g离心20分钟，沉淀获得单细胞悬液。

3. 利用密度梯度离心法分离单个上皮细胞

  1. 制备密度梯度离心液例如，Percoll）通过AP15预滤纸过滤。用mqH₂O配制40%和20%的Percoll溶液20（v/v）并冷却 4 °C 在制备梯度前1小时。
  2. 使用蠕动泵以最低流速将3 mL 40%密度的离心梯度液加入一支16 mL超速离心管中，置于冰上静置15分钟。泵的流速应确保 <1 mL/min 的流速。
  3. 将试管倾斜至 45° 角度，使用蠕动泵将20%密度的离心梯度液加在40%层的上方。泵的速度应导致 <1 mL/min 的流速。将各层置于冰上静置 15 min。
  4. 使用蠕动泵在 <以每分钟1 mL的流速，将含蜱肠细胞的3 mL DMEM培养基铺加到20-40%密度梯度离心介质上。
  5. 将离心机设置为最大加速度和最小减速度。在600 × g条件下离心10分钟。收集DMEM:20%密度梯度离心层与20%:40%密度梯度离心层之间的界面相，以分离上皮单细胞。将收集的界面相储存于 4 °C 用于后续分析。

4. 细胞分离效果的评估

  1. 血细胞计数板
    1. 用酒精清洁血细胞计数板载玻片。
    2. 通过轻柔吹打使细胞重悬，取100 µL细胞悬液加入1.5 mL微量离心管中。
    3. 加入400 µL 0.4%台盼蓝溶液，轻轻弹击管壁混匀。
    4. 取100 µL经台盼蓝处理的细胞悬液，缓慢填充血细胞计数板的两个计数室。
    5. 将血细胞计数板置于光学显微镜下，使用10倍物镜对准计数板的网格线进行聚焦。
    6. 使用手持计数器，统计一组16个方格内的活细胞（未染色细胞）数量；在同一组方格内，同时统计蓝色的死细胞数量。重复计数，直至完成四组16个方格的统计。
    7. 使用以下公式计算每毫升细胞总数：
      细胞计数公式：每毫升总细胞数 = (计数的总细胞数 × 稀释倍数 / 方格数) × 10,000。
    8. 使用以下公式计算细胞活力百分比：
      细胞活力公式：细胞活力 = 计数的活细胞数 / 计数的总细胞数，数学表达式。
  2. 细胞分离物可视化
    1. 在1.5 mL微量离心管中，将1 µL分离的细胞与9 µL HBSS稀释液混合，轻弹管壁混匀。
    2. 取5 µL HBSS中的分离细胞滴加至玻璃载玻片中央，加入三滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂。
    3. 室温孵育5分钟，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
    4. 在荧光显微镜下，以360 nm激发波长和460 nm发射波长观察DAPI染色的细胞。

5. 细胞表面蛋白生物素标记

  1. 按照制造商说明书，使用生物素（A型）偶联试剂盒，以1:1的表面蛋白与偶联物摩尔比，对100 µL单细胞上皮细胞进行生物素标记。
  2. 进行细胞裂解时，向生物素标记的细胞中加入100 µL PBS、1% Triton X-100、10%甘油、100 µM氧化型谷胱甘肽以及蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。在冰上孵育1小时，每10分钟轻柔混匀一次。
  3. 将生物素标记的细胞在4 °C下以20,000 × g离心20分钟，沉淀不溶性物质。收集含有胞质蛋白和生物素标记膜蛋白的上清液。
  4. 使用Bradford法测定蛋白浓度。

6. 生物素化表面蛋白的分离

  1. 向一个1.5 mL微量离心管中加入50 µL链霉亲和素磁珠。
  2. 将试管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁一侧，吸除并弃去上清液。
  3. 向试管中加入1000 µL TBS缓冲液（含0.1% Tween-20），轻轻混匀后置于磁力架上收集磁珠，吸除并弃去上清液。
  4. 将40 µg生物素标记的细胞表面蛋白（用1×PBS稀释至300 µL）与洗涤后的磁珠混合，室温下振荡孵育2小时。
  5. 将试管置于磁力架上收集磁珠，吸除并弃去上清液。
  6. 向试管中加入300 µL TBS缓冲液（含0.1% Tween-20），轻轻混匀以重新悬浮磁珠，置于磁力架上收集磁珠，吸除并弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。
  7. 向磁珠中加入100 µL 0.1 M甘氨酸（pH 2.0），室温孵育5分钟，收集磁珠，并收集含有洗脱的生物素化表面蛋白的上清液。
  8. 在4–20% Tris-MOPS SDS-PAGE凝胶上检测分离的表面蛋白。

7. 生物素化表面蛋白的检测

  1. 点印迹法
    1. 裁剪一条 7 cm × 3 cm 的硝酸纤维素膜。
    2. 在膜上分别点加 10 µg 总蜱肠内容物（来自上述 1.8）和 10 µg 生物素标记的表面蛋白。室温下干燥 15 分钟。
    3. 将膜转移至容器中，浸入 100 mL 封闭缓冲液。室温下振荡孵育 1 小时，弃去封闭缓冲液。
    4. 用 100 µL PBS 含 0.05% Tween-20 洗涤硝酸纤维素膜，振荡 5 分钟。弃去洗涤液，重复洗涤三次。
    5. 加入 100 µL PBS 含 0.05% Tween-20 的 1/5000 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP），室温下振荡孵育 2 小时，弃去剩余溶液。
    6. 用 100 µL PBS 含 0.05% Tween-20 洗涤硝酸纤维素膜，振荡 5 分钟。弃去洗涤液，重复洗涤三次。
    7. 检测时，将 1 片 4-氯-1-萘酚溶解于 10 mL 冰甲醇中。取 4 mL 甲醇储备液加入 20 mL TBS 中，再加入 10 µL 新鲜的 30% 过氧化氢，立即加至硝酸纤维素膜上。
    8. 室温下振荡孵育，直至底物产生不溶性蓝色终产物。此过程可能需要 2–15 分钟。
    9. 弃去检测液，用 100 µL mqH2O 洗涤膜三次。
  2. ELISA 检测
    1. 用 400 µL 100 mM 碳酸盐包被缓冲液稀释每种样品至 200 ng，并包被 ELISA 板第一行（A#）的两个孔（平底孔）。
    2. 在其余各列（B–H 行）对应的每个孔中加入 100 µL 100 mM 碳酸盐包被缓冲液。
    3. 通过移液器从 A 行各孔中取 100 µL 加入 B 行，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。依次逐行进行系列稀释，最后从 H 行各孔中弃去 100 µL。
    4. 用封口膜覆盖板子，4 °C 过夜孵育。
    5. 每孔加入 200 µL PBS 含 0.05% Tween-20，洗涤三次。
    6. 向包被孔中加入 200 µL 封闭缓冲液，封口膜封盖，4 °C 过夜孵育。
    7. 用封闭缓冲液将链霉亲和素-HRP 按 1/15,000 稀释，每孔加入 100 µL。封口膜封盖，4 °C 过夜孵育。
    8. 每孔加入 200 µL PBS 含 0.05% Tween-20，洗涤五次。
    9. 检测时，每孔加入 100 µL TMB 试剂。显色充分后（通常为 10–15 分钟），每孔加入 100 µL 1 M 磷酸终止反应。
    10. 在波长 λ = 450 nm 处读取各孔的吸光度。

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结果

从肠道组织中分离出上皮细胞 R. microplus 如示意图所示 图1. 采用本实验方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微镜图像如图所示 图 2A 和 2B. 由于细胞分离是在半饱血状态下进行的 微小牛蜱， 细胞在样品中呈现为单个、球形、表面光滑且大小均一的形态。随着蜱虫发育至完全吸血的成虫阶段，肠道细胞群体在大小和类型上的差异变得更加明显。

使用 DAPI 对分离的上皮细胞核进行荧光染色有助于观察细胞。较差的分离结果表现为上皮细胞解离不完全，通过不同的细胞大小和形态可识别出不同的细胞群体（图2C 和 <...

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讨论

牛蜱感染是全球热带和亚热带地区养牛业面临的主要问题，目前最常用的防控方法依赖于杀螨剂的使用1,4。Bm86此前被发现在蜱肠道上皮表面表达，是一种针对R. microplus感染的保护性抗原10，但由于Bm86存在地理来源相关的序列变异以及需要定期加强免疫，该疫苗策略的效果有限4。

以往关于上皮细胞分离方法的研究主要集中于脊椎动物或昆虫物种9,11,12,13,14。例如，早期尝试利用哺乳动物技术分离中肠时发现，由于细胞结构和组织方式...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢澳大利亚昆士兰州农业与渔业部生物安全蜱虫保种中心提供本研究所用的微小牛蜱（Rhipicephalus microplus），并感谢Lucas Karbanowicz在视频拍摄过程中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝赛默飞世尔科技15250061
1.5 mL 微量离心管Eppendorf3322
100 mM 碳酸盐缓冲液3.03 g Na2CO3，6.0 g NaHCO3，加蒸馏水至1000 ml，pH 9.6
带密封盖的16 mL离心管赛默飞世尔科技3138-0016在梯度前置于冰上冷却
250 µM细胞滤筛赛默飞世尔科技87791
3,3′,5,5′-ELISA用四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统SigmaT04404°C 下保存
30% 过氧化氢实验室实景BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS 凝胶Gen ScriptM42015
4-氯-1-萘酚片Sigma-AldrichC6788
50 mL Falcon管康宁蓝30 x 115毫米规格。聚丙烯锥形管。
70 µM细胞滤网BD Falcon352350
AP15 滤纸MilliporeAO1504200
生物素（A型）偶联试剂盒AbcamAb102865
解剖显微镜奥林巴斯SZX7
DP 管理员 Olympus2.2.1.195细胞成像软件
医用胶带家庭维修工48 mm × 25 mm 胶带
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基Gibco11995-065DMEM - 冰冷用于实验方案
EDTAAmresco0105-500G
F96 Maxisorp 免疫板Nunc439454
胎牛血清Sigma-Aldrich12003CFCS
荧光显微镜  Olympus BX51
含 DAPI 的 FluoroshieldSigma-AldrichF6057-20MLDAPI
镊子Dumont#9 Dumont - 瑞士
甘油Sigma-AldrichG5516分子生物学用甘油 >99%
甘氨酸Sigma-Aldrich410225
手持计数器办公用品JA0376230
汉克’s 平衡盐溶液Sigma生命科学H9394HBSS – 冰冻状态以用于实验方案
血细胞计数板奥普蒂克·拉科尔--
氧化型L-谷胱甘肽Sigma-AldrichG4376
磁力分离架Novagen-4管磁力分离架
甲醇Sigma-Aldrich179337
Milli-Q 水MilliporeZRXQ003WW用于超纯水制备的一体化水净化系统
硝酸纤维素膜生命科学6648530 cm × 3 M 纯硝酸纤维素膜
PageRuler 预染蛋白质标准品Thermo-FisherSM0671
PBS1.16 g Na2HPO4，0.1 g KCl，0.1 g K3PO4，4.0 g NaCl（500 ml 蒸馏水），pH 7.4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
蠕动泵Masterflex7518-10
磷酸Sigma-AldrichP6560
Pierce 无蛋白 T20 PBS 封闭缓冲液赛默飞世尔科技375734°C 下保存。封闭缓冲液
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8215-5MLPIC – 储存于 -20 °C
快速起始 Bradford 染料试剂 1x伯乐（Bio-Rad）500-0205用于 Bradford 测定
快速启动 BSA 标准品伯乐（Bio-Rad）500-0207Bradford 法测定 BSA 标准品
手术刀实验室。Co11号手术刀
SilverQuest™ 染色试剂盒InvitrogenLC6070
Simply Blue TM Safe Stain InvitrogenLC6060
Sorvall C6+ 超速离心机赛默飞世尔科技46910
链霉亲和素（HRP）AbcamAB7403
链霉亲和素磁珠New England BiolabsS1420S
超级胶水 - 超快迷你型UHUUHU 超级胶水 1 毫克，超快速迷你装
台式离心机Eppendorf22331
TCEP赛默飞世尔科技20490
Triton X-100伯乐（Biorad）161-0407
Tween-20SigmaP2287-500ML
涡旋混合器RatekVM1
水浴锅资助GD100

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