小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术(即外源基因的随机整合)以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展,特别强调质量控制和基因分型策略。
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小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术(即外源基因的随机整合)以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展,特别强调质量控制和基因分型策略。
转基因小鼠的使用已显著推动了生理学与病理学研究 体内 过程。将DNA表达载体注射到受精卵原核中,仍是制备用于过表达的转基因小鼠最常用的技术。随着CRISPR技术在基因靶向中的应用,原核注射技术已扩展至基因敲除和基因敲入小鼠的制备。本文详细描述了注射用DNA的制备以及用于基因靶向的CRISPR引导RNA的构建,特别强调质量控制环节。鉴定潜在 founder 小鼠所需的基因分型步骤至关重要。本文还介绍了利用CRISPR“多重检测”能力的创新性基因分型策略。同时概述了相关手术操作。本实验方案的各个步骤共同实现了基因修饰小鼠的制备,并为进一步建立适用于多种研究领域的鼠群提供了支持,这些领域包括免疫学、神经科学、癌症、生理学、发育生物学等。
动物模型,包括脊椎动物和无脊椎动物,在研究阿尔茨海默病等人类疾病的病理生理机制方面发挥了重要作用1,2。它们也是寻找疾病修饰因子并最终开发新型治疗策略以实现治愈的宝贵工具。尽管每种模型都有其内在局限性,但将动物作为完整的系统性模型对生物医学研究至关重要,因为组织培养无法完全模拟机体的代谢和复杂的生理环境。
迄今为止,小鼠仍然是用于基因操作最常见的哺乳动物物种,因其具备多项优势。小鼠与人类在疾病相关的生理过程和基因方面具有高度保守性。小鼠是首个完成全基因组测序的哺乳动物(2002年),比人类基因组测序完成早一年(2003年)。除丰富的遗传信息外,小鼠还具有良好的繁殖能力、快速的发育周期(从受精到断奶仅需6周)以及适中的体型。这些优势,加上毛色等明显的生理指标(对杂交策略至关重要),使小鼠成为基因操作的理想模型。值得注意的是,在现代遗传学发展的早期,格雷戈尔·孟德尔(Gregor Mendel)在转向植物研究之前,最初的研究对象就是小鼠3。
基因转移技术在三十多年前首次成功制备出转基因小鼠4,最初采用的是病毒递送方法。然而,研究人员很快意识到,小鼠转基因技术面临的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。由于通过病毒将转基因递送至小鼠卵母细胞会导致多个拷贝随机整合到基因组中,因此后续建立稳定转基因品系的可能性受到限制。
当戈登 等 通过显微注射技术建立了首株转基因小鼠品系5,6这标志着重组DNA技术时代的开始,影响显微注射实验结果的参数已得到广泛研究。7尽管显微注射无法控制外源基因在基因组中的整合位点(最终导致每只 founder 小鼠的特异性表达水平不同),但原核显微注射的主要优势仍在于能够形成串联重复整合的多拷贝片段(concatemers)即, 串联排列的多个转基因拷贝阵列,在基因组整合之前5这一特性多年来被用于建立数千个过表达目的基因的转基因小鼠品系。此后,转基因技术(即对生物体基因组的人工改造)被广泛应用于鉴定单个基因在疾病发生中的作用。
在小鼠基因组操作领域,另一项重要成就是 Mario Capecchi 成功实现了小鼠单个基因的失活,由此开启了基因靶向时代8然而,基于ES细胞的基因靶向技术很快显现出主要缺点,包括ES细胞培养的困难、嵌合程度的不稳定性以及实验周期较长等问题即, 获得小鼠所需的最短时间,最少12-18个月。
近年来,新技术的进步,例如工程化核酸内切酶(例如, 锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以及成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)已成为加速小鼠基因靶向过程的替代方法9,10这些内切核酸酶可通过显微注射直接注入小鼠卵母细胞,从而在短短6周内即可获得基因靶向小鼠。
自从首次报道利用CRISPR进行基因组编辑以来11,这种细菌的适应性免疫系统因其诸多优势已取代了ZFN和TALEN,这些优势包括易于合成以及能够同时靶向多个位点(称为"multiplexing")。CRISPR首次被用于小鼠的基因靶向12,此后已广泛应用于从植物到人类的无数物种13,14。迄今为止,尚无任何物种对CRISPR基因组编辑具有抗性的报道。
转基因小鼠制备过程中的两个主要限制性步骤是卵母细胞的注射以及将这些卵母细胞重新植入假孕雌鼠体内。尽管该技术已被我们15及其他研究者16所描述,但近年来小鼠胚胎学和基因转移技术方面的最新进展已彻底革新了遗传修饰小鼠的制备流程。本文将介绍这些技术改进。
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所有实验程序均已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准。
1. 转基因的制备(随机整合)
2. CRISPR 组分的合成(基因靶向)
3. 供体模板
4. 注射混合液
5. 阴囊输精管结扎术
注意:小鼠常用的输精管结扎术有两种类型:腹腔式和阴囊式。后者侵入性较小,此前已有描述15。
6. 超数排卵(卵母细胞供体)与定时交配(假孕雌性)
注意:产生适量受精卵以及用于重新移植的插栓型代孕雌性动物的技术已在其他文献中描述15。
7. 原核(随机整合)和细胞质(基因靶向)注射
8. 再植入
9. 基因分型策略/测序
注意:按照相关动物伦理法规,从2毫米的尾部或耳部活检组织中分离基因组DNA。
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以下描述了随机整合和CRISPR介导的基因靶向两种情况下的显微注射工作流程(图1)。

图1:基因修饰小鼠制备的典型工作流程。 对于随机整合,将纯化的转基因片段注射到受精卵的原核中,随后将胚胎移植至交配后发现阴栓的假孕雌鼠的输卵管内。子代的分析通过快速提取基因组DNA后进行PCR检测完成。对于CRISPR基因靶向,采用本文所述的免克隆方法合成sgRNA,并将两个向导RNA(sgRNA)与Cas9 mRNA共同注射到受精卵的细胞质中。...
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方案中的关键步骤
制备基因修饰小鼠通常被认为在技术上具有挑战性。然而,本文介绍的方案是一种经过优化和简化的实验方法,可帮助研究者在最短时间内掌握并解决该技术中的问题。成功完成该技术需要两个关键步骤。首先,在合成线性DNA模板(用于合成sgRNA)时,可以不使用氯化镁(MgCl2)。但强烈建议在总反应体系中系统性地添加MgCl2,因为在缺乏MgCl2的情况下,正向引物常常无法实现部分杂交。此外,在靶向整合的情况下,必须确保供体模板的任何区域都不包含目标基因组序列,否则Cas9核酸酶将切割该模板,从而阻止同源定向修复(HDR)的发生。
修改与故障排除
尽管这种用于制备基因修饰小鼠的方案经过多年优化和简化,但在显微注射用高质量卵母细胞的产量以及假孕雌鼠的交配栓查率方面仍有一些注意事项。背景品系的选择对于一次显微注射实验所能获得的活产仔鼠数量至关重要。C57BL/6 是疾病小鼠模型中最常用的背景品系。然而,就对显微注射的耐受性...
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作者通过新南威尔士大学马克·温赖特分析中心提供小鼠的学术转基因服务。
作者感谢动物实验中心(BRC)工作人员的持续支持。本工作由国家卫生与医学研究理事会和澳大利亚研究理事会资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微量移液器 0.1-2.5 μL | Eppendorf | 4920000016 | |
| 微量移液器 2 - 20 μL | Eppendorf | 4920000040 | |
| 微量移液器 20 - 200 μL | Eppendorf | 4920000067 | |
| 微量移液器 100 - 1,000 μL | Eppendorf | 4920000083 | |
| 分子量标记物 | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| 分子量标记物 | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| 琼脂糖 | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA 缓冲液 | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - 稀释至 1x |
| 溴化乙锭 | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe 凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| PCR 纯化试剂盒 (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| 真空系统(多孔板) | Promega | A7231 | |
| 无核酸酶显微注射缓冲液 | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC 微型离心过滤器 | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| 表达 CRISPR 的质粒 (px330) | Addgene | 42230 | |
| 无核酸酶水 | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion 聚合酶 | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 快速高效 RNA 试剂盒 | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA 纯化离心柱 (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| 单链寡核苷酸 (ssOligos) | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| 供体质粒 | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa 胚胎培养基 | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| 矿物油 | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| 细胞松弛素 B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| 吹吸管口 | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| 玻璃毛细移液管 | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| 蛋白酶 K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 虹膜剪刀 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 血管夹 | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| 伤口夹 | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| 夹子施加器 | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 电凝器 | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| 不可吸收外科缝线 (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 培养箱 | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| PCR 仪 | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| 电泳装置 | BioRad | 1640300 | |
| 紫外透射仪 | BioRad | 1708110EDU | |
| PCR 仪 | Eppendorf | 6334000069 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX7 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 双通道显微操作仪 | Eppendorf | 5188000.012 | |
| 卵母细胞操作仪 | Eppendorf | 5176000.025 | |
| 显微注射仪 (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| 小鼠 C57BL/6J 品系 | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
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