体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

摘要

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。 体外

摘要

心肌梗死及其继发的缺血级联反应导致大量心肌细胞丢失，进而引发充血性心力衰竭，后者是全球死亡的首要原因。间充质干细胞（MSCs）是一种有前景的细胞治疗手段，有望替代目前的侵入性治疗技术。MSCs 可分化为间充质谱系细胞，包括心脏细胞类型，但尚未实现向功能性细胞的完全分化。以往的分化方法主要依赖药理学试剂或生长因子。然而，更具生理相关性的策略也可诱导 MSCs 发生心肌生成性转化。本文介绍一种利用 MSC 细胞聚集体在心肌细胞饲养层上共培养以生成具有收缩功能的心肌样细胞的分化方法。

人脐带血管周围细胞（HUCPVCs）已被证明具有比常被研究的间充质干细胞（MSC）类型（如骨髓间充质干细胞，BMSCs）更强的分化潜能。作为一种发育上更年轻的细胞来源，我们比较了妊娠早期（FTM）HUCPVCs与较年长来源细胞的心肌生成潜能。FTM HUCPVCs是一种新型且丰富的MSC来源，能够保持其 在子宫内 培养时的免疫豁免特性 体外采用该分化方案，FTM和足月HUCPVCs的心肌向分化程度显著高于BMSCs，表现为心肌细胞标志物的表达水平明显升高（即， 心肌细胞增强因子2C、心肌肌钙蛋白T、重链心肌肌球蛋白、信号调节蛋白α和连接蛋白43）。它们还表现出显著较低的免疫原性，表现为HLA-A表达水平较低而HLA-G表达水平较高。采用基于细胞聚集体的分化方法，FTM HUCPVCs显示出更强的聚集体形成能力，并在与心肌饲养层共培养1周内即生成可收缩的细胞簇，成为首个实现该现象的间充质干细胞类型。

我们的结果表明，该分化策略能够有效利用年轻间充质干细胞（如FTM HUCPVCs）的心肌生成潜能，并提示 体外 预分化可能是提高其再生功效的一种潜在策略 体内.

引言

充血性心力衰竭（CHF）仍是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。CHF 常在心肌梗死（MI）后大量心肌细胞丢失并形成无细胞的瘢痕组织这一病理过程中发生¹。尽管心脏是一种具有部分自我更新能力的器官，但负责组织再生的内源性干细胞和祖细胞库在老年患者中数量显著减少，功能也明显下降，通常不足以支持损伤后的充分修复。因此，人们高度关注开发涉及将健康供体细胞移植到受损心肌中的实验性治疗方法。至关重要的是，供体细胞不仅需要恢复心肌组织的结构，还必须实现受累心肌的功能性恢复。

天然心脏利用心脏组织驻留的以及内源性骨髓来源的干细胞进行损伤后的修复^2,3,4。无论是宿主来源还是供体来源的再生细胞，都必须能够在心肌重塑的微环境中获得适当的表型和功能，并具备高效且安全地替代丢失细胞的能力。体外分化方法已被广泛用于实现高效、基于干细胞的心肌细胞生成^5,6。通过心脏谱系标志物的表达谱来定义干细胞向心脏谱系的分化过程⁷。早期分化标志物，如NKX2.5、肌细胞增强因子2C（Mef2c）和GA....

方案

所有涉及动物的研究均按照ARRIVE指南进行并予以报告⁴⁸所有研究均经机构研究伦理委员会批准（REB 编号 454-2011，Sunnybrook 研究所；REB 29889，多伦多大学，加拿大 多伦多）。所有动物实验均经大学健康网络动物护理委员会（加拿大 多伦多）批准，所有动物的饲养和使用均符合《实验动物护理与使用指南》（第8版）的要求。^th （美国国立卫生研究院，2011年版）

1. 组织培养

1. 培养FTM HUCPVCs，足月HUCPVCs（先前已建立）， n 每种至少3个独立的细胞系⁴² 以及在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）混合液的α-最低必需培养基（MEM）中培养 commercially available BMSCs。将大鼠原代心肌细胞及MSC-心肌细胞共培养体系培养于含10% FBS和1% P/S的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM-F12）中。
   注意：使用 0.2-µm 滤器对培养基进行灭菌。配制好的培养基溶液于 4 °C 保存，可存放长达 3 周。
2. 在湿润培养箱中维持细胞培养（95% 相对湿度、37 °C、5% CO₂）₂）并在相位对比显微镜下观察细胞融合度达到70-80%时进行传代。....

结果

HUCPVCs 与 BMSCs 相比表现出更强的聚集体形成能力以及更高的 CD49f 表达水平：

为了诱导hMSCs的分化（即， FTM HUCPVCs、足月HUCPVCs和BMSCs）未分化的MSCs或含MSC的悬滴的单细胞悬液表1) 分别转移至大鼠原代心肌细胞单层培养物上，以建立直接共培养或聚集体共培养体系。三种不同类型的间充质干细胞在直接共培养中表现出相似的丰度和形态特征。图1A）。在将悬滴转移至心脏细胞聚集体共培养后2-3天表1），FTM 和足月 HUCPVCs 形成的聚集体较大（分别为 310 µm ± 30 µm 和 240 µm ± 40 µm），而 BMSCs 的聚集体较小（180 µm ± 30 µm）；

讨论

干细胞向心肌细胞的分化研究已持续二十余年，目前已有多种不同策略用于从间充质干细胞来源生成类似心肌细胞的细胞。然而，这些策略中的许多效率较低，且所采用的培养条件往往不能代表移植细胞在体内所遇到的实际微环境。 体内.

与现有方法相比，本研究中介绍的方案利用了原代心肌饲养层与间充质干细胞（MSC）聚集体形成的组合。原代心肌饲养层提供了一种类似于人源间充质干细胞（hMSCs）移植后所处的分化环境。聚集体则形成了具有氧气和营养物质梯度的微环境，这种梯度可诱导细胞启动谱系定向分化。基于多能干细胞（PSC）和胚胎干细胞（ESC）的心肌分化策略已证实，低氧预处理和聚集体形成对干细胞具有此类诱导作用^5,52,53。此外，三维结构更接近体内（in vivo）的细胞间连接方式。采用该方法，我们成功获得了同步收缩的人源间充质干细胞（hMSC）聚集体——据我们所知，这是首次实现此类hMS.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25200056	用于细胞解离
Alpha-MEM	Gibco	12571071	用于HUCPVC和BMSC培养基
PE标记的抗人/小鼠CD49f抗体	Biolegend	313612	FC 的整合素标记物
APC标记的人源Cx43/GJA1抗体	R&D Systems	FAB7737A	FC的连接蛋白43标记物
FITC标记的HLA-A2抗体	Genway Biotech Inc.	GWB-66FBD2	FC 的免疫原性标志物
FITC标记的抗HLA-G [MEM-G/9] 抗体	Abcam	ab7904	FC 的免疫原性标志物
FITC标记的小鼠抗人SIRPA/CD172a抗体	AbD Serotec/Bio-Rad	MCA2518F	心脏标志物用于FC
APC标记的人TRA-1-85/CD147抗体	R&D Systems	FAB3195A	用于流式细胞术和荧光激活细胞分选的人类细胞标志物
FITC标记的人TRA-1-85/CD147抗体	R&D Systems	FAB3195F	用于流式细胞术和荧光激活细胞分选的人类细胞标志物
抗连接蛋白43/GJA1抗体	Abcam	ab11370	Cx43。用于免疫细胞化学
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555	Life Technologies	A-21428	用于免疫细胞化学
抗肌节α-辅肌动蛋白[EA-53]抗体	Abcam	ab9465	aSARC。用于免疫细胞化学
山羊抗小鼠IgM重链交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555	Life Technologies	A-21426	用于免疫细胞化学（ICC）
Mef2C (D80C1) XP 兔抗体	New England BioLabs Ltd.	5030S	用于免疫细胞化学
驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记	Life Technologies	A-21206	用于免疫细胞化学
抗核抗体（HuNu）（克隆 235-1）	EMD Millipore	MAB1281	用于免疫细胞化学
MZ9.5 体视显微镜	Leica		用于成像聚集物。
1.5 ml 离心微量管	Axygen	MCT-150-C	用于使用荧光染料对间充质干细胞进行染色。
ImageJ			开源图像处理软件
Aria II	BD		UHN SickKids FC 设施。用于细胞分选。
骨髓间充质基质细胞	Lonza	PT-2501	BMSCs
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030-100G	BSA。用于免疫细胞化学（ICC）溶液的配制
BrdU	EMD Millipore	MAB3424	注意：BrdU 是一种强致畸剂，且疑似具有致突变性。使用前请确保接受过适当培训，并查阅安全数据表（SDS）。
第二歌	BD		UHN SickKids FC 实验室。用于流式细胞术。
cDNA EcoDry 预混液	Clontech/Takara	639570	用于qPCR的cDNA制备
CellTracker Green CMFDA 染料	Life Technologies	C7025	细胞质的荧光成像
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen 公司	C10227	用于细胞计数
DMEM-F12	Sigma-Aldrich	D6421	大鼠原代心肌细胞培养基
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023	D-PBS，不含 Ca2+，Mg2+
EVOS	Life Technologies		自制荧光显微镜
FACSCalibur	BD		内部使用。用于流式细胞术。
胎牛血清（Hyclone）	GE Healthcare	SH3039603	FBS。细胞培养基的组分。
IDT Prime Time qPCR 探针	集成数据技术	FAM 荧光团	http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor 水性封片介质	赛默飞世尔科技	TA-030-FM	用于进行免疫细胞化学的细胞储存
LSR II	BD		UHN SickKids FC 设施。用于流式细胞术。
MoFlo Astrios	贝克曼库尔特		UHN SickKids FC 设施。用于细胞分选。
正常山羊血清	细胞信号技术公司	5425S	NGS。用于免疫细胞化学封闭液中
Nunc Lab-Tek II 培养皿盖玻片，8 孔	赛默飞世尔科技 Nunc	155409	用于免疫细胞化学的样本制备
OmniPur Triton X-100 表面活性剂	EMD Millipore	9410-OP	作为制备细胞进行免疫细胞化学染色时的透化溶液组分
16% 甲醛溶液，电镜级	电子显微镜科学公司	15710	用于ICC细胞固定。
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	细胞培养基组分。
引物	Sigma	定制标准DNA寡核苷酸，脱盐，0.2 μmol	<强>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A <强>CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A <强>MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T <强>MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum 转盘共聚焦显微镜	Zeiss		病童医院影像中心
ReproCardio 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞	ReproCell	RCD001N	qPCR 阳性对照
RNeasy mini试剂盒	Qiagen	74106	用于qPCR的RNA提取
Rotor-Gene SYBR Green PCR 试剂盒	Qiagen	204074	使用预混液进行qPCR
RPMI 1640	Gibco	A1049101	用于间充质干细胞与单核细胞共培养的培养基
TaqMan qPCR 引物检测	赛默飞世尔科技	4444556	用于qPCR
台盼蓝	Life Technologies	T10282	细胞活力染色与计数
胰蛋白酶	Gibco	272500108	用于细胞解离
Volocity	Perkin-Elmer	Volocity 6.3	成像软件
0.2 μ微孔滤膜	赛默飞世尔科技	566-0020	用于组织培养基的灭菌
HERAcell 150i CO₂ 培养箱2 培养箱	赛默飞世尔科技	51026410	用于细胞孵育
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537	PBS，1×，不含氯化钙和氯化镁
镊子	Almedic	7727-A10-704	用于持取大鼠心脏。可使用任何类似的镊子。
剪刀	精细科学工具	14059-11	用于切碎大鼠心脏。推荐使用弯头剪刀。
50 mL 离心管	BD Falcon	352070	用于心肌细胞收集及常规组织培养操作过程中的收集
15 mL 离心管	BD Falcon	352096	组织培养常规操作步骤
6孔板	赛默飞世尔科技 Nunc	CA73520-906	用于组织培养
10 cm 组织培养皿	康宁	25382-428	用于聚集体形成
Axiovert 40C 显微镜	Zeiss		用于整个组织培养及后续实验步骤中的明场成像
70 μm细胞滤筛	Fisherbrand	22363548	为确保流式细胞术或分选前获得单细胞悬液
Triton X-100	EMD Millipore	9410-1L	用于免疫细胞化学的透化溶液中
Hoechst 33342	赛默飞世尔科技	H1399	用于观察Cx43定位的染色剂