从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

摘要

采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道组织中分离上皮细胞。对表面结合蛋白进行生物素标记，并利用链霉亲和素磁珠纯化，用于后续实验应用。

摘要

Rhipicephalus microplus——即牛蜱——作为多种病原体的传播媒介，是畜牧业中在经济影响方面最重要的外寄生虫。为减轻其有害影响，人们致力于控制牛蜱，尤其关注疫苗候选分子的发现，例如位于蜱肠道上皮细胞表面的BM86蛋白。目前的研究重点是利用cDNA文库和基因组文库，筛选其他潜在的疫苗候选抗原。分离蜱肠道细胞对于研究蜱肠道上皮细胞膜表面蛋白的组成具有重要意义。本文介绍了一种新颖且可行的方法，用于从部分吸血的R. microplus蜱肠道内容物中分离上皮细胞。该方案采用TCEP和EDTA将上皮细胞从上皮下支撑组织中释放，并通过不连续密度梯度离心法将上皮细胞与其他类型的细胞分离。随后，利用链霉亲和素偶联的磁珠对蜱肠道上皮细胞的细胞表面蛋白进行生物素标记并分离，从而可用于后续的FACS或LC-MS/MS分析。

引言

Rhipicephalus microplus（牛蜱）是热带和亚热带地区对养牛业造成最大经济影响的体外寄生虫，因其可传播牛蜱热（巴贝斯虫病）、边虫病和马梨形虫病^1,2,3,4。尽管已投入大量努力以控制牛蜱，减轻其有害影响，但传统方法（如使用化学杀螨剂）存在固有缺陷，例如在牛奶和肉类中残留化学物质，以及化学抗性蜱虫的流行率上升^5,6,7。因此，人们已开始研究替代性的蜱虫防控方法，例如利用天然抗性牛种、生物防治（生物杀虫剂）以及疫苗^4,5,6,7,8,9。

在寻找可作为疫苗候选分子的蛋白质过程中，当前的研究集中于蜱虫肠道。蜱虫中肠壁由单层上皮细胞构成，该细胞层附着于一层薄的基膜上，基膜外侧形成肌肉网络。光学显微镜和电子显微镜观察表明，中肠包含三种类型的细胞：储备细胞（未分化细胞）、分泌细胞和消化细胞。细胞类型的数量随生理阶段的不同而有显著变化。分泌细胞和消化细胞均起源于储备细胞^18,19,20。

构建cDNA文库以分析蜱虫肠道的组分，已成功鉴定出如Bm86等抗原蛋白，并将其视为潜在的疫苗候选分子^2,3,4。糖蛋白Bm86定位于蜱虫肠道细胞表面，可在接种疫苗的牛体内诱导产生针对牛蜱（R. microplus）的保护性免疫反应。免疫宿主产生的抗Bm86 IgG抗体被蜱虫摄取后，可识别蜱虫肠道细胞表面的该抗原，进而干扰蜱虫肠道组织的功能与完整性。基于Bm86抗原的疫苗已被证明可有效防控R. microplus和Rhipicephalus annulatus，其机制是通过减少饱血雌蜱的数量、体重及其繁殖能力，从而降低后续蜱虫世代的幼虫感染率⁴。然而，Bm86疫苗对所有蜱虫发育阶段并不都有效，且对某些地理株系的R. microplus效果不佳，因此在牛肉和乳制品行业中这些疫苗的应用仍十分有限^2,4。

从蜱虫肠道中分离上皮细胞的能力是一项重要创新，将推动相关研究的发展，以确定不同环境条件下上皮细胞蛋白质膜的组成，包括其形态学和生理学特征。本文所述方法利用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和还原剂三(2-羧乙基)膦（TCEP），使上皮层与其下方的支撑组织分离¹⁰。在通过振荡实现组织的机械性解离后，再经Percoll不连续梯度离心，即可回收上皮层。本文介绍了一种可行且新颖的蜱虫肠道上皮细胞分离技术。随后可对这些上皮细胞表面分离得到的生物素标记细胞表面蛋白，进行FACS和/或LC-MS/MS分析等下游应用分析。

方案

1. 从微小牛蜱（R. microplus）中解剖肠道上皮

1. 在实验当天从牛体上采集半吸血的蜱虫，并在从宿主移除后的24小时内进行解剖。
2. 将一段 duct tape（封箱胶带）粘贴在92 mm × 16 mm 的培养皿底部。在胶带上滴加一滴瞬间胶水。将蜱虫腹面朝下放置于胶水上，静置2分钟使其干燥固定。
3. 向培养皿中加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全浸没蜱虫。
4. 使用11号手术刀片，从蜱虫眼的顶部开始，沿两侧向下切割至基部的 festoons（缘褶）。
5. 用无菌镊子完整移除scutum（盾板）和alloscutum（后附盾板），以暴露内部器官。
6. 移除细小的白色丝状器官（气管）及其他膜状结构，防止污染。
7. 用镊子夹住肠道上部，从尸体中拉出整个肠道。清除所有残留的肠道组织，确保未混杂其他组织。
8. 将肠道置于含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）但不含氯化钙和硫酸镁的冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。将肠道在干冰上速冻后，于-20 °C保存。
   注：有关蜱虫肠道解剖及内部器官结构的详细信息，请参见D. Sonenshine所著《蜱类生物学》第3.1章¹⁹。

2. 上皮细胞解离

1. 将解剖后的肠道组织倒入置于50 mL离心管内的70 µm细胞滤筛中。
2. 用50 mL含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的冰上预冷的HBSS冲洗肠道组织，直至流出液澄清，肠道呈现白色或透明状。
3. 将肠道组织重悬于30 mL含PIC的冰上预冷HBSS中，轻轻混匀后，在4 °C下以500 × g离心10分钟以沉淀肠道组织。吸除上清液，并重复洗涤过程三次。
4. 为分离上皮细胞，将肠道组织重悬于10 mL细胞培养基中（含DMEM、2%胎牛血清（FCS）、0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）及PIC），于37 °C下以6 rpm缓慢旋转孵育60分钟。
5. 将悬液先通过250 µm细胞滤筛过滤，涡旋收集的滤过液，再通过70 µm细胞滤筛过滤，收集最终滤过液。
6. 将细胞悬液在4 °C下以500 × g离心20分钟，沉淀获得单细胞。

3. 使用密度梯度离心法分离单个上皮细胞

1. 制备密度梯度离心液例如，Percoll）通过AP15预滤纸过滤。用mqH₂O配制40%和20%的Percoll溶液₂0（v/v），并在4 °C下冷却1小时，然后进行梯度分层。
2. 使用蠕动泵（调至最低转速），将3 mL 40%密度的离心梯度液加入一支16 mL超速离心管中，置于冰上静置15分钟。泵的流速应确保 <1 mL/min 的流速。
3. 将离心管倾斜至45°角，使用蠕动泵将20%密度的离心梯度液加在40%层的上方。泵的流速应控制为 <1 mL/min 的流速。将各层置于冰上静置 15 分钟。
4. 使用蠕动泵于 <以每分钟1 mL的流速，将含蜱肠细胞的3 mL DMEM培养基铺加至20-40%密度梯度离心液上层。
5. 将离心机设置为最大加速度和最小减速度。在600 × g下离心10分钟。收集DMEM:20%密度离心梯度与20%:40%密度离心梯度之间的界面层，以分离上皮单细胞。将收集的界面层于4 °C保存，用于后续分析。

4. 细胞分离的评估

1. 血细胞计数板
   1. 用酒精清洁血细胞计数板载玻片。
   2. 通过轻轻吹打使细胞重新悬浮，吸取100 µL细胞悬液，加入1.5 mL微量离心管中。
   3. 加入400 µL 0.4% 台盼蓝溶液，轻轻弹动离心管使其混匀。
   4. 吸取100 µL经台盼蓝处理的细胞悬液，缓慢填充血细胞计数板的两个计数室。
   5. 将血细胞计数板置于光学显微镜下，使用10倍物镜对焦至计数板的网格线。
   6. 使用手持计数器，统计一组16个方格内的未染色活细胞数量；在同一组方格内，同时统计被染成蓝色的死细胞数量。重复计数，直至完成四组16个方格的计数。
   7. 使用以下公式计算每毫升的总细胞数：
      
   8. 使用以下公式计算细胞活力百分比：
      
2. 细胞分离物可视化
   1. 在1.5 mL微量离心管中，将1 µL分离的细胞与9 µL HBSS混合稀释，轻轻弹动离心管使其混匀。
   2. 吸取5 µL HBSS中的分离细胞，滴加至载玻片中央，再加入三滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质。
   3. 室温孵育5分钟，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
   4. 在荧光显微镜下，以360 nm激发波长和460 nm发射波长观察DAPI染色的细胞。

5. 细胞表面蛋白生物素标记

1. 使用生物素（A型）偶联试剂盒，按照生产商说明书，以1:1的表面蛋白与偶联物摩尔比，对100 µL单细胞上皮细胞进行生物素标记。
2. 进行细胞裂解时，向生物素标记的细胞中加入100 µL PBS、1% Triton X-100、10%甘油、100 µM氧化型谷胱甘肽以及蛋白酶抑制剂混合物（PIC），在冰上孵育1小时，每10分钟轻柔混匀一次。
3. 将生物素标记的细胞在4 °C下以20,000 × g离心20分钟，沉淀不溶性物质，收集含有胞质蛋白和生物素标记膜蛋白的上清液。
4. 使用Bradford法测定蛋白浓度。

6. 生物素标记表面蛋白的分离

1. 向一个 1.5 mL 微量离心管中加入 50 µL 链霉亲和素磁珠。
2. 将试管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁一侧。移除并弃去上清液。
3. 向试管中加入 1000 µL TBS 缓冲液（含 0.1% Tween-20），轻轻混匀后置于磁力架上收集磁珠。移除并弃去上清液。
4. 将 40 µg 生物素标记的细胞表面蛋白（用 1× PBS 稀释至 300 µL）与洗涤后的磁珠混合。室温下振荡孵育 2 小时。
5. 将磁珠置于磁力架上收集，移除并弃去上清液。
6. 向试管中加入 300 µL TBS 缓冲液（含 0.1% Tween-20），轻轻混匀以重新悬浮磁珠。置于磁力架上收集磁珠，移除并弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。
7. 向磁珠中加入 100 µL 0.1 M 甘氨酸（pH 2.0），室温孵育 5 分钟。收集磁珠，并收集含有洗脱的生物素化表面蛋白的上清液。
8. 在 4–20% Tris-MOPS SDS-PAGE 凝胶上检测分离的表面蛋白。

7. 生物素化表面蛋白的检测

1. 点印迹杂交
   1. 裁剪一条 7 cm × 3 cm 的硝酸纤维素膜。
   2. 在膜上分别点加 10 µg 总蜱肠道内容物（来自上述 1.8）和 10 µg 生物素标记的表面蛋白。室温下干燥 15 分钟。
   3. 将膜转移至容器中，浸入 100 mL 封闭缓冲液。室温下振荡孵育 1 小时，弃去封闭缓冲液。
   4. 用 100 µL PBS、0.05% Tween-20 振荡洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟，弃去洗涤液，重复洗涤三次。
   5. 加入 100 µL PBS、0.05% Tween-20 配制的 1/5000 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP），室温振荡孵育 2 小时，弃去未结合的溶液。
   6. 用 100 µL PBS、0.05% Tween-20 振荡洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟，弃去洗涤液，重复洗涤三次。
   7. 检测时，将 1 片 4-氯-1-萘酚溶解于 10 mL 冰甲醇中。取 4 mL 甲醇储备液加入 20 mL TBS 中，再加入 10 µL 新鲜的 30% 过氧化氢，立即加至硝酸纤维素膜上。
   8. 室温振荡孵育，直至底物产生不溶性蓝色终产物，通常需要 2–15 分钟。
   9. 弃去检测液，用 100 µL mqH₂O 洗涤膜三次。
2. ELISA 检测
   1. 将每种样品 200 ng 用 400 µL 100 mM 碳酸盐包被缓冲液稀释，并包被 ELISA 板第一行（A#）的两个孔（平底孔）。
   2. 向其余各行（B–H）对应的每个孔中加入 100 µL 100 mM 碳酸盐包被缓冲液。
   3. 通过移液器从 A 行各孔中吸取 100 µL 液体转移至 B 行，轻柔吹打混匀，避免产生气泡。依次进行系列稀释，至 H 行时弃去每孔最后的 100 µL。
   4. 用封口膜覆盖酶标板，4 °C 过夜孵育。
   5. 每孔加入 200 µL PBS、0.05% Tween-20，洗涤三次。
   6. 向包被孔中加入 200 µL 封闭缓冲液，封口膜覆盖，4 °C 过夜孵育。
   7. 用封闭缓冲液将链霉亲和素-HRP 稀释至 1/15,000，每孔加入 100 µL，封口膜覆盖，4 °C 过夜孵育。
   8. 每孔加入 200 µL PBS、0.05% Tween-20，洗涤五次。
   9. 检测时，每孔加入 100 µL TMB 试剂。显色充分后（通常为 10–15 分钟），每孔加入 100 µL 1 M 磷酸终止反应。
   10. 在波长 λ = 450 nm 处读取各孔的吸光度。

结果

从肠道组织中分离上皮细胞 R. microplus 如示意图所示 图1. 采用本实验方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微图像如下所示 图2A 和 2B. 细胞分离在半饱血状态下进行 微小牛蜱 细胞在样品中呈现为单个、球形、表面光滑且大小均一的形态。随着蜱虫发育为完全饱血的成虫，肠道细胞群体在大小和类型上的差异变得更加明显。

使用DAPI对分离的上皮细胞核进行荧光染色有助于观察细胞。较差的分离结果表现为上皮细胞解离不完全，通过细胞大小和形态的差异可识别出不同的细胞群体（图2C 和 2D

讨论

牛蜱感染是全球热带和亚热带地区养牛业面临的主要问题，目前最常用的防控方法依赖于杀螨剂的使用^1,4。Bm86此前被发现在蜱肠道上皮表面表达，是一种针对R. microplus感染的保护性抗原¹⁰，但由于Bm86存在地理来源相关的序列变异以及需要定期加强免疫，该疫苗策略的效果有限⁴。

以往关于上皮细胞分离方法的研究主要集中于脊椎动物或昆虫物种^{9,11,12,13,14}。例如，早期尝试利用哺乳动物技术分离中肠时发现，由于细胞结构和组织方式...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝	赛默飞世尔科技	15250061
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	3322
100 mM 碳酸盐缓冲液			3.03 g Na2CO3，6.0 g NaHCO3，加蒸馏水至1000 ml，pH 9.6
带密封盖的16 mL离心管	赛默飞世尔科技	3138-0016	在梯度前置于冰上冷却
250 µM细胞滤筛	赛默飞世尔科技	87791
3,3′,5,5′-ELISA用四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统	Sigma	T0440	4°C 下保存
30% 过氧化氢	实验室实景	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS 凝胶	Gen Script	M42015
4-氯-1-萘酚片	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon管	康宁蓝		30 x 115毫米规格。聚丙烯锥形管。
70 µM细胞滤网	BD Falcon	352350
AP15 滤纸	Millipore	AO1504200
生物素（A型）偶联试剂盒	Abcam	Ab102865
解剖显微镜	奥林巴斯	SZX7
DP 管理员	Olympus	2.2.1.195	细胞成像软件
医用胶带	家庭维修工		48 mm × 25 mm 胶带
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	Gibco	11995-065	DMEM - 冰冷用于实验方案
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp 免疫板	Nunc	439454
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
荧光显微镜	Olympus	BX51
含 DAPI 的 Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
镊子	Dumont		#9 Dumont - 瑞士
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	分子生物学用甘油 >99%
甘氨酸	Sigma-Aldrich	410225
手持计数器	办公用品	JA0376230
汉克’s 平衡盐溶液	Sigma生命科学	H9394	HBSS – 冰冻状态以用于实验方案
血细胞计数板	奥普蒂克·拉科尔	-	-
氧化型L-谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4376
磁力分离架	Novagen	-	4管磁力分离架
甲醇	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q 水	Millipore	ZRXQ003WW	用于超纯水制备的一体化水净化系统
硝酸纤维素膜	生命科学	66485	30 cm × 3 M 纯硝酸纤维素膜
PageRuler 预染蛋白质标准品	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4，0.1 g KCl，0.1 g K3PO4，4.0 g NaCl（500 ml 蒸馏水），pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
蠕动泵	Masterflex	7518-10
磷酸	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce 无蛋白 T20 PBS 封闭缓冲液	赛默飞世尔科技	37573	4°C 下保存。封闭缓冲液
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – 储存于 -20 °C
快速起始 Bradford 染料试剂 1x	伯乐（Bio-Rad）	500-0205	用于 Bradford 测定
快速启动 BSA 标准品	伯乐（Bio-Rad）	500-0207	Bradford 法测定 BSA 标准品
手术刀	实验室。Co		11号手术刀
SilverQuest™ 染色试剂盒	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ 超速离心机	赛默飞世尔科技	46910
链霉亲和素（HRP）	Abcam	AB7403
链霉亲和素磁珠	New England Biolabs	S1420S
超级胶水 - 超快迷你型	UHU		UHU 超级胶水 1 毫克，超快速迷你装
台式离心机	Eppendorf	22331
TCEP	赛默飞世尔科技	20490
Triton X-100	伯乐（Biorad）	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
涡旋混合器	Ratek	VM1
水浴锅	资助	GD100