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利用优化用于本科教学实验室的酵母雌激素筛选法检测个人护理产品中的雌激素类配体

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DOI：

10.3791/55754

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2018年1月1日

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1Department of Biology, University of the South, 2School of Biological Sciences, Louisiana Tech University, 3School of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Center, 4Department of Biology, Furman University, 5Department of Computer Science, Louisiana Tech University, 6Clemson University

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的酵母雌激素筛选方法，用于定量个人护理产品（PCPs）中与雌激素受体α（ERα）和/或β（ERβ）结合的配体。该方法包含两种比色底物选择、适用于本科生课程的六天冷藏培养，以及用于数据分析的统计工具。

摘要

酵母雌激素筛选法（YES）用于检测环境样品中的雌激素类配体，已广泛应用于内分泌干扰物的研究。雌激素类配体包括天然和人工合成的化合物 "环境雌激素" （EEs）存在于多种消费品中，包括个人护理产品（PCPs）、塑料制品、农药和食品。EEs会干扰人类及其他动物的激素信号传导，可能降低生育能力并增加患病风险。尽管环境雌激素及其他内分泌干扰物（EDCs）对公共健康具有重要意义，但内分泌干扰作用通常未被纳入本科教学课程。这一不足部分源于缺乏既能阐明相关原理又适合本科生操作的实验教学活动。本文介绍了一种优化的酵母雌激素筛查法（YES），用于定量检测个人护理产品中与雌激素受体α（ERα）和/或β（ERβ）结合的配体。该方法采用两种比色底物之一正交-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）或氯酚红-β-D-半乳糖苷（CPRG），这些底物可被β-半乳糖苷酶切割；包含一个为期6天的冷藏孵育步骤，便于在本科实验课程中使用；提供用于LacZ计算的自动化应用程序，以及用于相关四参数逻辑回归分析的R代码。该实验方案的设计旨在使本科生能够自主设计并开展实验，筛选他们所选择的产品中是否存在类雌激素物质。在此过程中，学生将学习内分泌干扰、细胞培养、受体结合、酶活性、基因工程、统计学及实验设计等相关知识。同时，他们还将练习一系列基础且广泛应用的实验技能，例如：浓度计算、溶液配制、无菌操作技术、标准品的系列稀释、标准曲线的绘制与插值、变量与对照的识别、数据的收集、整理与分析、图表的绘制与解读，以及常用实验仪器（如微量移液器和分光光度计）的使用。因此，实施该检测方法有助于推动学生在探究式学习中深入理解环境科学与健康领域的新兴问题。

引言

酵母雌激素筛查（YES）被广泛用于定量多种基质中模拟雌二醇（E2 或 17β-雌二醇）的配体，包括水、植物组织、消费品和食品1,2,3,4统称为此类配体 "环境雌激素（EEs）。" YES 最初被开发为一种低成本的 体外 替代方案 体内 类似于啮齿类动物子宫增重试验5,6 以及虹鳟鱼摄食实验7这些检测的目的是确定产品中是否含有能够激活或抑制雌激素依赖性机制的化学物质。检测环境雌激素（EEs）至关重要，因为它们可能干扰正常的内源性雌激素信号传导，尤其是在胎儿发育期间。这种干扰会增加肥胖、不孕、癌症和认知功能减退的风险，从而危害健康。8.

尽管环境雌激素（EEs）和其他内分泌干扰物（EDCs）对公共健康具有重要意义，但内分泌干扰作用通常并未纳入本科教学课程。这一缺陷部分是由于缺乏既能阐明相关原理又适合本科生理解的实验活动。此外，酵母雌激素筛选（YES）实验已存在多种不同版本9,10,11,12,13，这种多样性使得未接受过相关技术专门培训的实验室负责人在方法优化上耗费大量时间。最后，YES实验通常需要在1个较长的工作日或连续2天内完成，并包含一次过夜（O/N）孵育。这种时间安排与本科实验课程的常规模式不相适应，后者通常每周仅进行一次，持续数小时。

针对这些需求，本文报告了一种优化的96孔板酵母雌激素筛查（YES）方案，该方案包括个人护理产品（PCPs）的乙醇提取方法3，以及一个为期6天的冷藏步骤，以便配合每周的实验室会议安排。无水乙醇是一种通用的有机溶剂，能够溶解多种极性和非极性溶质。此外，由于其易于获取、相对无毒、价格低廉且可与水混溶，同时无需特殊设备即可快速蒸发，因此适用于本科生课程。然而，乙醇并不适合提取强疏水性内分泌干扰物或许多油脂和蜡类物质，而后两者在个人护理产品中是常见成分。提取效率低下会增加出现假阴性结果的风险。鉴于这一局限性，研究人员应根据样品特性及研究目标（科研或本科教学）选择合适的提取方法（例如，乙醇提取或固相萃取）。

YES 依赖于重组 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 最初由杜兰大学的查尔斯·米勒博士创建。请参见米勒 等 (2010) 年发表的工程质粒完整图谱14携带这些质粒的酵母在含有半乳糖（针对ERα）或葡萄糖或半乳糖（针对ERβ）的培养基中生长时，会组成型表达人类核雌激素受体ERα或ERβ（分别称为ESR1和ESR2）。若培养基中存在雌激素类化学物质，它们将与受体结合，形成配体-受体复合物，从而以雌激素类化学物质浓度依赖的方式激活β-半乳糖苷酶（lacZ）的表达。随后裂解酵母细胞以释放积累的β-半乳糖苷酶。裂解缓冲液中含有ONPG或CPRG，二者可被β-半乳糖苷酶切割，分别生成黄色或红色产物。通过酶标仪测定吸光度，可对显色产物进行定量。颜色变化的程度与酵母所暴露的雌激素配体浓度成正比。

底物的选择（CPRG 或 ONPG）取决于待测样品可能产生的背景吸光度。例如，植物提取物通常会使培养基呈现黄色，若使用 ONPG（在 405 nm 处定量）作为 β-半乳糖苷酶的底物，会导致雌激素活性测量值被人为高估。对于植物提取物，CPRG（在 574 nm 处定量）可能是更合适的比色底物。CPRG 比 ONPG 更昂贵，但其使用摩尔浓度仅为 ONPG 的十分之一。本文报告了使用 ONPG 和 CPRG 两种底物定量的多氯联苯（PCP）提取物的雌激素活性。

同时使用ERα和ERβ来量化环境样品的雌激素活性，比仅使用其中一种受体更为全面。在动物体内，这两种受体在组织分布、调控活性以及对雌激素和抗雌激素配体的结合亲和力方面均存在差异15。例如，植物来源的植物雌激素通常与ERβ的结合更强2，而合成化学物质可能更倾向于结合ERα或ERβ，或对两种受体的结合能力相当15。因此，对一种雌激素受体的结合并不能必然预测其对另一种受体的结合情况。

尽管环境雌激素（EEs）存在于许多消费品（例如，杀虫剂、洗涤剂、胶粘剂、润滑剂、塑料、食品和药品）以及植物中，但本文所提供的数据是通过选择一些个人护理产品（PCPs）获得的。PCPs具有吸引力、易于获取、成本低廉，并且与环境相关，非常适合本科生使用。可鼓励学生从家中带来自己常用的PCPs在实验室中进行测试。他们还可以查询由环境工作组（Environmental Working Group）开发的Skin Deep数据库16，以提出假设，对高毒性和低毒性评分的PCPs进行比较分析。通过这种方式，学生能够同时发展高级实验技能，开展自主的、以探究为基础的学习，并探索环境科学与健康领域的新兴问题。

方案

1. 试剂的配制

  1. 通过将6.7 g酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖或半乳糖、20 mg硫酸腺嘌呤（以10 mL浓度为200 mg/100 mL的水溶液储备液加入）、20 mg尿嘧啶（以10 mL浓度为200 mg/100 mL的水溶液储备液加入）、60 mg亮氨酸（以6 mL浓度为1 g/100 mL的水溶液储备液加入）和20 mg组氨酸（以2 mL浓度为1 g/100 mL的水溶液储备液加入）溶于去离子水中，定容至1 L，配制葡萄糖和半乳糖培养基。使用0.2 µm滤膜过滤除菌。培养基可在4 °C保存数周。
  2. 将粉末状雌二醇（E2）溶于无水乙醇中，并用50%乙醇稀释至适当的工作浓度（227.5 nM和9.75 nM），制备雌二醇标准品。
    注意：若购买的雌二醇为1 mg/瓶，可直接向瓶中加入1 mL乙醇溶解粉末，得到3.67 mM的储备液#1。取10 μL储备液#1加入990 μL乙醇中，配制成1 mL的36.71 μM储备液#2。再取10 μL储备液#2加入990 μL 50%乙醇中，配制成1 mL的367.13 nM储备液#3。配制工作液时，取619.7 μL储备液#3与380.3 μL 50%乙醇混合，得到1 mL浓度为227.5 nM的工作液，用于构建表达ERα的酵母的标准曲线；取26.56 μL储备液#3与973.44 μL 50%乙醇混合，得到1 mL浓度为9.75 nM的工作液，用于构建表达ERβ的酵母的标准曲线。用封口膜密封标准品，并在-20或-70 °C保存。
    警告：雌二醇（E2）疑似为致癌物和生殖毒性物质。吸入、吞咽或经皮肤吸收均可能造成危害。E2可能对哺乳期婴儿和胎儿造成伤害。E2对水生生物具有极高毒性。操作时应采取适当的个人防护措施（手套、通风橱、防尘口罩），避免在怀孕和哺乳期间接触。E2应作为危险废物处理，不得释放到环境中。
  3. 通过将8.52 g Na2HPO4、5.52 g NaH2PO4•H2O、95.21 mg MgCl2、745.5 mg KCl、2 g N-月桂酰肌氨酸钠盐以及ONPG（400 mg）或CPRG（77.7 mg）溶于去离子水中，定容至1 L，配制LacZ缓冲液。将LacZ缓冲液分装为每份20 mL，在-20 °C保存。
    注意：每份20 mL缓冲液足够用于一块96孔板。
  4. 将105.9 g碳酸钠溶于去离子水中，定容至1 L，配制1 M碳酸钠溶液。室温保存。
  5. 将二硫苏糖醇（DTT）溶于水中，配制成1 M DTT溶液。将DTT分装为每份25 µL，在-20 °C冷冻保存。
    警告：DTT为急性皮肤和眼部刺激物。操作时应使用适当的个人防护装备（手套、通风橱、防尘口罩），避免皮肤和眼睛接触，以及吸入或摄入。
    注意：每份25 µL分装液足够用于一块96孔板。

2. 样品制备与提取对照

  1. 选择待检测的样本。
    注意：本文提供了十五种个人护理产品（PCPs）的数据，包括肥皂、发霜、洗发水、防晒霜、润唇膏、粉底、剃须膏、指甲油和乳液。
  2. 将1 g样品与10 mL无水乙醇加入15 mL锥形管中。制备阴性提取对照，即在15 mL锥形管中加入11 mL乙醇。根据需要设置重复。
    注意：针对本实验设计，制备了全部15种PCPs的三个等分试样以及三份提取对照溶液，共得到48个样品，每个样品均按照第4节中的方案进行三次重复分析。一块微孔板最多可容纳23个样品（每个样品设三个重复）。此步骤中使用无水乙醇，因其易于挥发。使用阴性提取对照以验证雌激素是否从未端锥形管中浸出进入样品。
  3. 通过手动振荡与涡旋振荡相结合的方式，或使用多管涡旋仪振荡，将管内内容物匀浆处理30分钟。
  4. 将锥形管在吊桶式离心机中以最大允许速度离心10分钟。将每管中的上清液倾倒通过一个 40 µm 将细胞滤筛中的内容物转移至50 mL锥形管中。将每个50 mL锥形管中的内容物倒入玻璃闪烁瓶中。
  5. 将小瓶敞口置于通风橱中一周，使乙醇完全挥发。或者，可在通风橱中用氮气吹干，或使用旋转蒸发仪干燥样品。为避免光敏成分降解，干燥过程中需避光保护。例如，将不透明织物覆盖在通风橱门上。
  6. 用1.0 mL 50%乙醇重悬样品，并涡旋振荡以混匀。

3. 酵母的培养与传代培养14

  1. 维持活性酵母培养物（酿酒酵母W303a重组菌株） S. cerevisiae14通过将酵母在滤膜除菌的葡萄糖培养基中孵育 30 °C每周在新鲜的滤膜灭菌葡萄糖培养基中传代培养酵母。
  2. 在制备YES平板前两个晚上（约42小时），采用无菌操作技术，将0.1 mL活跃生长的酵母菌液接种至10 mL经滤膜除菌的葡萄糖培养基中进行转接培养。于 30 °C 培养两晚。若酵母在无菌的250 mL锥形瓶中以浅层培养方式培养，则无需摇动。
    注意：酵母也可在冷藏的琼脂平板上保存数月。对于长期保存（数年），可将过夜培养物与15 - 50%无菌甘油混合，涡旋混匀后于-80℃冷冻保存。70 °C. 为制备无菌甘油，使用注射器转移 300 µL 将甘油加入冻存管中，松开管盖后进行高压灭菌。然后加入 1,200 µL 采用无菌技术接种酵母过夜培养。

4. 准备YES培养基平板（检测第1天）

  1. 在无菌烧杯中，使用无菌技术将步骤 3.2 中的酵母稀释至 610 nm 处的光密度值为 0.065 ± 0.005（OD610在滤膜除菌的半乳糖培养基中。
    1. 通过移液确认光密度 120 μL 每个酵母样品设三个复孔，并设三个半乳糖空白对照，加入透明聚苯乙烯板中（板无需无菌）。使用酶标仪检测，确保稀释后的酵母培养物净OD值610 0.065 ± 0.005；从酵母OD610读数中减去半乳糖空白对照的OD610读数610 读数以确定净吸光度（OD）610 酵母。每块96孔板至少准备30 mL稀释后的酵母液。 
      注意：可使用分光光度计滤光片在595至610 nm波长范围内测定吸光度。酵母与培养基通常按约1:6的体积比混合时，可得到适宜的OD610 接近 0.065，因此首先将 4.5 mL 酵母加入 30 mL 培养基中，然后根据需要适量添加酵母或培养基以达到目标 OD610 介于 0.060 和 0.070 之间。
  2. 使用无菌技术，根据板式布局，将此稀释后的酵母悬液加入无菌聚丙烯96孔微孔板的各孔中图1). 移液过程中，应通过持续旋转容器或用移液器吹打使酵母菌悬液保持悬浮状态。此步骤建议使用带无菌注射器吸头的多通道移液器。
    注意：聚丙烯板通过将两块叠放的板用铝箔包裹后高压灭菌进行消毒。上方的板作为样品板的盖子，可清洗、重新高压灭菌并重复使用。 
  3. 添加 120 µL 根据平板布局，将过滤除菌的半乳糖培养基加入另外3个孔（H10 - 12）图1）。这些孔用作培养基对照，以校正仅由培养基本身产生的吸光度。
  4. 在每块板中，根据板布局，将ERα（227.5 nM）和ERβ（9.75 nM）的E2工作标准品在含有酵母悬液的孔（A1 - G3）中进行三联样本的系列稀释，构建标准曲线图1）。首先加入 5 µL 将E2标准品加入A1至A3孔中。用移液器吹打混匀各微孔内容物，然后通过转移该悬液进行连续稀释 205 µL 从 A1 - 3 孔转移至 B1 - 3 孔。重复混匀和转移操作 205 µL 至 G 行。
    注意：完成连续稀释后，弃去 205 μL 从 G1 - 3 孔中取出。此步骤结束时，所有标准品孔中均应含有 120 μL系列稀释将得到所列的最终雌二醇（E2）浓度 表1在进行连续稀释步骤时，建议使用带有无菌吸头的多通道移液器。
  5. 添加 5 µL 加入溶剂（50%乙醇）至含有酵母悬液的溶剂对照孔（H1 - 3），具体操作依据平板布局进行图1).
    注意：溶剂对照孔用于量化与酵母细胞及培养基相关的背景吸光度。此外，通过比较OD值，还可检测待测样品的细胞毒性或促生长效应。610 将检测孔的值与溶剂对照孔的值进行比较。
  6. 添加 5 µL 样品和阴性提取对照各设三个复孔，按照平板布局加入含有酵母悬液的孔中图1).
    注意：记录每个孔中加入的样本或阴性提取对照。为便于追踪哪些孔含有样本而哪些没有，建议使用全新的吸头盒，并从吸头盒中的位置取用吸头，使其与微孔板中对应孔的位置一致。一个96孔板最多可容纳23个样本，每个样本设三个复孔。
  7. 用移液器混匀样本、提取对照和阴性对照孔中的内容物。调整这些孔中的体积至 120 µL 通过去除 205 µL 如图注所述，从每个样本中  图1.
  8. 用无菌、带粘性的多孔膜密封培养板。标记培养板，并在37 °C下孵育17 h 30 °C孵育期间无需振荡培养板。

5. YES 平板的处理（检测第2天）

  1. 17小时孵育后 30 °C，从培养箱中取出培养板。若需立即处理培养板，请进行步骤5.1.1；若需在后续日期处理，请进行步骤5.1.2。
    1. 使用多通道移液器混匀每行孔中的溶液，然后转移 50 µL 将每个孔中的酵母悬液转移至透明聚苯乙烯96孔微孔板的对应孔中。
      注意：聚苯乙烯板无需无菌，但应配有盖子。为避免孔间交叉污染，每排孔应使用新的移液枪头；但若使用8通道移液器对三复孔进行加样时，仅需在每组三复孔之间更换枪头。
      1. 标记新培养板。继续进行步骤 5.2。
    2. 为在处理前储存培养皿，需用塑料薄膜包裹。将包裹好的培养皿置于冰箱中冷藏 4 °C 培养6天后，将培养板从冰箱中取出，拆去包装，用移液器按照步骤5.1.1的方法转移所有孔中的内容物。随后进行步骤5.2。
  2. 添加 20 µL 将1 M DTT加入20 mL已解冻并置于室温的LacZ缓冲液中，使DTT终浓度为1 mM。充分混匀LacZ缓冲液。若使用多通道移液器，可将缓冲液分装至试剂储液槽中。 
    注意：请佩戴手套操作，DTT 尽量在通风橱中进行
  3. 使用多通道移液器或重复移液器，加入 200 µL 向聚苯乙烯板的所有孔中加入含DTT以及ONPG或CPRG的LacZ缓冲液，并立即测量并记录OD值610 使用酶标仪测量所有孔的吸光度。如有需要，对其他板重复此步骤。
    注意：OD610 读数用于LacZ计算的分母（步骤6.1）。因此，应在移液后立即获取读数，以避免细胞沉降或被LacZ缓冲液裂解。如果OD610 样品孔的吸光值明显高于或低于OD610 对照孔的数值，样品提取物分别对酵母具有促生长作用或细胞毒性。LacZ 计算将校正各孔间细胞密度的微小差异，但如果差异在任一方向上超过 30%，则需将重建的样品（来自步骤 2.6）用额外的 50% 乙醇稀释，并返回步骤 3.2 重新检测样品。12.
  4. 用盖子盖住培养板。将含有表达ERα的酵母的培养板进行孵育14 在 30 °C 孵育40分钟（ONPG）或3小时（CPRG）。孵育含有表达ERβ的酵母的培养板14 在 30 °C 70 分钟（ONPG）或 4 小时（CPRG）。
    注意：使用CPRG时，孵育时间较为灵活；孵育2–4小时即可对两种受体获得理想结果，延长孵育时间可提高检测灵敏度。
  5. 孵育平板后，使用多通道移液器或重复移液器添加 100 µL 向每孔加入碳酸钠。碳酸钠可提高pH值，从而终止β-半乳糖苷酶反应。
  6. 测量并记录 OD405 （用于ONPG）或OD574 使用酶标分光光度计测定所有孔（用于CPRG）的吸光度。

6. 计算 LacZ 值

注意：LacZ 值用于量化每个样本的颜色变化程度，并通过校正多个变量，提供一种在不同实验之间进行标准化比较的数值方法例如酵母光密度、培养基光密度以及孵育时间（如果同一块板上的各孔之间存在差异）12.

  1. 计算培养基（半乳糖）对照孔（H10-12）的三份平行 OD610 值的平均值，并计算溶剂（50% 乙醇）对照孔（H1-3）的三份平行 OD405 或 OD574 值的平均值。使用这些平均值以及平板显色所需的孵育时间（t，单位为小时）（见步骤 5.5），通过以下公式计算所有标准品孔和样品孔的 LacZ 值（对应于每孔显色程度）：
    LacZ 酶活性计算公式，基于 OD405、OD610，用于 ONPG 实验结果分析。
    酶活性测定中光密度分析的 LaZ 公式；OD574、OD610，CPRG 定量表达式。
    1. 或者，使用附录 1中的自动化应用程序来计算标准品和样品的 LacZ 值。
      注意：应用程序中使用的板布局必须与图 1所示的板布局完全一致。如果某些样品孔未使用，则在将吸光度数据粘贴到附录 1的 LacZ 应用程序中时，应保留空孔的吸光度读数作为占位符。这可以保持应用程序中板的空间布局，并确保培养基对照孔位于正确位置。此外，若存在空单元格，应用程序将无法运行。
  2. 计算每个 E2 标准品和每个样品的三份平行 LacZ 值的平均值。以 µL-1h-1 报告平均 LacZ 值。对每个 E2 标准品的浓度进行对数转换，并按照 template.csv 文件格式生成电子表格文档（附录 2）。

7. 使用四参数逻辑回归法插值计算样品雌二醇当量（EEQ）

注意：EEQ 将样品的 LacZ 值（颜色变化）与使用 E2 建立的标准曲线的 LacZ 值相关联。因此，EEQ 可用于确定样品需要达到与已知浓度 E2 相同的颜色变化反应所需的量。

  1. 为计算待测样品的雌激素当量（EEQ），首先绘制标准曲线。将E2标准品的平均LacZ值（y轴）与其对应的对数转换后的E2浓度（x轴）进行拟合，采用四参数逻辑回归模型。
  2. 利用该模型对待测样品的LacZ值进行插值以计算其EEQ。按照附录2中所述，使用统计软件进行EEQ的逻辑回归计算。

8. 将EEQs（ng/mL）标准化为PCP样品质量

  1. 为了将EEQ与第4.5步中加入每个孔的PCP样品量相关联，需将EEQ（ng/mL）乘以加入样品孔中的总体积（325 µL），再除以加入每个孔中的提取样品体积（5 µL）。
    注意：这些数值表示每毫升提取样品中的EEQ。如果样品是使用1 g PCP制备的，则这些数值也代表每克PCP中的EEQ（ng/g）。以这种方式表示时，可在不同PCP之间比较EEQ值（ng/g）。本研究中测试的个人护理产品对应的EEQ（ng/g）值见表2，整个实验方案过程中收集的示例数据包含在附录3中。

结果

采用本YES方案检测了15种个人护理产品（PCP）的三份重复样品的雌激素活性。正如Miller et al. (2010) 所指出，表达ERβ的酵母检测系统的敏感性比表达ERα的酵母检测系统高出一个数量级以上（图2）14。因此，在表达ERβ的酵母中更常检测到雌激素活性（表2）。8种PCP在ERβ系统中表现出雌激素活性，5种PCP在ERα系统中表现出雌激素活性。护发霜、防晒霜、润肤露和润唇膏样品在两种受体系统中均表现出雌激素活性，而粉底、剃须膏和指甲油仅在测试浓度下对ERβ表现出雌激素活性。其余7种PCP（4种洗发水、2种肥皂和1种润唇膏）在测试浓度下对两种受体均无雌激素活性。

除了受体敏感性的差异外，每个样本的EEQ值还因检测中使用的比色底物（ONPG或CPRG）不同而有所差异（表2）。除一个样品外，使用ONPG测定的EEQ值均高于使用CPRG测定的结果。此外，采用ERβ和CPRG测得的EEQ值在提取重复样本间的变异最小，而采用ERα和ONPG测定的EEQ值变异最大（表 2).

除了比较比色底物外，本研究的另一个目的是测试适合本科生实验课程时间安排的孵育持续时间。典型的酵母雌激素筛查（YES）实验需要17小时的孵育，随后立即在LacZ缓冲液中孵育40分钟至4小时，这种时间安排在每周仅有一节实验课的教学实验室中难以实现。为了便于在教学中使用该实验方法，本研究在17小时孵育后引入了6天的冷藏步骤（步骤5.1.2）。冷藏平板所得的标准曲线与未冷藏平板的结果相当（图2 & 3），但采用四参数逻辑回归模型估算参数时，冷藏平板的所有参数标准误均小于未冷藏平板（表3）。因此，将平板冷藏6天可减少误差，提高雌激素当量（EEQ）估算的准确性。

酵母稀释平板布局示意图；微孔板中含不同添加剂的320 µl酵母样品。
图1. YES检测中的微孔板布局及标准稀释曲线制备。 E2标准品（浅灰色孔）、样品与阴性提取对照（白色孔）以及溶剂对照（H1 - 3）和半乳糖培养基对照（H10 - 12）（深灰色孔）均设置三个重复。通过将320 µL酵母加入A1至A3孔，120 µL酵母加入B1至G3孔，构建E2标准曲线（浅灰色孔）。然后向A1至A3孔中的酵母加入5 µL E2（对表达ERα的酵母为227.5 nM；对表达ERβ的酵母为9.75 nM）。通过将205 µL液体从每孔转移至其下方孔中，对酵母+E2悬液进行连续稀释，最终得到表1中列出的E2浓度。注意，在连续稀释过程结束时，必须从G1至G3孔中弃去205 µL液体，以使每孔终体积为120 µL。样品和阴性提取对照孔通过向320 µL酵母中加入5 µL各提取物（溶于50%乙醇中）制备。溶剂对照孔（H1 - 3）通过向320 µL酵母中加入5 µL 50%乙醇制备。所有样品和对照孔均通过移液混匀，并移除205 µL弃去，以调整每孔体积至120 µL。最后，通过向H10 - 12孔中加入120 µL半乳糖培养基制备培养基对照。为使用附录1中的LacZ计算器以及附录2中描述的基于R的应用程序，E2标准曲线以及溶剂和半乳糖培养基对照必须按图示方式点样。样品和阴性提取对照可点样于任意白色孔中，只要记录点样顺序即可。请点击此处查看该图的放大版本。

显示LacZ与雌二醇关系的雌激素受体检测图；比较ONPG与CPRG方法。
图2. 通过四参数逻辑回归生成的YES板标准曲线。 使用表达两种人源雌激素受体（ERα或ERβ）的酵母，测试了两种底物（ONPG和CPRG），分别在17小时与17β-雌二醇及样品提取物共孵育后，未经（A）和经过（B）6天冷藏处理的条件。所有E2标准品、培养基及溶剂对照均设三个重复。数据点表示三个重复LacZ值的平均值，其中LacZ值反映β-半乳糖苷酶诱导的颜色变化程度。逻辑回归模型参数见表3。ONPG = ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside；CPRG = chlorophenol red-β-D-galactopyranoside。请点击此处查看该图的放大版本。

酶测定中的静态平衡；ONPG/CPRG；比较；多孔板实验结果。
图3. 显色后的YES板示例。 使用表达人雌激素受体（ERα或ERβ）的酵母，测试了两种底物（ONPG和CPRG），分别在17小时与17β-雌二醇或样品提取物共孵育后，未经（左侧）或经过（右侧）六天冷藏处理。所有E2标准品、培养基和溶剂对照均设置三个重复。根据图1，每块板的最上一排为最高浓度E2，最下一排为对照（左侧为50%乙醇+酵母，右侧为半乳糖培养基）。ONPG = ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside；CPRG = chlorophenol red-β-D-galactopyranoside。请点击此处查看该图的放大版本。

标准编号ERα酵母的[E2]（pM）ERβ酵母的[E2]（pM）
13500150
2220894.6
3139359.7
487837.6
555423.7
634915
72209.45

表1. YES实验中使用的E2标准品的最终浓度。
将E2粉末溶于无水乙醇中，然后用50%乙醇稀释至工作储备液浓度，分别为227.5 nM（用于表达ERα的酵母）和9.75 nM（用于表达ERβ的酵母）。随后将工作储备液加入含有在半乳糖培养基中培养的酵母的微孔板孔中，并进行系列稀释，得到表中所示的各浓度。

测试样品检测条件PCPs 的雌激素当量 (EEQs)
PCP 编号样品类型受体底物EEQ 1 (ng/g)EEQ 2 (ng/g)EEQ 3 (ng/g)平均 EEQ (ng/g)
1护发霜ERαONPGND0.379ND<0.379
1护发霜ERαCPRGNDNDNDND
1护发霜ERβONPG0.5280.3380.3630.410
1护发霜ERβCPRGND0.215ND<0.215
4防晒霜ERαONPG6.8031.390ND<4.097
4防晒霜ERαCPRGNDNDNDND
4防晒霜ERβONPG1.3210.8380.8180.992
4防晒霜ERβCPRG0.6510.5910.7250.656
7粉底ERαONPGNDNDNDND
7粉底ERαCPRGNDNDNDND
7粉底ERβONPGND0.158ND<0.158
7粉底ERβCPRGNDNDNDND
9剃须膏ERαONPGNDNDNDND
9剃须膏ERαCPRGNDNDNDND
9剃须膏ERβONPGND0.2560.295<0.276
9剃须膏ERβCPRG0.5070.3920.5600.486
10指甲油ERαONPGNDNDNDND
10指甲油ERαCPRGNDNDNDND
10指甲油ERβONPG0.9160.5030.5540.658
10指甲油ERβCPRG0.5320.6280.5940.585
11乳液ERαONPGNDND2.327<2.327
11乳液ERαCPRGNDNDNDND
11乳液ERβONPG超出检测范围2.5991.845>2.222
11乳液ERβCPRG--1.9861.2361.611
13防晒霜ERαONPG14.06911.49410.18911.917
13防晒霜ERαCPRG4.7735.7905.8505.471
13防晒霜ERβONPG超出检测范围2.580超出检测范围>2.580
13防晒霜ERβCPRG0.2920.240ND<0.266
15润唇膏ERαONPGNDND0.431<0.431
15润唇膏ERαCPRGNDNDNDND
15润唇膏ERβONPG1.2021.0600.8871.050
15润唇膏ERβCPRG0.8200.8710.8510.847

表2. 具有非零EEQ值的PCP产品。 将15种PCP产品及3个提取对照样品各取三份，加入无水乙醇进行匀浆，蒸发后用50%乙醇重新溶解，共得到48个样品，每个样品均采用YES检测法进行三次重复分析。其中8种PCP产品至少有一个非零EEQ值，而7种PCP产品在测试浓度下未表现出雌激素活性。EEQ 1、EEQ 2和EEQ 3分别代表每种PCP产品的三个等分试样，每个试样在不同的微孔板上进行三次重复检测。EEQ 1、EEQ 2和EEQ 3的数值为各等分试样三次重复检测结果的平均值。检测中所用酵母表达了两种人源雌激素受体（ERα或ERβ）中的一种。采用非冷藏方案测试了两种比色底物ONPG和CPRG。EEQ值通过E2在7个浓度下的LacZ值进行四参数逻辑回归分析确定（R2 ≥ 0.98）。ND = 低于检测方法的检出限。-- = 丢失的重复数据。

检测条件模型参数
受体底物4 °C 停止反应 6 天模型 R2生长速率 (LacZ 单位/ng/mL)拐点 (ng/mL)下渐近线 (LacZ 单位)上渐近线 (LacZ 单位)
ERαONPG否>0.998.548 ±1.633-0.512 ±0.025-1.623 ±4.408128.11 ±6.31
ERαONPG是>0.997.618 ±0.758-0.587 ±0.014-8.378 ±2.22399.53 ±2.528
ERαCPRG否>0.998.256 ±2.182-0.610 ±0.0330.853 ±3.33362.52 ±3.473
ERαCPRG是>0.995.068 ±0.616-0.523 ±0.022-3.147 ±1.94668.06 ±3.069
ERβONPG否>0.991.041 ±2.004-0.898 ±4.410-32.98 ±86.62248.6 ±778.9
ERβONPG是>0.994.327 ±1.289-1.736 ±0.0874.654 ±3.08766.37 ±10.75
ERβCPRG否= 0.995.673 ±1.764-1.914 ±0.0523.925 ±1.67928.05 ±2.334
ERβCPRG是>0.994.412 ±1.142-1.894 ±0.0512.052 ±1.30322.64 ±2.047

表3. 标准曲线中四参数逻辑回归的模型参数 图2. 测试了两种底物ONPG和CPRG，使用表达两种人类雌激素受体（ERα或ERβ）之一的酵母，在17小时孵育后，无论是否经过六天冷藏期。参数以估计值±标准误形式报告。

附录1. LacZ值计算程序的应用。 使用该程序前，需先下载免费的Java软件（详见材料表）。然后打开LacZ应用程序。程序中使用的孔板布局必须与图1所示的孔板布局完全一致。如果某些样品孔未使用，请保留空孔的吸光度读数，作为占位符粘贴到LacZ应用程序的吸光度数据集中。这样可保持程序中孔板的空间布局，并确保培养基对照孔位于正确位置。此外，若存在空单元格，程序将无法运行。使用键盘命令“control (ctrl) + v”或“command + v”（根据所用计算机平台而定），将所有孔的OD405读数（用于ONPG）或OD574读数（用于CPRG）粘贴至程序中。在小时栏输入显色反应的孵育时间（来自步骤5.4；例如，40分钟对应0.66667小时）。点击“下一步”。将步骤5.3中获得的OD610读数粘贴进来。点击“提交”。LacZ计算结果将显示出来，可通过按下“control (ctrl) + c”或“command + c”（根据所用计算机平台而定）进行复制。请点击此处下载该文件。

附录2. 计算EEQ的统计软件选项。 EEQ可通过以下三种方式之一进行计算。附录2中提供了使用1. JMP软件或2. R代码的操作说明。此外，R代码还被转换为第3种形式，即应用程序格式，可通过以下网址获取：https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/。请点击此处下载该文件。

附录3. 使用表达ERα和CPRG作为底物的酵母所收集的示例数据。 包括七种E2标准品、溶剂对照和培养基对照以及一个代表性PCP样品的OD610和OD574测量值，以及计算得到的LacZ值。如上文步骤7A和7B所述，使用标准品的LacZ值构建四参数逻辑回归模型的标准曲线。该模型用于内插微孔板孔中代表性样品EEQ的三份重复估计值（单位为ng/mL）。随后将这些值转换为以ng/g样品表示的EEQ（步骤8.1）。请点击此处下载该文件。

讨论

酵母雌激素筛查法（YES）是一种低成本方法，用于检测环境样品（如水、食品、植物组织或个人护理产品）中的雌激素类配体。本文提供的数据比较了两种雌激素受体（ERα 和 ERβ）、两种底物（ONPG 和 CPRG）以及两种实验时间方案（无需冷藏的 2 天方案与需冷藏的 7 天方案），用于通过 YES 检测法测定个人护理产品中的雌激素活性。使用 CPRG 作为底物、表达 ERα 和/或 ERβ 的酵母，并采用冷藏 7 天的实验方案，能够最准确地定量雌激素当量（EEQs），同时也符合每周仅进行一次、每次数小时的本科实验课程的时间限制。事实上，与无需冷藏的 2 天 检测相比，冷藏 7 天的检测方法在不同微孔板重复实验之间的变异更小。此外，采用冷藏检测方法所获得数据的标准曲线线性范围略有扩展。标准曲线的线性部分定义了检测法的检测范围，也是唯一可用于插值计算样品 EEQs 的部分。

在所有测试样品中，除一个样品外，使用CPRG测得的EEQ值均低于使用ONPG定量的结果。由于CPRG具有更高的消光系数以及更低的Km和Vmax，其灵敏度是ONPG的十倍17。因此，CPRG可在较低浓度下使用，并可用于检测更少量的β-半乳糖苷酶。基于这些原因，通常优先选择CPRG而非ONPG18,19。然而，更高的底物灵敏度并不能解释使用CPRG检测到的较低EEQ值。使用ONPG检测到的较高EEQ值可能是由于检测体系中存在基质干扰，这一点已被其他研究者指出2,18。个人护理产品提取物中的黄色色素可能会导致ONPG检测的EEQ值偏高。其他研究者通过在实验设计中加入色素对照来规避这一问题2，但这种方法会使实验所需的培养板数量增加一倍。当可能存在显著基质干扰时，尽管CPRG成本更高且所需孵育时间长于ONPG，但其可能是YES检测中更优选的底物。此外，β-半乳糖苷酶对底物的裂解所引发的颜色变化在使用CPRG时更为明显，有助于学生更直观地观察实验结果。

Miller 等（2010）构建了本实验方案中所用的酵母菌株，他们指出，表达ERβ的酵母对17β-雌二醇的敏感性比表达ERα的酵母高30倍，我们的数据也证实了这一发现14。除质粒构建中可能存在的细微差异外，Miller 等（2010）未能解释这种敏感性差异的原因14。两种质粒构建体之间的一个差异在于，ERα的表达受半乳糖调控，而ERβ的表达则可由葡萄糖或半乳糖调控。YES实验中所用酵母在含葡萄糖的培养基中培养，仅在实验开始稀释时加入半乳糖。因此，在实验开始前，表达ERβ的酵母可能已积累更高数量的受体蛋白，从而导致其对雌激素类配体具有更高的敏感性。

ERα表达酵母的灵敏度较低，可能解释了使用ERα检测时样本中雌激素活性的未检出率高于ERβ的原因。为提高样本EEQs被检出的可能性，使用者可采用不同的提取溶剂和方法，或向酵母中加入更大体积的样本。若使用较大体积的样本，应调整E2标准品的浓度，以确保标准品与样本在检测中使用相同的加样体积。增加样本量的一个限制在于，酵母仅能耐受6–10%的乙醇，且在30℃培养条件下耐受性更佳。 与 35 °C20为控制乙醇对酵母的影响，研究者应设置三份平行样本 "酵母" 将孔板按板布局排列，并确认 OD610 这些 "酵母" 孔的吸光度值与OD相当610 在加入LacZ缓冲液后，立即设置溶剂对照孔。或者，可将溶解于乙醇中的样品加入预先干燥的微量孔板中，在乙醇完全蒸发后再加入酵母。在YES检测中，二甲基亚砜（DMSO）也可用作样品溶剂，但DMSO与酵母反应时的最终工作浓度应限制在1%以内。12.

YES 检测法是一种用于检测环境样品中雌激素活性的强大筛选工具。具体而言，YES 检测能够与核雌激素受体结合的配体，这些配体可与雌激素反应元件相互作用，从而调控基因表达14。然而，YES 检测也存在重要局限性。该方法无法检测通过非核机制起作用的雌激素效应物（EEs），例如通过膜结合雌激素受体发挥作用，或涉及其他元件（如激活蛋白 1（AP-1）转录因子）的机制。此外，由于酵母不具备与哺乳动物细胞相同的代谢能力，因此 YES 无法检测那些需要经代谢活化才能产生雌激素活性的配体。

此外，YES 检测法难以在复杂样品中有效区分雌激素类配体与抗雌激素类配体。相反，它仅能测定 净 雌激素活性，即雌激素和抗雌激素配体的综合效应。为了定量测定雌激素受体拮抗剂的浓度或评估混合物的抑制活性，可通过将酵母与标准激动剂（17β-雌二醇）及一系列浓度的待测样品共同孵育，对检测方法进行改良。12该过程用于确定样本中的拮抗剂是否能够减弱激动剂诱导的报告基因活性，可作为识别样本中是否存在雌激素受体拮抗剂的有效筛选方法。

本文所述方案可适用于多种类型的样品，尽管某些样品可能需要对提取和样品制备步骤进行调整。例如，某些个人护理产品在重复实验中的EEQ值差异较大。这些变异较大的样品往往含有油滴，或本身并非完全均一，表明使用脂溶性更强的溶剂（如乙醚）可能更为有效。或者，可通过使用50%乙醇而非100%乙醇提取样品，以避免个人护理产品中的油脂和蜡质成分被提取出来。使用50%乙醇提取还可捕获更多水溶性雌激素配体（例如，某些色素）。然而，50%乙醇的蒸发速度慢于100%乙醇，因此可能延长提取时间。此外，某些样品（如肥皂）对酵母具有细胞毒性，导致细胞密度测量值降低（OD610）。Fox et al.（2008）建议，若样品孔的细胞密度与溶剂对照孔相比差异超过30%，应对样品进行稀释后重新检测12。

如果将YES检测用于分析性研究目的，可在步骤4.5之前通过检测样本混合物的稀释曲线，预先确定应添加至酵母中的提取物体积。或者，可同时在多个不同体积下测试提取物例如，步骤4.5中向酵母加入5 µL和20 µL提取物）或跨越多个数量级的稀释度（例如0.2 µL、2 µL 和 20 µL。 "适当的" 提取物的体积应根据标准曲线线性范围内与LacZ值相匹配的情况来确定，以识别雌激素活性。优化过程可避免因向酵母中添加过多或过少样品而引起的问题，例如细胞毒性、假阴性结果或超出标准曲线范围的雌激素活性。如上所述，当使用不同量的配体时，应调整样品和E2标准品的加样体积，以确保整块平板上的酵母所接触的乙醇或其他溶剂的体积和浓度保持一致。

尽管存在假阴性结果的可能性，YES检测法已被Schug认定为内分泌干扰物的三级检测工具 等 （2013年），其开发了全面的内分泌干扰分级检测方案（TiPED）21对于本科教育而言，该检测方法在讲授与内分泌干扰、细胞培养、受体结合、酶活性、基因工程、统计学及实验设计相关的概念方面具有重要价值。使用该检测方法的学生还可练习一系列基础且广泛应用的实验技能，包括标准品的系列稀释、样品提取、溶液配制、标准曲线的绘制与插值计算、浓度计算、无菌操作技术的实践、细胞培养、变量与对照的识别、数据的收集、整理与分析、图表的绘制与解读，以及常用实验仪器（如微量移液器和分光光度计）的使用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由路易斯安那理工大学向 TME 和弗曼大学向 AMR 提供的启动资金资助。此外，南部联合学院于2015年向 AMR 和 TME 提供了教师发展资助。  美国国家科学基金会与路易斯安那州校务委员会资助的路易斯安那EPSCoR Pfund项目基金，以及来自南方大学授予TME的差旅奖。我们感谢戴维·尤班克斯博士（Furman大学）在统计分析方面提供的帮助，以及克里斯托弗·摩尔先生在拍摄过程中“伸出援手”。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
涡旋混合器（适用于单管或多管）Fisher Scientific (www.fishersci.com)02-215-365任何型号的混合器均可满足要求。
吊篮式离心机Fisher Scientific (www.fishersci.com)75-063-839只要能够以4000 rpm离心锥形管，任何型号的吊篮式离心机均可满足要求。
本生灯Fisher Scientific (www.fishersci.com)17-012-823任何型号的本生灯均可满足要求，也可使用酒精灯（Fisher Scientific 04-245-1）替代。
培养箱Fisher Scientific (www.fishersci.com)50125590H只要能够维持30 °C，任何型号的培养箱均可满足要求。
微孔板读板仪BioTek (www.biotek.com)EPOCH2只要能够测量405、574和610 nm波长下的吸光度，其他品牌的读板仪也可满足要求。
Gen5 微孔板读板仪与成像软件BioTek (www.biotek.com)GEN5所需软件取决于读板仪的品牌和型号；GEN5软件专为BioTek读板仪设计。
冰箱Fisher Scientific (www.fishersci.com)05LREEFSA只要能够维持4 °C，任何型号的冰箱均可满足要求。
与1 - 10 mL血清移液管兼容的移液器或PipetAidFisher Scientific (www.fishersci.com)13-681-15E只要与1 & 10 mL血清移液管兼容，任何型号的移液器均可满足要求。
P10 微量移液器Fisher Scientific (www.fishersci.com)F144562G只要能够分配5 µl，任何型号的微量移液器均可满足要求。
P200 微量移液器Fisher Scientific (www.fishersci.com)F144565G只要能够分配至多200 µl，任何型号的微量移液器均可满足要求。
P300 多通道移液器Fisher Scientific (www.fishersci.com)FBE1200300只要能够分配50 - 205 µl，任何型号的多通道移液器均可满足要求。
重复移液器Fisher Scientific (www.fishersci.com)F164001G必须能够递送100 - 320 µl；此移液器为可选，因可用多通道移液器替代。
名称公司目录编号备注
耗材
带盖无菌15 mL锥形管Fisher Scientific (www.fishersci.com)05-539-801
玻璃闪烁瓶Fisher Scientific (www.fishersci.com)03-337-4
聚苯乙烯96孔平底微孔板（非无菌，带盖）Fisher Scientific (www.fishersci.com)12565501
聚丙烯96孔平底微孔板（无盖） Cole-Parmer (www.coleparmer.com)EW-01728-81
100 mL玻璃烧杯Fisher Scientific (www.fishersci.com)02-539H只要可高压灭菌，任何型号的玻璃烧杯均可满足要求。
250 mL玻璃锥形瓶Fisher Scientific (www.fishersci.com)FB500250只要可高压灭菌，任何型号的玻璃锥形瓶均可满足要求。
无菌、粘性、多孔薄膜 VWR (www.vwr.com)60941-086
金属镊子Fisher Scientific (www.fishersci.com)12-000-157任何型号的金属镊子均可满足要求。
试剂储液槽Fisher Scientific (www.fishersci.com)07-200-127
过滤装置（0.2 µm）Fisher Scientific (www.fishersci.com)09-761-52
喷瓶（用于乙醇）Fisher Scientific (www.fishersci.com)02-897-10任何实验室用喷瓶均可满足要求。
可高压灭菌的储存瓶Fisher Scientific (www.fishersci.com)06-414-1D任何可高压灭菌的玻璃储存瓶均可满足要求。
10 mL玻璃血清移液管（无菌）Fisher Scientific (www.fishersci.com)13-678-27F任何型号的玻璃血清移液管均可满足要求。
1 mL玻璃血清移液管（无菌）Fisher Scientific (www.fishersci.com)13-678-27C任何型号的玻璃血清移液管均可满足要求。
P10 微量移液器吸头USA Scientific (www.usascientific.com)1120-3810只要与上述微量移液器兼容，任何型号的吸头均可满足要求。
P200 微量移液器吸头USA Scientific (www.usascientific.com)1120-8810只要与上述微量移液器兼容，任何型号的吸头均可满足要求。
P300 微量移液器吸头USA Scientific (www.usascientific.com)1120-9810只要与上述微量移液器兼容，任何型号的吸头均可满足要求。
重复移液器用吸头Fisher Scientific (www.fishersci.com)F164150G仅在使用重复移液器时需要。
无菌培养皿Fisher Scientific (www.fishersci.com)FB0875712任何型号的无菌培养皿均可满足要求。
Parafilm封口膜Fisher Scientific (www.fishersci.com)S37440
名称公司目录编号备注
酵母 
缺失TRP1基因产物的Saccharomyces cerevisiae菌株（例如，W303a）美国典型培养物保藏中心 (ATCC) (www.ATCC.org)MYA-151重组酵母菌株可根据要求向作者索取。
ERα受体/报告质粒Addgene (www.addgene.org)pRR-ERalpha-5Z (质粒 #23061) 
ERβ受体/报告质粒Addgene (www.addgene.org)pRR-ERbeta-5Z (质粒 #23062) 
名称公司目录编号备注
化学品
Difco琼脂BD (www.bd.com)214530
二硫苏糖醇Sigma (www.sigmaaldrich.com)D0632注意：  二硫苏糖醇对皮肤和眼睛具有急性刺激性。  使用适当的个人防护装备（手套、通风橱、防尘口罩），避免皮肤和眼睛接触、吸入或摄入。
邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷Sigma (www.sigmaaldrich.com)N1127
氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷Sigma (www.sigmaaldrich.com)10884308001
酵母氮源基础Sigma (www.sigmaaldrich.com)Y0626
葡萄糖Sigma (www.sigmaaldrich.com)G8270
半乳糖Sigma (www.sigmaaldrich.com)G5388
腺嘌呤硫酸盐Sigma (www.sigmaaldrich.com)A9126
尿嘧啶Sigma (www.sigmaaldrich.com)U0750
亮氨酸Sigma (www.sigmaaldrich.com)L8000
组氨酸Sigma (www.sigmaaldrich.com)H8000
17 β-雌二醇 Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg注意：  雌二醇疑似为致癌物和生殖毒性物质。  吸入、摄入或经皮肤吸收均可能有害。  雌二醇可能对哺乳期婴儿和胎儿造成伤害。  雌二醇对水生生物具有极高毒性。  应使用适当的个人防护（手套、通风橱、防尘口罩），并避免在妊娠和哺乳期间接触。  雌二醇应作为危险废物处理，不得释放至环境中。
100% 乙醇Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)111000200
磷酸二氢钠一水合物Sigma (www.sigmaaldrich.com)S9638
磷酸氢二钠（无水）Sigma (www.sigmaaldrich.com)S0876
氯化镁Sigma (www.sigmaaldrich.com)M8266
氯化钾Sigma (www.sigmaaldrich.com)P9333
Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠盐）Sigma (www.sigmaaldrich.com)L5125
碳酸钠Sigma (www.sigmaaldrich.com)S7795
名称公司目录编号备注
软件
Excel电子表格软件Microsoft Excel是管理数据输出和生成用于R分析的.csv文件的便捷电子表格软件。
Java软件（附录1应用程序所需） Oracle Corporation为使用附录1中的应用程序计算LacZ值，需先下载免费的Java软件（https://www.java.com/en/download/），然后打开附录1中的LacZ应用程序。  可通过在PC键盘上按"control (ctrl) + c"，或在Mac键盘上按"command + c"复制应用程序生成的LacZ结果。
JMP统计软件版本13.0.0SAS Institute附录2提供了使用JMP将LacZ数据拟合至四参数逻辑回归曲线的说明。  该曲线用于相对于雌二醇标准曲线插值测试样品的雌二醇当量（EEQs）。
R统计计算与图形软件R Foundation可从https://www.r-project.org/免费下载R软件。  附录2提供了使用R将LacZ数据拟合至四参数逻辑回归曲线的说明和代码。

参考文献

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