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方法文章

利用侧方腹膜后钻孔损伤建立绵羊腰椎椎间盘退变模型

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DOI：

10.3791/55753

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2017年5月25日

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1Department of Surgery, Monash University, 2Department of Neurosurgery, Monash University, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 4Proteobioactives, Pty Ltd, 5Department of Neurosurgery, St Vincent's Hospital, 6Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 7School of Chemical Engineering, University of Queensland, 8Department of Neurosurgery, Monash Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

椎间盘退变是导致背痛的重要因素，也是全球范围内致残的主要原因之一。目前存在多种椎间盘退变的动物模型。本文展示一种利用钻头建立的绵羊椎间盘退变模型，该方法可实现稳定的椎间盘损伤，并产生可重复的椎间盘退变程度。

摘要

椎间盘退变是导致背痛发生的重要因素，也是全球范围内致残的首要原因。目前已开发出多种椎间盘退变的动物模型。理想的动物模型应在形态学、生物力学特性以及无脊索细胞等方面，尽可能接近人类椎间盘。绵羊腰椎椎间盘模型符合这些标准。本文介绍一种通过侧方腹膜后入路，利用钻头损伤建立的椎间盘退变绵羊模型。与传统的羊脊柱前路手术相比，侧方入路显著减小了切口大小及相关潜在并发症。采用钻头造成损伤的方法，可产生尺寸精确、一致性高且可重复的损伤，从而诱发程度一致的椎间盘退变。这种局限性的纤维环和髓核缺损，更接近临床上局限性椎间盘突出的病理状态。动物在术后恢复迅速，通常在术后一小时内即可活动并进食。椎间盘退变持续进展，可在术后八周起对绵羊进行剖检及后续分析。我们认为，钻头损伤法建立的椎间盘退变模型相较于传统的纤维环损伤模型具有优势。

引言

下背痛是全球致残的首要原因1。腰椎间盘退变相关的盘源性疼痛被认为是导致下背痛的重要因素2。目前迫切需要可靠的椎间盘疾病动物模型，以加深对退变过程的理解，并推动潜在治疗方法的研究。

目前存在多种椎间盘退变的动物模型3。用于研究退行性椎间盘疾病的动物模型在体型上涵盖从小鼠4到较大的哺乳动物，如犬5、绵羊6和非人灵长类动物7。诱导椎间盘退变的方法 broadly 可分为机械性方法（例如 椎间盘压迫8或手术损伤6）、化学性方法（例如 化学性髓核溶解5），以及较少见的自发性退变（例如 沙鼠9）。

鉴于人类椎间盘退变的复杂性，目前尚不存在完美的动物模型。然而，研究人员已确定在选择合适的动物模型以尽可能模拟该病况时需考虑的重要因素。3。这些考虑因素包括缺乏脊索细胞（具有潜在祖细胞功能的原始细胞）10 在人类、绵羊、山羊和软骨营养不良性犬类的成年髓核中缺失，但在大多数哺乳动物中存在）、动物与人类椎间盘尺寸的相似性、与临床状况相当的生物力学受力、机制性及伦理学考量3.

非人灵长类动物满足上述许多标准。已有研究报道狒狒和猕猴的自发性椎间盘退变模型11,12,13。这两种物种均长时间保持直立或半直立姿势——相较于其他动物模型具有明显优势。然而，伦理和实际因素（例如成本高昂、饲养困难、自发性退变发生较晚）限制了其在许多机构中的应用。

绵羊脊柱是椎间盘退变的成熟模型，其优势包括在细胞、生物力学和解剖结构方面与人类脊柱具有相似性10,14,15尽管绵羊为四足动物，其腰椎间盘所承受的应力与人类椎间盘相似。14从伦理学角度来看，绵羊模型比非人灵长类动物模型更容易被广泛接受。已有多种方法被用于启动退变过程，其中许多方法需要直接进入椎间盘。由于脊髓终止于骶区，且绵羊腰椎后纵韧带存在骨化现象，因此经后路接近椎间盘在技术上具有挑战性，在绵羊中较少使用16传统的绵羊腰椎入路 即 通过前路或前外侧入路的手术需要较大的腹部切口，存在较高的疝形成风险，并可能损伤内脏器官及神经血管结构16在远离腹部低垂区域的位置采用相对较小的侧向切口，可能降低此类风险17.

我们介绍一种利用钻头损伤通过微创侧方入路建立的绵羊腰椎间盘退变模型，该方法借鉴了Zhang et. al18的研究。本方案的目标是建立一种可靠、易于重复、损伤一致且安全耐受良好的腰椎间盘损伤模型。该方法特别适用于希望诱导较传统外科环切术（未发表数据）更轻度腰椎间盘退变的研究人员，以用于椎间盘退变机制或再生治疗的研究。相关研究结果将在即将发表的论文中详细描述。

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方案

本手稿中详述的实验方案遵循莫纳什大学动物伦理委员会的动物护理指南。该实验方案已获得莫纳什大学动物伦理委员会的伦理批准。伦理批准编号：MMCA/2014/55

1. 绵羊准备

注意：使用年龄为两到四岁的母羊。

  1. 在麻醉前禁食 18 小时。在手术前 6–12 小时之前允许动物自由饮水19。
  2. 通过静脉注射盐酸美托咪定（0.015–0.020 mg/kg）对动物进行镇静，以方便转移至手术室。
    注：盐酸美托咪定有助于减轻动物因与其他动物分离并转移至手术室而产生的应激和躁动。
  3. 到达手术室后，注射硫喷妥钠（10–13 mL/kg）以诱导麻醉。
  4. 在注射硫喷妥钠后立即给予预防性静脉抗生素（静脉注射阿莫西林 1 g）。
  5. 使用 7.5–9 mm（内径）的气管导管对绵羊进行气管插管20。
  6. 使用 100% 氧气（流速为 2 L/min）中吸入异氟烷（2–3%）维持麻醉。将脉搏血氧仪连接至绵羊耳朵。
  7. 密切监测绵羊的生命体征（通过脉搏血氧仪和观察监测心率、呼吸频率和血氧饱和度）以及意识水平。
    注：自发咀嚼、主动反流和自发运动等浅麻醉迹象应提示增加麻醉深度。呼吸功能受损和严重心动过缓是提示需紧急减轻麻醉的危险信号。眼球转动在绵羊中并非麻醉深度的一致性指标19。

2. 椎间盘节段与切口

  1. 准备本手术所需的外科器械：兽用剪毛器、20 mL 带锁扣注射器、21G 静脉穿刺针、#4 手术刀柄、#22 手术刀片、Gillies 组织镊、Metzenbaum 弯头解剖剪、Deaver 牵开器、Hohmann 牵开器刀片、3.5 mm 麻花钻头、钻头限位器、电钻、可高压灭菌的兽用钻头包、持针器、2-0 可吸收合成编织缝线、3-0 可吸收合成编织缝线以及Mayo缝合剪。
  2. 准备手术室。使用70%乙醇清洁手术台和器械架。术前对所有手术器械进行高压灭菌。进行术前麻醉检查。
  3. 将绵羊置于手术台上，采取右侧卧位。
  4. 使用电动剪毛器剃除手术区域毛发，该区域上界为下部肋骨，下界为髂骨，内侧为对侧腰椎横突，外侧距同侧腰椎横突约10 cm。
  5. 触诊髂嵴、腰椎横突（L1–6）及肋椎角，确定手术切口部位的解剖标志，并用无菌记号笔标记这些标志点。
  6. 使用氯己定和含醇碘类消毒液对外侧腹部进行消毒处理。
  7. 整个手术过程中严格遵守标准外科无菌技术。手术团队在术前应完成刷手。在手术区域覆盖无菌带孔洞巾单，在上方器械台铺设大块无菌方巾。
    1. 术前对所有将进入手术区域的物品进行灭菌处理。术中持续监测并维持手术区域的无菌状态。确保所有引入无菌区域的物品均处于无菌状态，并以无菌方式传递。
  8. 使用手术放大镜和头灯以增强手术过程中的视野清晰度。
  9. 使用安装在#4 手术刀柄上的#22 手术刀片，沿感兴趣椎间盘节段上下一至两个腰椎横突平行方向做纵向切口，切口位于其前方1 cm处。
    注：有关切口规划的更多详细信息，请参见讨论部分。
  10. 使用单极电刀切开皮下组织及腹壁肌肉的外侧部分；解剖方向朝向目标椎间盘上下方腰椎横突的尖端。
  11. 沿胸腰筋膜在横突附着处做纵向切开。
  12. 辨认并保护位于深部的腰方肌、腰大肌以及走行其中的神经血管束。
  13. 在整个手术过程中使用电凝止血，维持术野的止血状态。
  14. 在暴露的椎间盘节段处，用手指在腹膜与后腹壁肌肉之间的间隙进行指法钝性分离。
  15. 使用Deaver牵开器将腰方肌和腰大肌向后外侧牵拉，以进一步暴露椎间盘。
  16. 触诊识别凹陷的椎体及凸起的椎间盘。
  17. 将牵开器置于椎间盘正上方，并注意避免损伤腰动静脉。
  18. 在头灯辅助下使用手术放大镜，辨认位于下终板远端约1 cm处的腰动静脉。
  19. 术中行侧位X线摄影以确认椎间盘节段。21
    注：X线摄影参数设置：47 kV；4 mAs21
  20. 根据所需处理的椎间盘节段，通过分离周围结构及其附着组织来暴露椎间盘，具体方法如下。
    1. 对于L3/4及以上节段，使用指法钝性分离推开覆盖在椎间盘上的肌肉附着组织。
    2. 对于L4/5及以下节段，使用双极电凝和剪刀锐性切断覆盖在椎间盘上较厚的腱性肌肉附着组织。
      注：由于髂嵴的阻挡，L6/S1节段可能难以通过侧方入路到达。若侧方入路无法实现充分暴露，可采用前路手术入路。

3. 钻头损伤

注意：术前规划包括确定损伤/治疗节段和对照节段。有关节段分配的更多详细信息，请参见讨论部分。

  1. 通过观察椎间盘的左侧外侧缘和前缘来确定钻头进入点。
    注意：穿刺入口位于该左前外侧象限的中点（由椎间盘的前缘和外侧缘界定）。钻头由此入口处插入，进针路径指向椎间盘中心，并略微向头侧倾斜，偏离垂直方向。
  2. 将布拉德点钻头安装到电钻上。确保钻头直径略小于椎间盘高度 即 60–70 kg 绵羊腰椎间盘约为 3.5 mm。
    1. 使用钻头限位器，使裸露的钻头长度约为腰椎椎间盘直径的一半 即 60–70 kg 绵羊腰椎间盘约 12 mm。
  3. 将钻头对准进针点，并沿略偏向椎间盘中心头侧的方向进行钻孔。轻微的头侧倾斜角度有助于降低终板损伤的风险。
  4. 以低功率启动钻头，缓慢将其推进椎间盘，持续1秒。若遇到过大阻力，可轻微调整进针方向，略向头侧或尾侧修正。
    注意：这种过大的阻力可能表明已接触到终板。

4. 封闭

  1. 止血完成后，用林格氏液冲洗伤口。
  2. 逐层缝合，建议使用2-0可吸收合成编织缝线缝合侧腹壁组织，皮肤采用连续3-0无染色可吸收合成编织皮下缝合缝线。

5. 术后管理

  1. 在术后镇痛期间，将一片芬太尼透皮贴剂（75 µg/h）置于腹股沟区域，持续使用3天。
  2. 如有需要，可额外使用静脉注射布托啡诺（0.005–0.01 mg/kg）作为补充镇痛。
  3. 停止吸入麻醉。当动物出现自主呼吸时，拔除气管插管。
  4. 将动物置于饲养笼中，在持续观察下恢复。
    注意：在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。
  5. 当动物完全清醒并能够站立后，重新提供食物和饮水。待其完全恢复后，将其送回手术设施内的饲养栏，与其他动物共同饲养。
  6. 密切监测24小时，并持续观察一周时间，注意有无术后疼痛或痛苦的表现。
    注意：术后使用芬太尼透皮贴剂三天应可提供充分的镇痛效果。如需额外镇痛，应重新评估动物状况。
  7. 正常饲喂绵羊，并允许其自由进行日常活动，不受限制。观察绵羊是否存在神经功能缺损的迹象，例如跛行。
    注意：钻头损伤法造成的椎间盘缺损位于椎间盘的前外侧区域，损伤深度由钻头限位装置控制，仅达髓核中部。由于神经结构位于椎间盘的后方或后外侧，因此因症状性髓核突出导致神经功能受损的风险极低。该模型的这一解剖学特点决定了无法通过神经系统检查来区分是否存在髓核突出的椎间盘退变。
  8. 实验周期结束后，将绵羊送回大学农场，等待实施安乐死及尸体解剖。

6. 安乐死

  1. 在钻头造成椎间盘损伤后的适当时间间隔内实施绵羊安乐死。
  2. 静脉注射戊巴比妥钠（>100 mg/kg）以实施安乐死。

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结果

术前，绵羊接受3T磁共振成像（MRI）检查，以评估椎间盘的形态学特征及退变程度。术中额外进行侧位X线摄影，以确认椎间盘节段并计算椎间盘高度指数。术前3T MRI的矢状面切片图像与术中X线片如图1所示。

脊柱MRI和X光图像；腰椎标记为L1/L2、L6/S1；医学影像对比。
图1： 术前3T MRI（A）与术中侧位X线片（B）。（A）来自绵羊腰椎的3T MRI矢状面切片（3T T2加权自旋回波序列），显示腰椎1/2（L1/2）至腰骶段（L6/S1）的椎间盘。椎间盘呈均匀高信号...

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讨论

这种微创侧方入路具有良好的有效性和安全性，本系列病例中未观察到术后疝气、腹部切口裂开或感染。采用带深度限位器的钻头建立椎间盘损伤模型，可提供一种可重复的方法，用于诱导出尺寸明确且一致的椎间盘损伤。即在本研究中，造成直径3.5 mm、深度12 mm的损伤。根据我们的经验，该方法所诱导的椎间盘退变程度较传统描述的绵羊腰椎椎间盘刀片环切模型更轻。6,22 （未发表数据）。相关内容将在即将发表的论文中详细描述。

在进行初始的纵向皮肤切口（步骤2.9）时，应根据目标椎间盘节段调整切口的确切长度和位置。若要到达更高节段的椎间盘（如T12/L1），可将切口延伸至肋椎角；而将切口延伸至髂嵴则可暴露下腰椎（至L5/L6）。10 cm的切口有助于暴露三到四个椎间盘节段，而若仅需暴露单个椎间盘，则需采用5 cm的局限性小切口。我们倾向于在两个节段进行损伤操作，通常选择L2/L3和L3/L4节段，以便将相邻的L1/2和L4/5椎间盘节段作为未损伤的内部对照。一旦技术熟练，...

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披露

作者声明不存在任何需披露的竞争性财务利益。

致谢

Chris Daly 博士获得了外科学基金会 Richard Jepson 研究奖学金。作者谨此感谢 Monash 大学 Monash 动物服务中心的 Anne Gibbon 博士、Dong Zhang 博士及全体工作人员在动物手术与护理方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸美托咪定（10 mL 注射液）Therapon/ZoetisPFIDOM10多个供应商：Zoetis/Ilium
硫喷妥钠TroyTriothiopentone多个供应商：Neon Laboratories、Jagsonphal Pharmaceuticals
异氟烷（氧气中浓度 2 - 3 %）BaxterAHN3636多个供应商：Baxter/VetOne
注射用氨苄西林GlaxoSmithKlineJO1CA04多个供应商：GlaxoSmithKline/Merck
布比卡因（0.5% 注射液 20 mL）Pfizer005BUP001多个供应商：Pfizer/AstraZeneca
PVD 碘溶液Jurox61330多个供应商：Jurox/Orion
氯己定 5% w/vJuroxChlorhex C 5L (SCRUB)多个供应商：Jurox/Pfizer
透皮芬太尼贴剂（75 μg/h）Janssen-CilagS8-Dur7.5多个供应商：Sandoz
静脉用布托啡诺Jurox504410多个供应商：LGM Pharma
阿替美唑（Antisedan 0.06 mg/kg - 0.08 mg/kg）ZoetisPFIANT10多个供应商：Ilium
Oster Golden A5 双速电推剪Oster078005-140-003Oster
20 mL 鲁尔锁式注射器Terumo6SS+20L多个供应商：Medshop Australia/Terumo
21 G 静脉穿刺针TerumoSG3-1225多个供应商：Medshop Australia/Terumo
#4 手术刀柄AustvetAD010/04多个供应商：Austvet/SurgicalInstruments
#22 手术刀片Austvet
吉列斯组织镊AustvetAB430/15多个供应商：Austvet/SurgicalInstruments
梅岑鲍姆弯解剖剪AustvetAC101/14多个供应商：Austvet/SurgicalInstruments
迪弗拉牵开器Surgical Instruments23.75.03多个供应商：Surgical Instrument/Austvet
霍曼牵开器AustvetKA173/35多个供应商：Austvet/SurgicalInstruments
梅奥缝线剪AustvetAC911/14多个供应商：Austvet/SurgicalInstruments
持针器 14 cm EliteMedical18-1030多个供应商：EliteMedical/Austvet
CMT 3.5 mm 带中心点钻头Carbatec516-035-51多个供应商：Southeast Tool/Carbatec
钻头限位器 4 mmDrill Warehouse20121600多个供应商：Amazon
Bosch 10.8 V 无线角向钻Get Tools DirectGWB10.8V-LIBB多个供应商：Bunnings/Get Tools Direct
可高压灭菌兽用钻具包AustVetDRA043-AVAustVet
2-0 可吸收合成编织缝线EthiconVCP335HEthicon
3-0 可吸收合成编织缝线EthiconVCP232HEthicon
西门子 3 特斯拉 Skyra 宽体磁共振成像仪SiemensN/ASiemens
9.4 特斯拉安捷伦（Varian）磁共振成像仪Agilent TechnologiesN/AAgilent Technologies
Atomscope HF 200 A 数字放射成像系统Radlink330003A多个供应商：Radlink/DLC Australia
兽用脉搏血氧仪DLC 192500A多个供应商：DLC Australi Pty Ltd/AustVet

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