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方法文章

优化的人类二尖瓣蛋白质提取方案

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DOI：

10.3791/55762

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2017年6月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

本文内容

摘要

由于人类二尖瓣的细胞含量较低，因而蛋白质合成水平较低，这使得其分析变得复杂，目前人类二尖瓣的蛋白质组成仍部分未知。本研究提供了一种高效提取蛋白质的方案，可用于二尖瓣蛋白质组的分析。

摘要

由于技术的发展使得能够在复杂的生物系统中大规模鉴定和定量存在的蛋白质，因此对细胞蛋白质组的分析有助于阐明疾病背后的分子机制。通过蛋白质组学方法获得的知识有望加深对疾病致病机制的理解，从而有助于发现新的诊断和预后标志物，并有望发现治疗靶点。然而，心脏二尖瓣因其富含蛋白聚糖和胶原的细胞外基质中细胞含量极低，成为蛋白质组学分析中极具挑战性的样本。这使得提取用于全局蛋白质组学分析的蛋白质变得困难。本研究描述了一种适用于后续蛋白质分析（如定量蛋白质组学和免疫印迹）的实验方案。该方法可实现蛋白质表达数据与定量mRNA表达数据以及非定量免疫组织化学分析数据之间的关联。事实上，当这些方法联合使用时，将有助于从mRNA到翻译后蛋白质修饰，更全面地理解疾病背后的分子机制。因此，该方法对于致力于心脏瓣膜生理病理学研究的研究人员具有重要意义。

引言

最近的研究证据改变了人们对 mRNA 合成后多种调控机制作用的理解。实际上，翻译、转录后及蛋白水解过程均可调节蛋白质的丰度与功能。过去认为 mRNA 浓度可作为相应蛋白质浓度的替代指标，即转录水平是蛋白质丰度的主要决定因素——这一教条已得到部分修正。事实上，转录本水平仅能部分预测蛋白质丰度，表明细胞内存在转录后事件对蛋白质进行调控1,2。

此外，蛋白质最终决定细胞的功能，从而决定其表型，而表型可因自分泌、旁分泌和内分泌因子、血液传播介质、温度、药物处理以及疾病发展等因素发生动态变化。因此，针对蛋白质水平的表达分析有助于表征蛋白质组，并揭示疾病发病机制中发生的关键性改变3。

因此，尽管目前仍存在技术挑战，蛋白质组学在阐明健康与疾病状态方面所展现出的潜力极为巨大。蛋白质组学可贡献的特别有前景的研究领域包括：在任何水平上鉴定异常的蛋白质表达（即， 完整的细胞或组织、亚细胞结构以及生物流体；用于疾病诊断和预后的新生物标志物的鉴定、验证与确认；以及有望发现可用于治疗目的的新蛋白质靶点，同时用于评估药物的有效性与毒性4.

解析蛋白质组的复杂性是一项技术挑战。当前的蛋白质组学工具能够对蛋白质水平的变化进行大规模、高通量的分析，实现蛋白质的鉴定、定量和验证。此外，通过引入分级和富集技术，可避免高丰度蛋白质的干扰，从而有助于检测低丰度蛋白质，提高蛋白质的鉴定能力。最后，蛋白质组学还结合了翻译后修饰的分析，这类修饰正逐步被认识到是调控蛋白质功能的重要因素。

然而，待分析生物样本的样品制备与蛋白质回收仍是蛋白质组学工作流程中的限制性步骤，并增加了出现潜在偏差的可能性5。事实上，在大多数需要优化的分子生物学技术中，最初的步骤是组织匀浆和细胞裂解，尤其是在分析无扩增方法可用的低丰度蛋白质时尤为关键。此外，蛋白质的化学性质可能影响其自身的回收效率。例如，高疏水性蛋白质的分析极具挑战性，因其在等电聚焦过程中极易发生沉淀；而跨膜蛋白质则几乎不溶（详见参考文献5）。此外，组织成分的差异性为建立通用提取方法带来了显著障碍。最后，由于几乎所有临床样本的量均有限，因此必须能够在最小样本量的基础上实现蛋白质制备的最大回收率与可重复性6。

本研究描述了一种从正常人的心脏二尖瓣中提取蛋白质的优化方案，而正常二尖瓣是蛋白质组学分析中极具挑战性的样本。正常二尖瓣是一种复杂的结构，位于心脏左心房与左心室之间（图1）。它在调控血液从心房流向心室的过程中发挥重要作用，防止血液反流，并确保向全身提供充足的氧气供应，从而维持适当的心输出量。然而，该组织常被视为一种“非活跃”组织，细胞含量较低，主要成分为细胞外基质。这是因为在正常状态下，瓣膜间质细胞（valvular interstitial cells, VICs）呈现静息表型，其蛋白质合成速率较低7。

然而，已有研究表明，在病理状态下，间质层中的心内膜瓣膜间质细胞（VIC）数量增加，其蛋白质合成被激活，并伴随其他功能和表型的改变8。因此，文献中现有的少量数据主要集中于对病变二尖瓣的分析9,10，其中增多的活化VIC可能解释了所鉴定出的蛋白质数量相对较多的现象。

总之，本方案可通过研究二尖瓣的蛋白质组分，有助于加深对二尖瓣疾病致病机制的理解。实际上，对潜在病理过程的更深入认识，可能有助于改善瓣膜疾病的临床管理，而目前干预措施的指征在很大程度上依赖于血流动力学因素。

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方案

在本方案中，人类心脏在多器官移植摘取期间收集（冷缺血时间为4-12小时，平均6 ± 2 小时）内来自因技术或功能原因被排除在器官移植之外的多器官捐献者，尽管其超声心动图参数正常。这些组织被送往意大利米兰莫津诺心脏中心（Milan, Italy）的心血管组织库，用于保存主动脉瓣和肺动脉瓣。二尖瓣后叶未用于临床用途，因此在获得捐献者家属知情同意后，于主动脉瓣和肺动脉瓣分离过程中收集。用于移植和研究的组织仅在获得家属同意后采集；在知情同意书中，家属授权（或拒绝）在心脏组织不适合临床应用时，将其用于科研目的。即， 微生物学、功能及血清学问题），遵循Monzino心脏中心伦理委员会的指南。

1. 二尖瓣制备

  1. 在器官摘除后尽快获取人二尖瓣（冷缺血时间为4-12小时）。
  2. 在洁净室中，从盛有冷（4 °C) 溶液 (即， 生理盐水或平衡液（Eurocollins 或 Wisconsin）。将其放入容器中，并置于生物安全柜（A 级垂直气流，符合药品生产质量管理规范（GMP）标准）内，以进行瓣膜制备。
  3. 将心脏置于超净台内的无菌一次性铺巾上。使用无菌一次性手术刀，在左心室和右心室水平、距心尖约4 cm处，沿与心脏长轴垂直的方向将心脏完全切开。
  4. 移动升主动脉和肺动脉以显露左心房顶部。
  5. 使用无菌可高压灭菌的镊子和解剖针，在左心房顶部围绕左心耳进行剪切，使二尖瓣暴露，以便识别较大的二尖瓣前叶和较小的二尖瓣后叶。
    注：前外侧交界和后内侧交界定义了前叶与后区的边界。
  6. 使用无菌可高压灭菌剪刀和无创伤镊子，解剖左心房及整个二尖瓣周围的心室壁厚度.
  7. 识别二尖瓣-主动脉瓣连续性。
    注意：左心室包含完整的二尖瓣及其腱索。
  8. 将前叶与后叶分离，沿后叶与心室连接处（交界处）进行切割。
  9. 用生理盐水冲洗后瓣膜。将瓣膜切成小块（<1 cm2）并用铝箔单独包裹，用液氮速冻。
    注意：使用液氮时，请遵循机构的安全操作规程。
    1. 实验结束后，使用70%异丙醇溶液和6%过氧化氢溶液对柜内台面进行消毒。

2. 蛋白质提取

  1. 使用镊子夹取保存在液氮中的样品，并在仍包裹着铝箔的情况下立即置于干冰上。在任何转移过程中均不得让样品解冻。
  2. 研磨前，将研磨系统中的瓷/氧化锆研钵和研杵预冷例如， CryoGrinder) 及样品一起放入盛有液氮（约 500 mL）的杜瓦瓶中。
    注意：使用液氮时，请遵循机构的安全操作规程。
  3. 将研钵和研杵放入装有干冰的聚苯乙烯盒中。将样品从铝箔中取出，放入研钵中。
  4. 用研钵和大研杵研磨样品15-20次，使用螺丝刀旋转研杵。研磨过程中，用预冷的刮勺尖端混合样品。
    1. 用小研杵重复上述操作。
  5. 将研磨后的样品转移至预先称重的离心管中（例如， 将15 mL离心管倒置，置于研钵上方，然后将两者一同翻转，使样品转移至离心管中。使用预冷的刮勺回收研钵中全部材料。
    1. 将装有样品的离心管置于干冰上，以避免转移过程中样品解冻。
  6. 计算样品的净重。
  7. 每次样品处理后清洁研钵和研杵，并通过高压灭菌或加热对其进行去污染处理 200 °C 2小时。
  8. 将离心管中的粉末样品通过倒置转移至匀浆器的玻璃管中。
  9. 加入过滤的尿素缓冲液（8 M 尿素，2 M 硫脲，4% w/v CHAPS，20 mM Tris，55 mM 二硫苏糖醇）至玻璃管中， 200 µL 每10 mg粉末组织加入尿素缓冲液
    注意：可使用计算体积的部分尿素缓冲液回收离心管中残留的粉末样品。
  10. 使用配备有硼硅酸盐玻璃研钵和聚四氟乙烯（PTFE）研杵的搅拌器匀浆样品。以扭转动作（1,500 rpm）缓慢将研杵压向样品，重复10次。
  11. 收集上清液并转移至一支洁净的1.7 mL离心管中。再次用新鲜的尿素缓冲液提取剩余样品，加入体积为第一次提取所用体积的一半。
  12. 重复步骤 2.10。
  13. 回收上清液，并与步骤 2.11 中的上清液合并。将合并后的上清液置于管式旋转仪上旋转 30 分钟。
  14. 将离心管在13,000 x g条件下离心30分钟 4 °C.
  15. 回收上清液，按照 Bradford 蛋白质测定试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度。将样品于 -80 °C 直至使用。

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结果

在尿素缓冲液中提取并溶解蛋白质，可直接适用于基于等电聚焦的蛋白质组学方法（双向电泳（2-DE）11 和液相等电聚焦（IEF）12），以及在含有蛋白酶抑制剂混合物14的Laemmli缓冲液中稀释后进行的免疫印迹分析13。

对于基于质谱的无凝胶方法（即， 液相色谱联合数据非依赖型质谱分析（LC/MS）E）以及二维液相色谱-质谱联用（LC/MS）E 二维液相色谱-质谱联用技术E))15，使用所述尿素缓冲液提取的样品需要进一步处理以去除可能干扰后续蛋白质消化和液相色谱分离的尿素和硫脲。此脱盐步骤可使用商用蛋白质沉淀试剂盒完成，按照制造商说明书...

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讨论

该方案的一个关键步骤是使用液氮冷冻样品并冷却研磨系统。液氮可防止生物降解并实现有效的样品粉碎，但其操作需要经过专门培训以确保安全使用。

本方案采用研磨仪系统进行样品研磨，因为小样品难以从标准的研钵和研杵中完全回收。在这种情况下，小样品会以细粉形式散落在研钵表面，导致收集困难。另一个优点是研磨仪为电动驱动，可更高效、可重复地处理更多样品，且避免操作者疲劳。然而，使用研磨仪的一个限制是样品尺寸必须较小（100 mg 或更少），以便研杵能够有效压紧研钵中的样品。此外，研磨仪的组件在每次使用之间必须恢复至室温以便清洁。因此，该过程耗时较长，若每日需处理大量样品，则需要配备多套研磨组件。

另一个关键步骤是提取缓冲液的配制。盐浓度，特别是尿素（8 M）和硫脲（2 M）的浓度相当高，因此盐的体积几乎占溶液总体积的一半。此外，溶解过程较为困难，因为必须避免加热，因为在超过 37 °C 时，尿素可导致蛋白质/多肽的 N 末端以及赖氨酸和精氨酸残基侧链氨基发生蛋白质氨甲酰化17。尿素缓冲液溶解后必须...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到意大利卫生部的支持（RC 2013-BIO 15）。我们感谢 Barbara Micheli 提供出色的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生理盐水溶液0.9 % NaCl
Eurocollins ASALF30874046平衡器官运输培养基。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，以获得平衡培养基 Eurocollins
Eurocollins BSALF30874022平衡器官运输培养基。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，以获得平衡培养基 Eurocollins
WisconsinBridge lifeRM/N 4081平衡器官运输培养基
生物危害垂直气流柜BurdinolaA 类 GMP 分级
杜瓦瓶Thermo ScientificNalgene 4150-1000
冷冻研磨系统OPS diagnosticsCG 08-01包含研钵、研杵和螺丝刀的研磨系统
不锈钢镊子
不锈钢刮勺
一次性无菌手术刀MedisafeMS-10
不锈钢剪刀可高压灭菌
不锈钢取样针可高压灭菌
一次性无菌铺巾Mon&Tex3.307.08
含异丙醇的消毒液70% 异丙醇
含过氧化氢的消毒液6% 过氧化氢
1 mL 微量移液器及吸头
15 mL 离心管VWR international9278
1.7 mL 离心管VWR internationalPIER90410
尿素缓冲液8 M 尿素，2 M 硫脲，4 % w/v CHAPS，20 mM Trizma，55 mM 二硫苏糖醇
尿素Sigma aldrichU6504-1KG用于配制尿素缓冲液
硫脲Sigma aldrichT8656用于配制尿素缓冲液
CHAPSSigma aldrichC3023-5GR用于配制尿素缓冲液
二硫苏糖醇Sigma aldrichD0632-5G用于配制尿素缓冲液
50 mL 注射器PIC用于过滤尿素缓冲液
0.22 µm 滤器MilliporeSLGP033RB用于过滤尿素缓冲液
PFTE 研杵，2 mLKartell6302Potter-Elvehjem 匀浆器的组成部分
硼硅酸盐玻璃研钵Kartell6102Potter-Elvehjem 匀浆器的组成部分
搅拌器VELP scientificaStirrer DLH用于 Potter-Elvehjem 法匀浆
Bradford 蛋白质测定试剂盒Bio-Rad laboratories5000006
试管旋转混合仪Pbi InternationalF205
液氮
铝箔
冰
聚苯乙烯盒
干冰
离心机用于在 13,000 x g 条件下离心 1.7 mL 离心管
–80°C 超低温冰箱
精密天平
高压灭菌器用于灭菌
液氮用低温防护手套
手套
专业强制通风与自然对流烘箱用于灭菌
蛋白酶抑制剂混合物Sigma aldrichP8340-5ML100X 溶液
ProteoExtract 蛋白质沉淀试剂盒Calbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.orgversion 2.7用于基因本体分析的软件平台
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoversion 3.0.3基因本体分析插件
AlphaB 晶体蛋白/CRYAB 抗体Novus BiologicalsNBP1-97494抗 CryAB 的小鼠单克隆抗体
Septin-11 抗体Novus BiologicalsNBP1-83824抗 septin-11 的兔多克隆抗体
FHL1 抗体Novus BiologicalsNBP-188745抗 FHL-1 的兔多克隆抗体
皮肤素抗体Novus BiologicalsNB110-68135抗皮肤素的兔多克隆抗体
羊抗小鼠 IgG HRPSigma aldrichA4416-0.5ML免疫印迹用二抗
羊抗兔 IgG HRPBio-Rad laboratories170-5046免疫印迹用二抗

参考文献

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