测量水合玻璃在低温下的密度

摘要

本文描述了一种用于测定微升至皮升级水溶液混合物在低温条件下玻璃化相密度的实验方案。

摘要

我们展示了一种用于测定水溶液混合物及其他需要快速冷却样品的玻璃态低温密度的方法，以制备目标低温相态。通过将微升至皮升级别的液滴喷射至液氮-氩（N₂–Ar）低温混合物中实现快速冷却，随后在保持低温的条件下利用显微成像结合精确的体积与质量测量技术测定其密度。该方法适用于研究在快速冷却过程中形成非晶态固相的液体体系，可广泛应用于低温生物学、冷冻保存及材料科学领域。 关键词：玻璃态，低温密度，快速冷却，液滴，液氮-氩混合物，显微成像，非晶态相，冷冻制备₂-Ar) 混合物。通过一种与X射线衍射测量结果相关的视觉检测方法，评估液滴的低温相态。液态N₂的密度₂-通过添加 N₂ 调节 Ar 混合气₂ 或直至液滴达到中性浮力。利用测试质量块和阿基米德原理测定该混合物及液滴的密度。若在液滴制备过程中采取适当措施，妥善管理液态低温混合物上方的气体以尽量减少结冰，并定期搅拌低温混合物以防止密度分层和相分离，则可实现高精度的密度测量，准确度可达 <可轻松测定小至50 pL的液滴，其检出率可达0.5%。对水性冷冻保护剂混合物的测量有助于理解冷冻保护剂的作用机制，并提供定量数据，以促进生物样本低温保存过程中的热收缩匹配。

引言

水及其各种相态下水溶液混合物的物理性质具有基础性研究意义，对于生物系统的体内（in vivo）和体外（in vitro）研究也至关重要。在现代低温生物学和生物样本低温保存领域，含水冷冻保护剂混合物的玻璃态或非晶态尤其受到关注^1,2。冰晶的成核与生长会破坏细胞和组织，并促进蛋白质变性与聚集，因此使溶剂实现玻璃化的低温保存方案正变得日益普遍。在生物大分子晶体学中，溶剂在生物大分子之间通道中的结晶会破坏晶体晶格并降低衍射性能。通过快速冷却、脱水以及添加甘油、乙二醇、聚乙二醇（PEGs）、醇类和盐类等冷冻保护性溶质，可实现玻璃化。

玻璃化可限制冰晶的形成与生长，但并不能完全消除与冷却相关的样品损伤。例如，当蛋白质晶体被冷却至玻璃化状态时，其晶格镶嵌度（反映晶面取向分布的指标）通常会增加10至100倍³，且玻璃化后的精子细胞和卵母细胞在复温后的存活率差异较大。

一种损伤机制是在冷却过程中溶剂与周围材料的差异性收缩^3,4,5。晶体、细胞或组织内的溶剂....

方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。使用压缩气体时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用经过适当校准的气体调节器和阀门，以及经过认证的气体管路。接触液态低温液体可能导致严重的冻伤和组织坏死。使用液态低温液体时，应穿戴适当的个人防护装备（如面罩、手套、实验服、长裤、不露脚趾的鞋子），所有防护装备必须能够防止液氮渗透。操作液态低温液体时应保持站立姿势，并确保设备周围有畅通无阻的撤离通道。使用压缩气体和液态低温液体时，需警惕窒息风险，应在通风良好、具有充足补风的区域进行操作（如通风橱或高换气频率的房间）。

1. 密度测量用 aqueous 溶液的制备

注意：由于质量比体积更容易精确测量，因此溶液浓度以质量/质量（w/w）单位表示。所有密度以及熔点或沸点均基于大气压力约为 100 kPa 的条件。以下步骤描述了 35% w/w 甘油溶液的配制方法。相同方法也可用于其他浓度和溶质的溶液制备。

1. 针对每种关注的溶质类型和浓度，大致估算所需溶质质量，以获得目标终浓度（例如，25% w/w 至 100% w/w 之间），总体积为 V_tot = 10 mL 溶液。例如，对于 35% w/w 的甘油溶液（ρ_s = 1.26 g/mL），溶质质量 m_s 为：
   

结果

密度测量在 T = 77 K 下玻璃化冷冻的甘油和乙二醇水溶液液滴随冷冻保护剂浓度变化的情况如图所示 图1A 和 图1B 分别为，以及比容相应的变化 T = 298 K 和 77 K，根据先前确定的数据计算得出 T = 298 K 密度，如图所示 图2在高浓度冷冻保护剂溶液中，冷却至玻璃化状态时溶液会收缩，而纯水则会膨胀。预测两种冷冻保护剂在浓度约为20–25% w/w时，体积变化接近零，无明显膨胀或收缩。体积变化的斜率 与 浓度在40% w/w以下时影响最为显著，此时额外添加的冷冻保护剂对水的四面体低温结构的作用最为明显。

讨论

本装置和方法主要由本科生开发，所用仪器制造工具和设备有限，但仍可对小至50 pL的单个液滴实现高精度密度测量。在质量分数接近或高于50%的浓度范围内，仅需较小的冷却速率即可获得玻璃化样品，测得的密度与先前对体相样品测量的结果一致。将当前测得的密度外推至0%浓度（纯水）时，其结果与77 K下低密度非晶冰的公认密度值也高度吻合⁹。

生成所需的N₂-Ar混合气体所需时间介于30分钟至5小时之间，具体取决于最终N₂-Ar密度，该密度需使特定液滴组成达到中性浮力。若使用扩散器或多根气体导管以增加氩气在低温液体中的混合表面积，可缩短该时间。调节N₂-Ar密度直至确认液滴处于中性浮力状态也可能耗时较长，尤其对于半径较小（r）的液滴，因其终端速度较小（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心管	Falcon	6029236	15 mL 圆锥形离心管
甘油， >99.5%	Sigma	G9012-100 mL
乙二醇 >99.8%	Sigma	324558-100 mL
分析天平	Mettler	AE240	分析天平，0.01 mg 精度，底部带挂钩，用于天平下方称重
涡旋振荡器	科学工业公司	SI-0236	Vortex-Genie 2
仪器外壳框架	Unistrut	1-5/8" 金属框架	48" 宽 x 24" 深 x 40" 高
装置外壳空气屏障			任何透明塑料薄膜
氯丁橡胶圆盘			4" 直径，1/8" 厚
杜瓦瓶	Scilogix Dilvac	SS333	4.5升杜瓦瓶，带钢制外壳和卡箍盖
铜室			该制备部件由一个1.43" 直径，0.017" 壁厚铜管，一端焊接实心圆柱形铜底以密封。  铜基为0.87" 高，整个腔室高度为7".
氮气	Airgas	NI HP300	99.998% 纯度的 N2 气体
氩气	Airgas	AR HP300	99.998% 纯 Ar 气体
转子流量计	Omega	FL3692ST	最大流速 2.52 L/min
泡沫隔热盖			该部件由 4 lb/ft 的材料制成3 交联聚乙烯泡沫（由 Technifab 公司提供，地址：俄亥俄州阿冯 Chester Industrial Parkway 1355 号），外径为 2.42"，以及1.52的ID"，厚度为0.79".
PTFE 测试质量块			该制备部件为0.246" 直径，0.580" 高圆柱体，直径为0.060" 直径为0.10的孔，垂直于圆柱轴线并与之相交" 从一端。
微量天平平台	Unistrut	1-5/8" 金属框架	11" 宽 x 24" 长 × 24" 带有顶部铝板的高矩形框架，铝板上设有用于单丝和悬挂测试质量的孔
50微米单丝线	伯克利	NF1502-CM	纳米纤维鱼线
氩气预冷却盘管管路	VWR	60985-512	1/8" ID x 1/4" OD PVC 管
穿孔铜箔混合器			1.4" 直径，  35微米厚的铜片，由1盎司/平方英尺的铜箔切割而成2 铜片用尖锥或其他尖锐工具打孔。  将直径为1-2 mm的刚性隔热材料棒（塑料或木制）插入中心位置，并根据需要使用环氧树脂固定。
注射器	BD	309628	1 mL 鲁尔锁头注射器
真空发生器	胃	VG-015-00-00	压缩空气文丘里单级真空发生器
疏水涂层喷雾	RainX	620036	塑料防水
长焦距立体显微镜	博士伦 Stereozoom 6		0.67-4倍变焦镜筒，配20倍目镜，工作距离10 cm
LED环形照明器	Amscope	LED144S
LED点光源照明器	纽豪斯照明	NHCLP-LED	3W LED 鹅颈夹灯
1.8 ml 冻存管	Nunc	V7634-500EA	任何1.8或2 mL冻存管均可使用