生物素化细胞表面蛋白的纯化上皮细胞

Summary

一种基于梯度改性密度离心方法被利用来上皮细胞从扇头蜱microplus肠组织隔离。生物素化表面结合蛋白，并通过链霉抗生物素蛋白磁珠纯化，用于下游应用。

Abstract

Rhipicephalus microplus - 牛蜱 - 是对家畜作为几种病原体的载体的经济影响方面最重要的外寄生物。致力于牛蜱控制以减少其有害影响，重点是发现位于蜱肠上皮细胞表面的疫苗候选物质，例如BM86。目前的研究重点是利用cDNA和基因组文库筛选其他候选疫苗。蜱肠细胞的分离是调查蜱肠细胞膜上表面蛋白质组成的重要优势。本文构建了一种用于分离上皮细胞的新颖可行的方法，从半加入的微量元素的蜱肠内含量。该方案利用TCEP和EDTA从上皮支持组织和不连续密度离心分离器中释放上皮细胞以将上皮细胞与其他细胞类型分开。细胞表面蛋白质生物素化并从蜱肠上皮细胞中分离，使用链霉抗生物素蛋白连接的磁珠，允许在FACS或LC-MS / MS分析中的下游应用。

Introduction

扇头蜱microplus，牛蜱，是在对养牛业热带和亚热带地区，因为它矢量牛蜱传热（巴贝虫病），微粒孢子虫病和马焦虫病^{1，2，3，4}经济影响方面最显著外寄生物。努力致力于牛蜱控制，减少有害影响，然而常规方法如使用化学杀螨剂具有隐含的缺点，例如在牛奶和肉中存在化学残留物，以及化学抗性蜱的流行率增加^5，6，7。因此，研究了替代蜱控制方法的开发，例如使用天然抗性牛，生物防治（生物杀虫剂）和疫苗分级表^{4，5，6，7，8，9。}

在追求能够被....

Protocol

1.从R. microplus肠上皮的解剖

1. 在实验当天从牛收集半加成蜱。从主机取出后24小时内解剖。
2. 在92 mm x 16 mm培养皿的底部附上一条胶带。在胶带上加一滴超级胶水。将蜱，腹侧放在超级胶上，让其干燥2分钟。
3. 将100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）倒入培养皿中，或直到蜱被完全浸没。
4. 使用大小11的手术刀，从眼睛的顶部切割到底部的festoons，在刻度的两边。
5. 使用无菌镊子，彻底清除盾板和alloscutum，并暴露出内部器官。
6. 去除细白色线状器官（气管）和其他膜，以防止污染。
7. 使用镊子去除肠道，通过捏住上部区域并从中拉出尸体。去除任何剩余的肠道组织，确保没有其他组织被解剖。
8. 在没有氯化钙和硫酸镁和蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的情况下将肠子储存在冰冷的汉克平衡盐溶液（HBSS）中。将干冰中的胆固醇冻结并储存在-20°C。
   注意:为了帮助肠道解剖和蜱内脏的详情，请参阅D·索尼希恩^，19"蜱的生物学"第3.1章。

上皮细胞分离

1. 将解剖的肠倒入50mL管内的70μm细胞过滤器上。
2. 用PIC用50 mL冰冷的HBSS冲洗肠道组织，直到溶液清澈透明....

Results

根据图1所示的原理图，从R. microplus的肠组织中分离上皮细胞。 使用该方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微镜图像显示在图2A中 和2B。 由于细胞分离是在半富集的R. microplus上进行的，细胞在整个样品中表现为单数，球形，光滑的表面形态和一致的大小。肠细胞群体的大小和类型的差异，一旦蜱进入充满成熟的成年人，就更加明显。

用DAPI分离的上皮细胞的细胞核的荧光染色有助于细胞的可视化。差的分离可视化为含有epith的不完全解离通过变化的细胞大小和形态鉴定出不同细胞群体的细胞（

Discussion

牛蜱侵染构成了养牛业在世界的热带和亚热带地区的一个主要问题，与控制时使用杀螨剂^1，4依赖的最常用的方法。 Bm86进行先前蜱肠上皮表面作为对抗R. microplus侵染¹⁰保护性抗原，以有限的成功作为疫苗策略内识别由于Bm86进行地理序列变异和定期升压⁴的要求。

以前的出版物聚焦在上皮隔离方法中主要集中于脊椎动物或昆虫物种^{9，11，12，13，14。}例如，早期分离试图分离中肠利用哺乳动物技术，发现由于不同的细胞结构和组织，相同的方.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% 台盼蓝	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	3322
100 mM 碳酸盐缓冲液			3.03 g Na2CO3、6.0 g NaHCO3 1000 ml 蒸馏水 pH 9.6
16 mL 带密封盖的离心管	Thermo Scientific	3138-0016	在冰中冷却
;M 细胞过滤器	Thermo Fisher	87791
3,3′，5,5′-用于 ELISA 的四甲基联苯胺 （TMB） 液体底物系统	Sigma	T0440	储存在 4C
30% 过氧化氢	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS 凝胶	基因脚本	M42015
4-氯-1-萘酚片	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon 管	康宁蓝		30 x 115 mm 款式。聚丙烯锥形管。
70 µM 细胞过滤器	BD Falcon	352350
AP15 滤纸	Millipore	AO1504200
生物素（A 型）偶联试剂盒	Abcam	Ab102865
解剖显微镜	奥林巴斯	SZX7
DP 管理器	奥林巴斯	2.2.1.195	比色皿成像软件
胶带	家用杂工		48 毫米 x 25 毫米 管道胶带
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基	Gibco	11995-065	DMEM - 冰冷方案
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp 免疫板	Nunc	439454
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
荧光显微镜	奥林巴斯	BX51
荧光盾，带 DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
镊子	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	分子生物学甘油 >99%
甘氨酸	Sigma-Aldrich	410225
手持式计数器	Officeworks	JA0376230
汉克s 平衡盐溶液	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – 冰冷用于方案
血细胞计数器	Optik Lakor	-
-L-谷胱甘肽氧化	Sigma-Aldrich	G4376
磁分离架	Novagen-4		管 磁分离架
甲醇	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	用于超纯水的整体水净化系统
硝酸纤维素膜	生命科学	66485	30 cm x 3M 纯硝酸纤维素膜
PageRuler 预染蛋白质分子量标准	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4、0.1 g KCl、0.1 g K3PO4、4.0 g NaCl（500 ml 蒸馏水）pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
蠕动泵	Masterflex	7518-10
磷酸	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce 无蛋白 T20 PBS 封闭缓冲液	Thermo-Scientific	37573	储存在 4C 下。封闭缓冲液
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC –储存在 -20 °C
快速入门 Bradford 染料试剂 1x	Biorad	500-0205	用于 Bradford 检测
快速入门 BSA 标准	Biorad	500-0207	BSA 标准用于 Bradford 检测
手术刀	实验室 Co		Size 11 手术刀
SilverQuest TM 染色试剂盒	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM 安全染色剂	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ 超速离心机	Thermo Scientific	46910
链霉亲和素 （HRP）	Abcam	AB7403
链霉亲和素磁珠	New England Biolabs	S1420S
超级胶水 - 超快速迷你	UHU		UHU 超级胶水 1mg。超快速迷你
台式离心机	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
涡旋混合器	Ratek	VM1
水浴	授予	GD100