通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠

Summary

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典转基因（ 即转基因的随机整合）和CRISPR介导的基因靶向。该协议审查显微注射的最新发展，特别强调质量控制和基因分型策略。

Abstract

使用转基因小鼠对生理和病理体内过程的研究有显着的贡献。将DNA表达构建体的原核注射到受精卵中仍然是产生用于过表达的转基因小鼠的最常用技术。随着用于基因靶向的CRISPR技术的引入，原核注入受精卵母细胞已经扩展到敲除和敲入小鼠的产生。这项工作描述了用于注射的DNA的制备和用于基因靶向的CRISPR指南的产生，特别强调质量控制。识别潜在创始人所需的基因分型程序至关重要。本文介绍了利用CRISPR"复用"能力的创新型基因分型策略。还概述了外科手术。一起，协议的步骤将允许生成gen以及随后建立的大量研究领域的小鼠集落，包括免疫学，神经科学，癌症，生理学，发育等。

Introduction

在脊椎动物和无脊椎动物中的动物模型已经有助于检查人类病情如阿尔茨海默病^1,2的病理生理学。他们也是寻找疾病修饰剂的最宝贵的工具，并最终开发出新的治疗策略，希望得到治愈。虽然每个模型都有固有的局限性，但是使用动物作为整个系统模型对于生物医学研究至关重要。这是因为组织培养不能完全模拟代谢和复杂的生理环境。

迄今为止，鼠标仍然是用于遗传操作的最常见的哺乳动物物种，因为它具有几个优点。与疾病相关的生理过程和基因在小鼠和人之间是高度保守的。小鼠是第一个拥有全基因组测序的哺乳动物（2002年），人类基因组前一年我（2003）。除了丰富的遗传信息，小鼠具有良好的育种能力，快速的开发周期（从受精到断奶6周）和合理的大小。所有这些优点，加上生理指标，如独特的外套颜色（交叉策略所需），使得鼠标成为遗传操作的有吸引力的模型。值得注意的是，在现代遗传学的很早的时代，格雷戈尔·门德尔（Gregor Mendel）开始对老鼠进行植物移植³ 。

基因转移技术导致在三十年前第一代转基因小鼠的产生⁴ ，最初使用病毒递送。然而，研究人员很快意识到，小鼠转基因的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。因为转基因向小鼠卵母细胞的病毒递送导致随机地整合到基因组中的多个拷贝，这是可能的建立后续转基因株系的限制。

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Protocol

所有程序已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准。

1.准备转基因（随机整合）

1. 分析琼脂糖凝胶电泳。
   1. 根据制造商的建议，使用合适的酶（1小时孵育）或快速消化酶（15至30分钟孵育）在热循环仪中消化质粒以切割转基因（参见图2A及其图例）。
   2. 加入1％三醋酸乙二胺四乙酸（EDTA）（TEA）琼脂糖凝胶，用0.5-1.0μg/ mL溴化乙锭（EtBr）染色。
      注意:使用EtBr时要小心;它是一种有效的诱变剂。请使用适当的个人防护装备（参见材料安全数据表）。
   3. 加载1 kb分子量标记。
   4. 加载线性化片段（ 即转基因和骨架）。
   5. 在100V下运行电泳45分钟。
   6. 可视化紫外线（UV）透射仪上的凝胶，以检查消化是否完整并确认转基因的正确大小（ 即 7,338 bp; 见图2A ）。
2. 制备琼脂糖凝胶电泳。
   1. 注射1％TAE琼脂糖凝胶，用低毒凝胶染色剂染色。加载不含分子量标记物的8等份（每个1μg）线性化转基因，并在100V下运行45分钟。使用手术刀切除对应于线性化转基因的所有8个....

Results

下面描述了在随机整合和CRISPR介导的基因靶向的情况下显微注射的工作流程（ 图1 ）。

图1:产生转基因小鼠的典型工作流程。对于随机整合，将纯化的转基因注射入受精卵母细胞的原核，然后输卵管转移到插入的寄养雌性中。在快速的基因组DNA提取后，通过PCR进行后代的分析。对于CRISPR基因靶向，使用本文所述的非克隆方法合成sgRNA，并将两个指南与受精卵母细胞共同注射（与Cas9 mRNA一起）。该策略用于后续的基于PCR的分析，后者需要高度纯化的g核糖体DNA。

Discussion

协议中的关键步骤

已知基因修饰的小鼠的产生在技术上是具有挑战性的。然而，这里提出的协议是一种优化和简化的方法，可以在记录时间内掌握和排除故障。成功完成技术需要两个步骤。首先，不用氯化镁（MgCl ₂ ）可以实现线性DNA模板的合成（用于合成sgRNA）。然而，强烈建议系统地将MgCl ₂加入到主混合物中，因为在没有MgCl ₂的情况下经常防止正向引物的部分杂交。此外，靶基因组序列不存在于供体模板的任何部分（在靶向整合的情况下）至关重要，否则Cas9核酸酶将切割它，从而防止HDR的发生。

修改和故障排除

尽管多年来这种用于产生转基因小鼠的方案已被优化和精简，但是对于用于显微注射的优质卵母细胞的产量和育成雌性的插入率有一些考虑。背景应变的选择对于由显微注射会话产生的活的幼仔的数量至关重要。 C57BL / 6是小鼠模型疾病最常用的背景。然而，它也是抵抗显微注射²⁰的效率较低的背景.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
微量移液器 0.1-2.5 &μ;L	Eppendorf	4920000016
微量移液器 2 - 20 μL	Eppendorf	4920000040
微量移液器 20 - 200 μL	Eppendorf	4920000067
微量移液器 100 - 1,000 μL	Eppendorf	4920000083
分子量标准仪	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
分子量标准仪	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
琼脂糖	Bioline	BIO-41025
EDTA 缓冲液	Sigma-Aldrich	93296	10x - 稀释至 1x
溴化乙锭	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe 凝胶染色	Invitrogen	S33102
凝胶提取试剂盒	Qiagen	28706
PCR 纯化试剂盒 （Qiaquick）	Qiagen	28106
真空系统（歧管）	Promega	A7231
无核酸酶显微注射缓冲液	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC 微量离心机过滤器	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR 表达质粒 （px330）	Addgene	42230
无核酸酶水	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion 聚合酶	New England Biolabs	M0530L
T7 快速高产量 RNA 试剂盒	New England Biolabs	E2050S
RNA 纯化离心柱 （NucAway）	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
供体质粒	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa 胚胎培养基	Zenith Biotech	ZEKS-100
矿物油	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2培养基	Sigma-Aldrich	M7167
松弛素B	Sigma-Aldrich	C6762
吹嘴	Sigma-Aldrich	A5177
玻璃微毛细管	特仪器	BF100-78-10
K	应用A3830.0100
Dumont#5镊子	精细科学工具	91150-20
鸢尾剪刀	精细科学工具	91460-11
容器夹	Fine Science Tools	18374-43
绕线夹	精细科学工具	12040-01
夹子应用器	精细科学工具	12018-12
微型剪刀	精细科学工具	15000-03
烧灼机	精密科学工具	18000-00
不可吸收手术缝合线 （Ethilon 3-0）	Ethicon	1691H
5% CO2 培养箱	Scientific	Galaxy 14S
分光光度计	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
热循环仪	Eppendorf	6321 000.515
电泳设置	BioRad	1640300
紫外透射仪	BioRad	1708110EDU
热循环仪	Eppendorf	6334000069
立体显微镜	奥林巴斯	SZX7
倒置显微镜	奥林巴斯	IX71
2x 显微作器	Eppendorf	5188000.012
卵母细胞作器	Eppendorf	5176000.025
显微注射仪 （Femtojet）	Eppendorf	5247000.013
小鼠 C57BL/6J 菌株	澳大利亚生物资源	C57BL/6JAusb