从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

摘要

采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道组织中分离上皮细胞。对表面结合蛋白进行生物素标记，并利用链霉亲和素磁珠纯化，用于后续实验应用。

摘要

Rhipicephalus microplus——即牛蜱——作为多种病原体的传播媒介，是畜牧业中在经济影响方面最重要的外寄生虫。为减轻其有害影响，人们致力于控制牛蜱，尤其关注疫苗候选分子的发现，例如位于蜱肠道上皮细胞表面的BM86蛋白。目前的研究重点是利用cDNA文库和基因组文库，筛选其他潜在的疫苗候选抗原。分离蜱肠道细胞对于研究蜱肠道上皮细胞膜表面蛋白的组成具有重要意义。本文介绍了一种新颖且可行的方法，用于从部分吸血的R. microplus蜱肠道内容物中分离上皮细胞。该方案采用TCEP和EDTA将上皮细胞从上皮下支撑组织中释放，并通过不连续密度梯度离心法将上皮细胞与其他类型的细胞分离。随后，利用链霉亲和素偶联的磁珠对蜱肠道上皮细胞的细胞表面蛋白进行生物素标记并分离，从而可用于后续的FACS或LC-MS/MS分析。

引言

Rhipicephalus microplus（牛蜱）是热带和亚热带地区对养牛业造成最大经济影响的体外寄生虫，因其可传播牛蜱热（巴贝斯虫病）、边虫病和马梨形虫病^1,2,3,4。尽管已投入大量努力以控制牛蜱，减轻其有害影响，但传统方法（如使用化学杀螨剂）存在固有缺陷，例如在牛奶和肉类中残留化学物质，以及化学抗性蜱虫的流行率上升^5,6,7。因此，人们已开始研究替代性的蜱虫防控方法，例如利用天然抗性牛种、生物防治（生物杀虫剂）以及疫苗^4,5,6,7,8,9。

方案

1. 从微小牛蜱（R. microplus）中解剖肠道上皮

1. 在实验当天从牛体上采集半吸血的蜱虫，并在从宿主移除后的24小时内进行解剖。
2. 将一段 duct tape（封箱胶带）粘贴在92 mm × 16 mm 的培养皿底部。在胶带上滴加一滴瞬间胶水。将蜱虫腹面朝下放置于胶水上，静置2分钟使其干燥固定。
3. 向培养皿中加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全浸没蜱虫。
4. 使用11号手术刀片，从蜱虫眼的顶部开始，沿两侧向下切割至基部的 festoons（缘褶）。
5. 用无菌镊子完整移除scutum（盾板）和alloscutum（后附盾板），以暴露内部器官。
6. 移除细小的白色丝状器官（气管）及其他膜状结构，防止污染。
7. 用镊子夹住肠道上部，从尸体中拉出整个肠道。清除所有残留的肠道组织，确保未混杂其他组织。
8. 将肠道置于含蛋白酶抑制剂混合物（PIC）但不含氯化钙和硫酸镁的冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。将肠道在干冰上速冻后，于-20 °C保存。
   注：有关蜱虫肠道解剖及内部器官结构的详细信息，请参见D. Sonenshine所著《蜱类生物学》第3.1章¹⁹。

2. 上皮细胞....

结果

从肠道组织中分离上皮细胞 R. microplus 如示意图所示 图1. 采用本实验方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微图像如下所示 图2A 和 2B. 细胞分离在半饱血状态下进行 微小牛蜱 细胞在样品中呈现为单个、球形、表面光滑且大小均一的形态。随着蜱虫发育为完全饱血的成虫，肠道细胞群体在大小和类型上的差异变得更加明显。

使用DAPI对分离的上皮细胞核进行荧光染色有助于观察细胞。较差的分离结果表现为上皮细胞解离不完全，通过细胞大小和形态的差异可识别出不同的细胞群体（图2C 和 2D

讨论

牛蜱感染是全球热带和亚热带地区养牛业面临的主要问题，目前最常用的防控方法依赖于杀螨剂的使用^1,4。Bm86此前被发现在蜱肠道上皮表面表达，是一种针对R. microplus感染的保护性抗原¹⁰，但由于Bm86存在地理来源相关的序列变异以及需要定期加强免疫，该疫苗策略的效果有限⁴。

以往关于上皮细胞分离方法的研究主要集中于脊椎动物或昆虫物种^{9,11,12,13,14}。例如，早期尝试利用哺乳动物技术分离中肠时发现，由于细胞结构和组织方式.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝	赛默飞世尔科技	15250061
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	3322
100 mM 碳酸盐缓冲液			3.03 g Na2CO3，6.0 g NaHCO3，加蒸馏水至1000 ml，pH 9.6
带密封盖的16 mL离心管	赛默飞世尔科技	3138-0016	在梯度前置于冰上冷却
250 µM细胞滤筛	赛默飞世尔科技	87791
3,3′,5,5′-ELISA用四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统	Sigma	T0440	4°C 下保存
30% 过氧化氢	实验室实景	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS 凝胶	Gen Script	M42015
4-氯-1-萘酚片	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon管	康宁蓝		30 x 115毫米规格。聚丙烯锥形管。
70 µM细胞滤网	BD Falcon	352350
AP15 滤纸	Millipore	AO1504200
生物素（A型）偶联试剂盒	Abcam	Ab102865
解剖显微镜	奥林巴斯	SZX7
DP 管理员	Olympus	2.2.1.195	细胞成像软件
医用胶带	家庭维修工		48 mm × 25 mm 胶带
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	Gibco	11995-065	DMEM - 冰冷用于实验方案
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp 免疫板	Nunc	439454
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
荧光显微镜	Olympus	BX51
含 DAPI 的 Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
镊子	Dumont		#9 Dumont - 瑞士
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	分子生物学用甘油 >99%
甘氨酸	Sigma-Aldrich	410225
手持计数器	办公用品	JA0376230
汉克’s 平衡盐溶液	Sigma生命科学	H9394	HBSS – 冰冻状态以用于实验方案
血细胞计数板	奥普蒂克·拉科尔	-	-
氧化型L-谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4376
磁力分离架	Novagen	-	4管磁力分离架
甲醇	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q 水	Millipore	ZRXQ003WW	用于超纯水制备的一体化水净化系统
硝酸纤维素膜	生命科学	66485	30 cm × 3 M 纯硝酸纤维素膜
PageRuler 预染蛋白质标准品	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4，0.1 g KCl，0.1 g K3PO4，4.0 g NaCl（500 ml 蒸馏水），pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
蠕动泵	Masterflex	7518-10
磷酸	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce 无蛋白 T20 PBS 封闭缓冲液	赛默飞世尔科技	37573	4°C 下保存。封闭缓冲液
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – 储存于 -20 °C
快速起始 Bradford 染料试剂 1x	伯乐（Bio-Rad）	500-0205	用于 Bradford 测定
快速启动 BSA 标准品	伯乐（Bio-Rad）	500-0207	Bradford 法测定 BSA 标准品
手术刀	实验室。Co		11号手术刀
SilverQuest™ 染色试剂盒	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ 超速离心机	赛默飞世尔科技	46910
链霉亲和素（HRP）	Abcam	AB7403
链霉亲和素磁珠	New England Biolabs	S1420S
超级胶水 - 超快迷你型	UHU		UHU 超级胶水 1 毫克，超快速迷你装
台式离心机	Eppendorf	22331
TCEP	赛默飞世尔科技	20490
Triton X-100	伯乐（Biorad）	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
涡旋混合器	Ratek	VM1
水浴锅	资助	GD100