小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
转基因小鼠的使用已显著推动了生理学与病理学研究 体内 过程。将DNA表达载体注射到受精卵原核中，仍是制备用于过表达的转基因小鼠最常用的技术。随着CRISPR技术在基因靶向中的应用，原核注射技术已扩展至基因敲除和基因敲入小鼠的制备。本文详细描述了注射用DNA的制备以及用于基因靶向的CRISPR引导RNA的构建，特别强调质量控制环节。鉴定潜在 founder 小鼠所需的基因分型步骤至关重要。本文还介绍了利用CRISPR“多重检测”能力的创新性基因分型策略。同时概述了相关手术操作。本实验方案的各个步骤共同实现了基因修饰小鼠的制备，并为进一步建立适用于多种研究领域的鼠群提供了支持，这些领域包括免疫学、神经科学、癌症、生理学、发育生物学等。
引言
动物模型，包括脊椎动物和无脊椎动物，在研究阿尔茨海默病等人类疾病的病理生理机制方面发挥了重要作用1,2。它们也是寻找疾病修饰因子并最终开发新型治疗策略以实现治愈的宝贵工具。尽管每种模型都有其内在局限性，但将动物作为完整的系统性模型对生物医学研究至关重要，因为组织培养无法完全模拟机体的代谢和复杂的生理环境。
迄今为止，小鼠仍然是用于基因操作最常见的哺乳动物物种，因其具备多项优势。小鼠与人类在疾病相关的生理过程和基因方面具有高度保守性。小鼠是首个完成全基因组测序的哺乳动物（2002年），比人类基因组测序完成早一年（2003年）。除丰富的遗传信息外，小鼠还具有良好的繁殖能力、快速的发育周期（从受精到断奶仅需6周）以及适中的体型。这些优势，加上毛色等明显的生理指标（对杂交策略至关重要），使小鼠成为基因操作的理想模型。值得注意的是，在现代遗传学发展的早期，格雷戈尔·孟德尔（Gregor Mendel）在转向植物研究之前，最初的研究对象就是小鼠3。
基因转移技术在三十多年前首次成功制备出转基因小鼠4，最初采用的是病毒递送方法。然而，研究人员很快意识到，小鼠转基因技术面临的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。由于通过病毒....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验程序均已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准。
1. 转基因的制备（随机整合）
- 分析性琼脂糖凝胶电泳
- 使用适当的限制性内切酶（孵育1小时）或快速消化酶（孵育15至30分钟），在PCR仪中按照制造商推荐条件对质粒进行消化，以切除目的转基因片段（参见 图2A 及其图注）。
- 制备含0.5–1.0 µg/mL溴化乙锭（EtBr）的1%三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（TEA）琼脂糖凝胶。
注意：使用溴化乙锭（EtBr）时需谨慎，其为强效诱变剂。请使用适当的个人防护装备（参见材料安全数据表）。 - 加载1 kb分子量标记物。
- 加载线性化片段（即， 转基因和载体骨架
- 以100 V电压电泳运行45分钟。
- 在紫外（UV）透射仪上观察凝胶，以确认消化是否完全，并验证转基因片段的大小是否正确即， 7,338 bp；参见 图 2A).
- 制备型琼脂糖凝胶电泳
- 制备一块含低毒性凝胶染料的1% TAE琼脂糖凝胶。加入8份线性化....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
以下描述了随机整合和CRISPR介导的基因靶向两种情况下的显微注射工作流程（图1）。
图1：基因修饰小鼠制备的典型工作流程。 对于随机整合，将纯化的转基因片段注射到受精卵的原核中，随后将胚胎移植至交配后发现阴栓的假孕雌鼠的输卵管内。子代的分析通过快速提取基因组DNA后进行PCR检测完成。对于CRISPR基因靶向，采用本文所述的免克隆方法合成sgRNA，并将两个向导RNA（sgRNA）与Cas9 mRNA共同注射到受精卵的细胞质中。.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
方案中的关键步骤
制备基因修饰小鼠通常被认为在技术上具有挑战性。然而，本文介绍的方案是一种经过优化和简化的实验方法，可帮助研究者在最短时间内掌握并解决该技术中的问题。成功完成该技术需要两个关键步骤。首先，在合成线性DNA模板（用于合成sgRNA）时，可以不使用氯化镁（MgCl2）。但强烈建议在总反应体系中系统性地添加MgCl2，因为在缺乏MgCl2的情况下，正向引物常常无法实现部分杂交。此外，在靶向整合的情况下，必须确保供体模板的任何区域都不包含目标基因组序列，否则Cas9核酸酶将切割该模板，从而阻止同源定向修复（HDR）的发生。
修改与故障排除
尽管这种用于制备基因修饰小鼠的方案经过多年优化和简化，但在显微注射用高质量卵母细胞的产量以及假孕雌鼠的交配栓查率方面仍有一些注意事项。背景品系的选择对于一次显微注射实验所能获得的活产仔鼠数量至关重要。C57BL/6 是疾病小鼠模型中最常用的背景品系。然而，就对显微注射的耐受性.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者通过新南威尔士大学马克·温赖特分析中心提供小鼠的学术转基因服务。
致谢
作者感谢动物实验中心（BRC）工作人员的持续支持。本工作由国家卫生与医学研究理事会和澳大利亚研究理事会资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微量移液器 0.1-2.5 μL | Eppendorf | 4920000016 | |
| 微量移液器 2 - 20 μL | Eppendorf | 4920000040 | |
| 微量移液器 20 - 200 μL | Eppendorf | 4920000067 | |
| 微量移液器 100 - 1,000 μL | Eppendorf | 4920000083 | |
| 分子量标记物 | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| 分子量标记物 | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| 琼脂糖 | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA 缓冲液 | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - 稀释至 1x |
| 溴化乙锭 | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe 凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| PCR 纯化试剂盒 (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| 真空系统（多孔板） | Promega | A7231 | |
| 无核酸酶显微注射缓冲液 | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC 微型离心过滤器 | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| 表达 CRISPR 的质粒 (px330) | Addgene | 42230 | |
| 无核酸酶水 | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion 聚合酶 | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 快速高效 RNA 试剂盒 | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA 纯化离心柱 (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| 单链寡核苷酸 (ssOligos) | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| 供体质粒 | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa 胚胎培养基 | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| 矿物油 | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| 细胞松弛素 B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| 吹吸管口 | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| 玻璃毛细移液管 | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| 蛋白酶 K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 虹膜剪刀 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 血管夹 | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| 伤口夹 | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| 夹子施加器 | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 电凝器 | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| 不可吸收外科缝线 (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 培养箱 | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| PCR 仪 | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| 电泳装置 | BioRad | 1640300 | |
| 紫外透射仪 | BioRad | 1708110EDU | |
| PCR 仪 | Eppendorf | 6334000069 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX7 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 双通道显微操作仪 | Eppendorf | 5188000.012 | |
| 卵母细胞操作仪 | Eppendorf | 5176000.025 | |
| 显微注射仪 (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| 小鼠 C57BL/6J 品系 | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
参考文献
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
