从人体二尖瓣提取蛋白质的优化方案

Summary

人二尖瓣的蛋白质组成仍然是部分未知的，因为其分析由于细胞数量低，因此通过低蛋白质生物合成而复杂化。这项工作提供了有效提取蛋白质用于二尖瓣蛋白质组分析的方案。

Abstract

细胞蛋白质组学的分析可以帮助阐明基于疾病的分子机制，这是由于技术的发展，允许大规模鉴定和定量复制生物系统中存在的蛋白质。从蛋白质组学方法获得的知识有可能导致更好地了解基础疾病的致病机制，允许鉴定新的诊断和预后疾病标志物，以及希望的治疗靶点。然而，心脏二尖瓣代表蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品，因为蛋白多糖和富含胶原蛋白的细胞外基质的细胞数量较少。这使得挑选提取蛋白质进行全球蛋白质组学分析。该工作描述了与随后的蛋白质分析相容的方案，如定量蛋白质组学和免疫印迹。这可以允许数据关联的相关性g蛋白表达与定量mRNA表达和非定量免疫组化分析数据。实际上，这些方法在一起执行时，可以更全面地了解基因疾病的基因分子机制，从mRNA到翻译后蛋白质的修饰。因此，这种方法可以与对心脏瓣膜病理学研究感兴趣的研究者有关。

Introduction

最近的证据改变了对mRNA合成后发生的许多调节机制的作用的理解。实际上，翻译，转录后和蛋白水解过程可以调节蛋白丰度和功能。假设转录本水平是蛋白质丰度的主要决定因素，mRNA的浓度代表相应蛋白质的代谢 - 已被部分修订。目前，转录本水平仅部分预测蛋白质丰度，这表明转录后事件发生调节细胞内的蛋白质^1,2 。

此外，蛋白质最终决定细胞的功能，因此决定其表型，其可以经受自分泌，旁分泌和内分泌因子的响应的动态变化;血液介体;温度;药物治疗和疾病发展换货。因此，以蛋白质水平为重点的表达分析有助于表征蛋白质组，并且揭示其作为疾病发病机理的一部分发生的关键变化³ 。

因此，尽管现有的技术挑战，蛋白质组学所提出的澄清健康和疾病状况的机会也是艰巨的。蛋白质组学可以贡献的特别有希望的研究领域包括:在任何水平（ 即全细胞或组织，亚细胞区室和生物液体）上鉴定改变的蛋白质表达;用于疾病诊断和预后的新型生物标志物的鉴定，验证和验证;并希望能够鉴定可用于治疗目的的新蛋白质靶标，以及药物功效和毒性的评估。

捕捉复杂性蛋白质组是技术挑战。目前的蛋白质组学工具提供了进行大规模，高通量分析来鉴定，定量和验证改变的蛋白质水平的机会。此外，引入分馏和富集技术，旨在避免由最丰富的蛋白质引起的干扰，还通过包括最少丰富的蛋白质来改善蛋白质鉴定。最后，蛋白质组学被补充了翻译后修饰的分析，其逐渐成为蛋白质功能的重要调节剂。

然而，分析中的生物标本中的样品制备和蛋白质回收仍然是蛋白质组学工作流程中的限制步骤，并增加可能陷阱的潜力⁵ 。事实上，在大多数必须优化的分子生物学技术中，第一步是组织匀浆离子和细胞裂解，特别是在不存在扩增方法的低丰度蛋白质的分析过程中。此外，蛋白质的化学性质可以影响其自身的恢复。例如，高疏水性蛋白质的分析是非常具有挑战性的，因为它们在等电聚焦过程中容易沉淀，而跨膜蛋白几乎不溶（参见参考文献5）。此外，组织组成变异性为开发通用提取方法创造了显着的障碍。最后，由于几乎所有临床标本的数量都是有限的，所以必须以最小的样品量使蛋白质制备具有最大的恢复和重现性。

这项工作描述了从正常人心脏二尖瓣进行蛋白质提取的优化方案，这代表了蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品。正常二尖瓣是一种lex结构位于左心房和心脏左心室之间（ 图1 ）。它在控制从心房到脑室的血液流量方面起着重要的作用，防止回流，并确保适当的氧气供应给全身，从而保持足够的心输出量。然而，它通常被认为是一种"无活性"组织，细胞率低，组成少，主要是细胞外基质。这是因为在正常情况下，驻留的瓣膜间质细胞（VIC）具有低蛋白质生物合成速率^7的静止表型。

然而，已经证明，在病理状态下，海绵体中的VIC的数量增加并且其蛋白质合成被激活，以及其他功能和表型变化⁸ 。因此，最少的数据可用并不奇怪文献集中于病理性二尖瓣^9,10的分析，其中活化的VIC的增加的数量可能解释相对较高数量的鉴定的蛋白质。

总之，本议定书可能通过研究二尖瓣蛋白组分来发展对负责二尖瓣疾病的致病机制的理解。事实上，更深入地了解潜在的病理过程可能有助于改善瓣膜疾病的临床管理，其目前的干预指标主要取决于血液动力学考虑因素。

Protocol

在该方案中，尽管正常的超声心动图参数，在多器官移植（冷缺血时间4-12小时，平均6±2小时）内，从器官移植排除器官移植的技术或功能原因收集人心脏。他们被送到米兰的心血管组织银行Monzino心脏中心（意大利米兰），为主动脉瓣和肺动脉瓣的银行服务。二尖瓣后叶不用于临床目的，因此在从供体亲属获得知情同意后，在主动脉瓣和肺动脉瓣隔离期间收集二尖瓣后叶。移植和研究的组织仅在家长同意后收集;在同意书上，只有在不适合人类临床使用（ 即微生物，功能和血清学问题）的情况下，他们授权（或不）使用心脏组织进行研究，遵循伦理委员会的指导方针蒙齐诺心脏中心。

二尖瓣制备

1. 器官移植后尽早收集人体二尖瓣（冷缺血时间4-12 h）。
2. 在洁净室内，从含有冷（4℃）溶液（ 即盐水溶液或平衡介质Eurocollins或威斯康星州）的运输袋中取出心脏。将其放入桶中并放置在生物安全柜（生物危害垂直空气流，A级，良好生产规范（GMP）分类）中，以进行阀门准备。
3. 将心脏放在柜内的无菌一次性悬垂物上。使用无菌的一次性手术刀，在距离顶点约4厘米处的左心室和右心室的水平上将心脏完全切开，与其主轴垂直。
4. 移动升主动脉和肺动脉显示左心房顶。
5. 用无菌高压灭菌镊子和捡拾，切割左耳廓上的左心房顶部，使二尖瓣可见，并允许确定大二尖瓣（前）和小二尖瓣（后）。
   注意:前外侧和后内侧合缝定义前叶和后区的边界。
6. 使用无菌高压灭菌剪刀和非创伤镊子，解剖左心房和围绕整个二尖瓣周围的心室壁厚度。
7. 确定主动脉瓣主动脉瓣连续性。
   注意:左心室包含整个二尖瓣和和弦。
8. 将二尖瓣二尖瓣分离自二尖瓣后叶小叶，沿着插入与心室切开后叶（连合）。
9. 在盐水溶液中洗后叶。将小叶切成小块（<1厘米² ），并单独包裹在铝箔上。用液氮快速冻结。
   注意:使用液氮时应遵循组织安全程序。
   1. 在程序结束时，用70％异丙醇溶液和6％过氧化氢溶液对柜子进行消毒。

蛋白质提取

1. 使用镊子拿起储存在液氮中的样品，并立即将其放在干冰上，同时仍然包裹在铝箔中。在转运期间不要让样品解冻。
2. 在研磨之前，将研磨机系统（ 例如， CryoGrinder）的瓷/锆砂浆和样品与样品一起放入含有液氮（〜500 mL）的杜瓦瓶中。
   注意:使用液氮时应遵循组织安全程序。
3. 将砂浆和杵放在含干冰的聚苯乙烯箱中。从铝箔上取出样品并放入砂浆中。
4. 研磨他用大杵取样15-15次，用螺丝刀旋转杵。在研磨过程中将样品与预先冷却的铲刀的尖端混合。
   1. 用小杵重复。
5. 将研磨的样品转移到先前称重的管（ 例如 15mL离心管）上，通过倒置管，将其放置在研钵上，并将它们反转到一起以将样品移动到管中。使用预冷的铲子从砂浆中回收所有材料。
   1. 将样品保持在干冰上，以避免样品在转移过程中解冻。
6. 计算样品的净重。
7. 在每个样品后清洁砂浆和杵，并通过高压灭菌或在200℃加热2小时对其进行去污。
8. 通过反转将粉末样品从离心管转移到均化器的玻璃管中。
9. 加入过滤的尿素缓冲液将r（8M尿素，2M硫脲，4％w / v CHAPS，20mM Tris和55mM二硫苏糖醇）加入到玻璃管中，每10mg粉状组织200μL尿素缓冲液。
   注意:离心管中残留的粉末样品可以使用部分计算的尿素缓冲液体积进行回收。
10. 使用装有硼硅酸盐玻璃研钵和聚四氟乙烯（PTFE）杵的搅拌器均匀化样品。用搓动（1500转/分钟）将杵慢慢按压到样品上10次。
11. 回收上清液并将其转移到干净的1.7 mL离心管中。再次用新鲜的尿素缓冲液提取剩余的样品，加入第一次提取过程中使用的体积的一半。
12. 重复步骤2.10。
13. 回收上清液并将其与步骤2.11的上清液组合。将合并的上清液放在管旋转器上30分钟。
14. 在13,000 xg和4℃下离心管30分钟。
15. 恢复上清液d根据制造商的说明书使用Bradford蛋白测定法测量蛋白质浓度。将样品储存在-80°C直到使用。

Results

蛋白质在尿素缓冲液中的提取和溶解与基于等电聚焦（二维电泳（2-DE） ¹¹和液相等电聚焦（IEF） ¹² ）的蛋白质组学方法直接相容，并且在Laemmli缓冲液^13中稀释后进行免疫印迹含有蛋白酶抑制剂混合物¹⁴ 。

对于基于无凝胶质谱法（ 即与数据无关质谱分析（LC / MS ^E ）和二维LC / MS ^E （2D-LC / MS ^E ））相结合的液相色谱法¹⁵ ，样品提取在所述的尿素缓冲液中需要进一步处理以除去尿素和硫脲，这可能干扰随后的蛋白质消化和液相色谱分离。氏可以使用商业蛋白质沉淀试剂盒，按照制造商的说明来沉淀蛋白质来完成脱盐...

Discussion

该方案的一个关键步骤是使用液氮冷冻样品并冷却研磨机系统。液氮的使用可防止生物降解并有效地进行粉末化，但需要对培训进行安全处理。

在该协议中，具有用于样品研磨的研磨机系统，因为小样品难以从标准的砂浆和杵中回收。在这种情况下，小样品作为细粉扩散到砂浆表面，使收集困难。另一个优点是研磨机是电动的，这允许以可再现的方式处理更多数量的样品并且没有增加的疲劳。对研磨机的使用的一个限制是，必须将杵的力量小（100mg或更少）的样品的尺寸有效地压在砂浆上。此外，研磨机组件必须在清洁用途之间加热至室温 G。因此，该过程是耗时的，并且如果每天处理许多样品，则需要许多组。

另外的关键步骤是提取缓冲液的制备。盐浓度，特别是尿素（8M）和硫脲（2M）的浓度相当高;因此，盐的体积几乎是溶液总体积的一半。此外，考虑到必须避免热量，溶解是不容易的，因为在大于37℃时，尿素可导致蛋白质/肽的N末端和赖氨酸和精氨酸残基¹⁷的侧链氨基处的蛋白质氨基甲酰化。一旦溶解，尿素缓冲液必须用0.22μm过滤器过滤，...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
盐水溶液			0.9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	平衡器官的运输介质。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，以获得平衡培养基 Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	平衡器官的运输培养基。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，获得平衡培养基 Eurocollins
威斯康星	桥寿命	RM/N 4081	平衡器官运输培养基
生物危害 垂直流空气	Burdinola		A 级 GMP 分类
杜瓦瓶	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
低温研磨机系统	OPS 诊断	CG 08-01	研磨系统，包含研钵、研杵和螺丝刀
不锈钢镊子
不锈钢刮刀
一次性无菌手术刀	Medisafe	MS-10
不锈钢剪刀			可高压灭菌
镐			高压灭菌
一次性无菌窗帘	Mon&Tex	3.307.08
70% 异丙醇			灭菌液
6% 过氧化氢			灭菌
液 微量移液器，1 mL，带吸头
15 mL 离心管	VWR international	9278
1.7 mL 离心管	VWR国际	PIER90410
尿素缓冲液			8 M 尿素、2 M 硫脲、4 % w/v CHAPS、20 mM Trizma、55 mM 二硫代曲醇
素	Sigma aldrich	U6504-1KG	用于尿素缓冲液
硫脲	Sigma aldrich	T8656	用于尿素缓冲液
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	用于尿素缓冲液
二硫代曲醇	Sigma aldrich	D0632-5G	用于尿素缓冲液
注射器 50 mL	PIC		用于过滤尿素缓冲液
0.22 &微量;m 过滤器	Millipore	SLGP033RB	用于过滤尿素缓冲液
PFTE 杵，2 mL	Kartell	6302	Potter-Elvehjem 均质器的一部分
硼硅酸盐玻璃砂浆	Kartell	6102	Potter-Elvehjem 均质器的一部分
搅拌器	VELP scientifica	搅拌器 DLH	用于 Potter-Elvehjem
Bradford 蛋白质测定的均质化	Bio-Rad 实验室	5000006
管旋转器	Pbi International	F205
液氮
铝箔
冰
聚苯乙烯盒
干冰
离心机			用于在 13,000 x g 下离心 1.7 mL 离心管
-80°C 冰箱C
精密天平
高压灭菌器			用于灭菌
氮
手套
专业强制通风和自然空气对流烘箱			用于灭菌
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X 溶液
ProteoExtract 蛋白质沉淀试剂盒	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
CytoScape	www.cytoscape.org	2.7 版	本体分析软件平台
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	3.0.3 版	插件用于基因本体分析
AlphaB 晶状体蛋白/CRYAB 抗体	Novus Biologicals	NBP1-97494	小鼠抗 CryAB 单克隆抗体
Septin-11 抗体	Novus Biologicals	NBP1-83824	兔抗 septin-11 多克隆抗体
FHL1 抗体	Novus Biologicals	NBP-188745	兔抗 FHL-1
皮细胞抗体	Novus Biologicals	NB110-68135	兔多克隆抗体
山羊抗皮细胞 抗小鼠 IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	免疫印迹二抗
山羊抗兔 IgG HRP	Bio-Rad 实验室	170-5046	免疫印迹二抗