采用改良的密度梯度离心法从微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道组织中分离上皮细胞。对表面结合蛋白进行生物素标记，并利用链霉亲和素磁珠纯化，用于后续实验应用。
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本文内容
摘要
摘要
Rhipicephalus microplus——即牛蜱——作为多种病原体的传播媒介，是畜牧业中在经济影响方面最重要的外寄生虫。为减轻其有害影响，人们致力于控制牛蜱，尤其关注疫苗候选分子的发现，例如位于蜱肠道上皮细胞表面的BM86蛋白。目前的研究重点是利用cDNA文库和基因组文库，筛选其他潜在的疫苗候选抗原。分离蜱肠道细胞对于研究蜱肠道上皮细胞膜表面蛋白的组成具有重要意义。本文介绍了一种新颖且可行的方法，用于从部分吸血的R. microplus蜱肠道内容物中分离上皮细胞。该方案采用TCEP和EDTA将上皮细胞从上皮下支撑组织中释放，并通过不连续密度梯度离心法将上皮细胞与其他类型的细胞分离。随后，利用链霉亲和素偶联的磁珠对蜱肠道上皮细胞的细胞表面蛋白进行生物素标记并分离，从而可用于后续的FACS或LC-MS/MS分析。
引言
Rhipicephalus microplus（牛蜱）是热带和亚热带地区对养牛业造成最大经济影响的体外寄生虫，因其可传播牛蜱热（巴贝斯虫病）、边虫病和马梨形虫病1,2,3,4。尽管已投入大量努力以控制牛蜱，减轻其有害影响，但传统方法（如使用化学杀螨剂）存在固有缺陷，例如在牛奶和肉类中残留化学物质，以及化学抗性蜱虫的流行率上升5,6,7。因此，人们已开始研究替代性的蜱虫防控方法，例如利用天然抗性牛种、生物防治（生物杀虫剂）以及疫苗4,5,6,7,8,9。
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方案
1. 从微小牛蜱（R. microplus）中解离肠道上皮组织
- 在实验当天从牛体上采集半吸血的蜱虫，并在从宿主移除后的24小时内进行解剖。
- 将一条胶带粘贴在92 mm × 16 mm培养皿底部。在胶带上滴加一滴强力胶，将蜱虫腹面朝下放置于胶水上，静置2分钟使其固定。
- 向培养皿中加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全浸没蜱虫。
- 使用11号手术刀片，从蜱虫复眼顶部开始，沿两侧向下方的环状结构（festoons）方向切割。
- 使用无菌镊子完整移除scutum（盾板）和alloscutum（后附盾板），以暴露内部器官。
- 移除细小的白色丝状结构（气管）及其他膜性组织，防止污染。
- 用镊子夹住肠道上部，从虫体残骸中拉出整个肠道。彻底清除残留的肠道组织，并确保未混入其他组织。
- 将肠道置于含蛋白酶抑制剂混合液（PIC）但不含氯化钙和硫酸镁的冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。用干冰速冻肠道，并在-20 °C下保存。
注意：有关蜱虫肠道解剖及内部器官结构的详细信息，请参见D. Sonenshine所著《蜱虫生物学》第3.1章19。
2. 上皮细胞解离
-
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结果
从肠道组织中分离上皮细胞 R. microplus 如示意图所示 图1. 采用本实验方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微图像如下所示 图 2A 和 2B. 由于细胞分离是在半饱血状态下进行的 微小牛蜱 细胞在样品中呈现为单个、球形、表面光滑且大小均一的形态。当蜱虫发育至完全饱血的成虫阶段时，肠道细胞群体在大小和类型上的差异变得更加明显。
使用DAPI对分离的上皮细胞核进行荧光染色有助于观察细胞。较差的分离结果表现为上皮细胞解离不完全，通过细胞大小和形态的差异可识别出不同的细胞群体（图2C 和
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讨论
牛蜱感染是全球热带和亚热带地区养牛业面临的主要问题，目前最常用的防控方法依赖于杀螨剂的使用1,4。Bm86此前被发现在蜱肠道上皮表面表达，是一种针对R. microplus感染的保护性抗原10，但由于Bm86存在地理来源相关的序列变异以及需要定期加强免疫，该疫苗策略的效果有限4。
以往关于上皮细胞分离方法的研究主要集中于脊椎动物或昆虫物种9,11,12,13,14。例如，早期尝试利用哺乳动物技术分离中肠时发现，由于细胞结构和组织方式.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢澳大利亚昆士兰州农业与渔业部生物安全蜱虫保种中心提供本研究所用的微小牛蜱（Rhipicephalus microplus），并感谢Lucas Karbanowicz在视频拍摄过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝 | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 3322 | |
| 100 mM 碳酸盐缓冲液 | 3.03 g Na2CO3，6.0 g NaHCO3，加蒸馏水至1000 ml，pH 9.6 | ||
| 带密封盖的16 mL离心管 | 赛默飞世尔科技 | 3138-0016 | 在梯度前置于冰上冷却 |
| 250 µM细胞滤筛 | 赛默飞世尔科技 | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-ELISA用四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统 | Sigma | T0440 | 4°C 下保存 |
| 30% 过氧化氢 | 实验室实景 | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS 凝胶 | Gen Script | M42015 | |
| 4-氯-1-萘酚片 | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon管 | 康宁蓝 | 30 x 115毫米规格。聚丙烯锥形管。 | |
| 70 µM细胞滤网 | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 滤纸 | Millipore | AO1504200 | |
| 生物素（A型）偶联试剂盒 | Abcam | Ab102865 | |
| 解剖显微镜 | 奥林巴斯 | SZX7 | |
| DP 管理员 | Olympus | 2.2.1.195 | 细胞成像软件 |
| 医用胶带 | 家庭维修工 | 48 mm × 25 mm 胶带 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基 | Gibco | 11995-065 | DMEM - 冰冷用于实验方案 |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp 免疫板 | Nunc | 439454 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 含 DAPI 的 Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| 镊子 | Dumont | #9 Dumont - 瑞士 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | 分子生物学用甘油 >99% |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| 手持计数器 | 办公用品 | JA0376230 | |
| 汉克’s 平衡盐溶液 | Sigma生命科学 | H9394 | HBSS – 冰冻状态以用于实验方案 |
| 血细胞计数板 | 奥普蒂克·拉科尔 | - | - |
| 氧化型L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| 磁力分离架 | Novagen | - | 4管磁力分离架 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q 水 | Millipore | ZRXQ003WW | 用于超纯水制备的一体化水净化系统 |
| 硝酸纤维素膜 | 生命科学 | 66485 | 30 cm × 3 M 纯硝酸纤维素膜 |
| PageRuler 预染蛋白质标准品 | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4，0.1 g KCl，0.1 g K3PO4，4.0 g NaCl（500 ml 蒸馏水），pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| 蠕动泵 | Masterflex | 7518-10 | |
| 磷酸 | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce 无蛋白 T20 PBS 封闭缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37573 | 4°C 下保存。封闭缓冲液 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – 储存于 -20 °C |
| 快速起始 Bradford 染料试剂 1x | 伯乐（Bio-Rad） | 500-0205 | 用于 Bradford 测定 |
| 快速启动 BSA 标准品 | 伯乐（Bio-Rad） | 500-0207 | Bradford 法测定 BSA 标准品 |
| 手术刀 | 实验室。Co | 11号手术刀 | |
| SilverQuest™ 染色试剂盒 | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ 超速离心机 | 赛默飞世尔科技 | 46910 | |
| 链霉亲和素（HRP） | Abcam | AB7403 | |
| 链霉亲和素磁珠 | New England Biolabs | S1420S | |
| 超级胶水 - 超快迷你型 | UHU | UHU 超级胶水 1 毫克，超快速迷你装 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | 赛默飞世尔科技 | 20490 | |
| Triton X-100 | 伯乐（Biorad） | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| 涡旋混合器 | Ratek | VM1 | |
| 水浴锅 | 资助 | GD100 |
参考文献
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al.
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重印与许可
