蛋白质 - 蛋白质相互作用的分析和鼠乳腺中间隙，紧密和粘附连接部位之间的共定位

Summary

细胞间连接是乳腺阶段特异性功能和发育的必需条件。该手稿提供了一个详细的方法，用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）和使用鼠乳腺的共定位。这些技术允许调查不同发育阶段的细胞间连接之间的物理联系的动力学。

Abstract

细胞间的相互作用在保持组织完整性和乳腺不同隔室之间的屏障方面发挥关键作用。这些相互作用由在相邻细胞之间形成核酸的连接蛋白提供。功能蛋白质错位和与其结合配偶体的物理缔合减少可导致功能丧失，从而导致器官功能障碍。因此，在正常和疾病相关组织中鉴定蛋白质定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）对于找到导致疾病发展或发育状态改变的新证据和机制是至关重要的。该手稿提供了两步法评估鼠乳腺中的PPI。在方案1中，描述了使用针对感兴趣的蛋白质产生的抗体，随后用荧光染料标记的二抗进行共免疫荧光（co-IF）的方法。虽然共同所有为了证明蛋白质的接近程度，它确实有可能研究其物理相互作用。因此，在协议第2节中提供了共免疫沉淀（co-IP）的详细方案。该方法用于确定蛋白质之间的物理相互作用，而不确认这些相互作用是直接还是间接的。在过去几年中，共同中心和共同IP技术已经证明，细胞间连接的某些组成部分共同定位并相互作用，从而在乳腺发育过程中产生不同阶段依赖的连接性核酸。

Introduction

乳腺生长发育主要发生于出生后。这种器官在整个哺乳动物的生殖生活中不断地改造自己¹ 。成年乳腺上皮由腔内上皮细胞的内层和由基底膜²包围的主要由肌上皮细胞组成的基底细胞外层组成。为了对乳腺结构和发育的良好综述，读者可以参考Sternlicht ¹ 。通过间隙（GJ），紧密（TJ）和粘附（AJ）结的细胞 - 细胞相互作用对于腺体1,3,4,5,6的正常发育和功能是必需的。这些小鼠乳腺结节的主要成分是Cx26，Cx30，Cx32和Cx43（GJ）;紧密连接-1，-3，-4和-7和ZO-1（TJ）;和E-钙粘蛋白，P-钙粘蛋白和β-连环蛋白（AJ） ^7,8 。这些不同连接蛋白的表达水平在乳腺发育过程中以阶段依赖的方式变化，这表明差异细胞 - 细胞相互作用的要求⁹ 。 GJ，TJ和AJ在结构和功能上相互连接并将其他结构或调节蛋白连接到相邻细胞的相邻位点，从而产生连接性连接¹⁰ 。连接关系的组成可以影响与下面的细胞骨架的桥接，以及连接通透性和稳定性，因此可以影响腺体8,9,10,11的功能。细胞间连接的组成部分存在于连接核酸中，或者彼此相互作用最近使用共免疫荧光（co-IF）和共免疫沉淀（co-IP） ⁹分析了乳腺发育的不同发育阶段。虽然其他技术允许评估蛋白质之间的功能关联，但这些方法在本手稿中没有提出。

由于蛋白质仅仅单独起作用，研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI），如信号转导和生物化学级联，对许多研究人员来说是必不可少的，可以提供关于蛋白质功能的重要信息。 Co-IF和微观分析有助于评估一些共享相同亚细胞空间的蛋白质。然而，目标的数量受到必须在不同动物中提高的抗体以及通过使用配备有不同波长激光器的共聚焦显微镜和用于复用的光谱检测器的抗体的限制。 Co-IP确认或揭示高亲和力的物理相互作用een两个或更多的蛋白质位于蛋白质复合物内。尽管开发了诸如荧光共振能量转移（FRET） ¹²和邻近连接测定（PLA） ^{13等新技术} ，其可以同时检测蛋白质的定位和相互作用，但共有IP仍然是一种适当和可负担的技术来研究内源蛋白。

本手册中描述的逐步方法将有助于蛋白质定位和PPI的研究，并指出在研究乳腺中的内源PPI时应避免的缺陷。该方法从对每种技术所需组织的不同保存程序的介绍开始。第1部分介绍了如何在三个步骤中研究蛋白质共定位:i）乳腺切片，ii）使用co-IF技术对不同蛋白质的双重或三重标记，以及iii）成像蛋白质定位。第2部分显示如何沉淀内源性蛋白质并以三个步骤鉴定其相互作用的蛋白质:i）裂解物制备，ii）间接蛋白质免疫沉淀，以及iii）通过SDS-PAGE和Western印迹结合配偶体鉴定。该方案的每一步都针对啮齿动物乳腺组织进行了优化，并产生了高质量，特异性和可重复的结果。该方案也可用作其他组织或细胞系中PPI研究的起点。

Protocol

本研究中使用的所有动物方案均由大学动物护理委员会（INRS-Institut Armand-Frappier，Laval，Canada）批准。

识别蛋白质共定位

1. 从组织到显微镜片
   注意:组织和部分应在干冰上处理。
   1. 从动物上清除乳腺（有关此程序的完整描述，请参阅Plante 等人 ）。
   2. 将切除的组织嵌入冷冻/安装介质中的干冰上。添加足够的培养基覆盖腺体。当培养基固化时，将组织转移到-80℃的冷冻箱中供以后使用⁹ 。
   3. 使用设置在-35°C的冷冻切片机，将组织切成7-10μm厚的切片并将其放置在显微镜载玻片上。
      注意:尽可能在每张幻灯片上放置两个部分;左侧部分将被用作特异性对照以验证抗体的特异性和组织的自发荧光，而右侧将用抗体标记。
   4. 将部分保持在-80°C以备后用。
2. Co-IF染色
   1. 从冷冻箱中取出适当的微观载玻片，并在室温（RT）下将其浸入4％甲醛中15分钟立即固定切片。
   2. 然后在室温下将载玻片浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。将幻灯片放在PBS中，直到进入下一步。
   3. 使用市售的疏水屏障或防水实验笔（参见"材料表" ）圈住滑块的每个部分。小心不要接触组织。立即向组织中加入一滴PBS，并将载玻片置于潮湿的组织学室中，以进行剩余的操作。
      注意:组织切片必须保持保湿。替代请使用带盖的盒子，并将湿纸巾放在底部。
   4. 使用100-200μL3％牛血清白蛋白（BSA）-Tris缓冲盐水（TBS）-0.1％聚山梨醇酯20（参见材料表 ）将每个组织切片封闭 30分钟。当样品阻塞时，通过在TBS-0.1％聚山梨醇酯20中稀释抗体来制备一抗和二次抗体溶液。
      注意:抗体所需的浓度由制造商提供;参见材料表和图1和图2 ，以及Dianati 等人 ⁹ 。尽管在使用大多数荧光团缀合的抗体时不需要在黑暗中工作，但避免将抗体溶液或染色的组织暴露于强烈的明亮的光线下。
   5. 通过抽吸去除封闭溶液，并在室温下将100-200μL稀释的一抗孵育切片60分钟。 Alternatively，在4℃下与第一抗体孵育过夜。
   6. 通过抽吸去除一级抗体溶液，并用250-500μLTBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤切片5分钟。通过抽吸去除洗涤液，重复洗涤两次。
   7. 通过抽吸去除洗涤溶液，并在室温下用100-200μL适当的荧光团缀合的二抗孵育切片60分钟。
   8. 通过抽吸去除第二抗体溶液，并用250-500μLTBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤切片5分钟。取出洗液并重复两次。
   9. 重复步骤2.5-2.8，使用适当的初级和次级抗体组合，用于感兴趣的后续蛋白质。
   10. 通过抽吸去除洗涤溶液并通过将部分与100-200μL的1mg / mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在TBS-0.1％聚山梨醇酯20中孵育5分钟进行核染色，并进行细胞核染色RT。
   11. 通过抽吸去除DAPI溶液，并使用水溶性，非荧光的安装介质（参见材料表 ）和盖玻片安装载玻片。一次进行一张幻灯片。
       注意:孵育核染色超过5分钟不会改变染色强度。或者，移除所有载玻片上的DAPI溶液，并在安装载玻片的同时孵育PBS中的组织。
   12. 将幻灯片平放在4°C冰箱中至少8小时。继续进行荧光显微镜成像（参见图1和图2 ）。
3. 显微成像
   1. 使用配备有在其特定波长处激发荧光团所需的各种激光器的共聚焦显微镜来观察荧光团缀合的二次抗体。
      注意:为了能够可视化管道和肺泡，建议使用数值孔径为0.95的40X物镜。例如e的具体设置如图1所示 。
   2. 通过在当时扫描一幅波长的图像来单独验证每种蛋白质的定位。
      注意:在这个阶段，重要的是严格分析连接蛋白的定位。为了能够形成连接核酸，这些蛋白质必须位于质膜上。
   3. 通过合并在不同波长的激光扫描的图像来确定蛋白质的共定位。
      注意:蛋白质共定位可以通过在相同位置发射两个或更多个荧光团而产生的颜色变化来显现，并且可以使用适当的软件测量（ 图1和2 ;也参见参考文献9）。

2.学习PPI

注意:腹部乳腺应用于研究PPI，因为胸腺与胸部紧密相关肌肉。消毒乳腺（有关此程序的完整说明，请参阅Plante 等人 ） ¹⁴并将其保持在-80°C以备后用。

1. 裂解液制备
   1. 将称重纸和2 mL微量离心管放在干冰上预先冷却，然后再进行下一步骤。
   2. 从-80°C取乳腺组织，并将其保存在干冰上。
   3. 称重预冷计量纸上的组织，然后将组织转移到2 mL微量离心管（干冰处理）上。每个样品使用50至100 mg的组织。将组织保持在干冰上，直到步骤2.1.5。
   4. 使用下列公式，制备所需量的补充有NaF，NaVO ₃和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的三重洗涤剂溶解缓冲液，如材料表所示。小鼠:所需缓冲液（μL）=小鼠组织重量（mg）×3;老鼠:需要缓冲液（μL）=大鼠组织重量（mg）×5。
   5. 将所需量的冰冷裂解缓冲液（在步骤2.1.4中计算）加入到含有组织的2mL管中。
      注意:在步骤2.1.5-2.1.6中，一次进行一根单管。
   6. 使用组织研磨机上的连续匀浆将组织匀化30-40秒;始终将管保持在冰上。将组织匀浆器调整至中等速度，并轻轻地将研磨机上下移动到管内。
   7. 与其他管重复步骤1.6和1.7。
   8. 将溶胞产物在冰上孵育10-30分钟。
   9. 在4℃下以170×g离心管10分钟。
   10. 同时，为每个样品确定6-10个微量离心管（0.6 mL），并将其保存在冰上。
   11. 离心完成后，检查管子。确保它们含有顶层脂肪，透明，黄色至粉红色的裂解物（取决于显影阶段）和颗粒。
   12. 在脂质层中创建一个孔使用200μL移液管吸头进入液相。改变提示并收集裂解物，而不会干扰沉淀或吸入脂质层。将裂解物在冰上预先标记的管中等分（步骤2.1.11），并将其储存在-80℃。
   13. 使用等分试样使用适当的市售试剂盒来定量蛋白质浓度（见材料表 ）。
2. 间接免疫沉淀
   1. 在冰上，解冻之前制备的全部乳腺裂解物的两个等分试样。
      注意:一个等分试样将用于目标蛋白质的IP，而另一个将用作阴性对照。
   2. 收集500-1,000μg裂解物，并在PBS中稀释至每个1.5 mL管中达到最终体积200μL。
      注意:使用的裂解物的量取决于感兴趣的蛋白质的丰度和抗体的效率（参见图3的例如，以及材料表 ）。为了优化每个靶，应使用不同量的裂解物（ 即 500,750和1,000μg）和抗体（ 即 5,10和20μg）。继续执行以下步骤（2.2.3-2.3.7.4）。
   3. 将针对感兴趣的抗原的抗体添加到第一个裂解物管中并保持在冰上。
      注意:所需金额通常由每家公司提供的说明书中提出（见材料表 ）。
   4. 在第二管中，通过加入与步骤2.2.3中使用的抗体相同的同种型IgG对照浓度来制备阴性对照。
   5. 在管式辊式混合器中以4℃低速孵育管过夜。
   6. 第二天，将50μL磁珠加入新的1.5 mL管中进行预洗。
      1. 基于对抗体的相对亲和力，选择蛋白A或蛋白G磁珠。
      2. 避免使用聚集的珠子是很重要的;轻轻混合珠悬浮液，直至将其均匀地重新悬浮，然后再加入管中。
   7. 将含有珠粒的管放在磁性支架上，使珠子迁移到磁体上。使用200μL移液管从珠中取出储存缓冲液。
   8. 通过加入500μLPBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤珠子，并将管子剧烈旋转10秒。
   9. 将管子放回到磁性支架上，让珠子移动到磁铁上。
   10. 用200μL移液管移液多余的洗涤缓冲液。
   11. 将步骤2.2.5中的反应络合物（裂解物抗体）加入到珠中，并在辊式混合器中在室温下孵育90分钟。
   12. 将管放在磁性支架上，使珠子迁移到磁铁上。使用200μL移液管，吸出并丢弃裂解物，并将管置于冰上。
   13. 清洗珠子通过加入500μLPBS，将管置于磁性架上，并用200μL移液管除去液体。重复这个洗涤步骤。在洗涤步骤中，避免涡旋并将样品保持在冰上。
   14. 用PBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤珠子一次，不涡旋，并使用200μL移液管吸头丢弃最后的洗涤缓冲液。
   15. 为了洗脱，向管中加入20μL的0.2M酸性甘氨酸（pH = 2.5），并在辊式混合机上摇动7分钟。
   16. 以高速离心几秒钟（快速旋转），并将上清液收集在新鲜的冰冷管中。
   17. 对每个管重复步骤2.2.14和2.2.15。
       注意:最终体积为40μL。
   18. 将10μL4x Laemmli缓冲液加入到步骤2.2.16的40μL洗脱样品中。
       注意:由于酸性pH，颜色会变黄。
   19. 立即将1 M Tris（pH = 8）一次一滴加入从步骤2.2.18洗脱的样品至其颜色变蓝继续下一个管。
   20. 将样品从步骤2.2.18在70-90℃下煮沸10分钟。立即进行凝胶电泳。或者，将样品转移至-80°C的冷冻箱中直至加载。
3. 下游应用:凝胶电泳，然后进行Western印迹
   1. 按照标准程序准备分离和堆叠SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶（1.5 mm厚） ¹⁵ 。
      注意:凝胶的选择（8-15％丙烯酰胺，梯度:参见材料表 ）应根据要沉淀的蛋白质的分子大小和待分析的潜在的结合配偶体来确定。这些蛋白质必须彼此分离，以便进行适当的免疫检测。
   2. 在冰上解冻免疫沉淀（IP） - 样品（步骤2.2.20）。
   3. 从相同的样品制备蛋白质裂解物（用于上述IP程序）。使用50的总裂解物并加入4X Laemmli样品缓冲液。将样品在70-90℃下煮沸5分钟，置于冰上直至加载。
      注意:这些样品将在洗脱的IP样品旁边加载，以证明在总裂解物中存在沉淀的蛋白质。
   4. 将来自步骤2.3.3的制备的裂解物和来自步骤2.2.20的沉淀的样品并排放在丙烯酰胺凝胶中，并将其运行在运行缓冲液（10×运行缓冲液:30.3g Tris，144.1g甘氨酸和10在1L蒸馏水中的SDS）在100V下进行近似95分钟，或者直到迁移蛋白的边缘到达凝胶的底部。
   5. 使用标准方案9,15将凝胶转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。
   6. 在5％干牛奶-TBSBS（20mM Tris，500mM NaCl，和0.05％聚山梨醇酯20）中，在低速摇瓶上将膜封闭1小时。
   7. 确定降水是否成功cessful。
      1. 探测使用针对沉淀蛋白的第一抗体的膜，以5％干奶牛TTBS以制造商推荐的浓度稀释，在4℃下在缓慢搅动的摇摆平台上过夜。
         注:有关建议，请参见材料表 。
      2. 第二天，用高速搅拌的摇摆平台上的TTBS洗涤膜3次，每次5分钟。
      3. 在慢慢搅拌的摇摆平台上，将RTT上缀合有辣根过氧化物酶（HRP）的适当的二抗体在TTBS上孵育1小时。
         注意:或者，如果检测到信号的适当装置可用，则可以使用与荧光染料缀合的二抗。
      4. 在高搅拌的摇摆平台上进行3至6次洗涤，每次5分钟，用TTBS洗涤。通过将膜与商业化孵育来分析二抗的信号可用的鲁米诺溶液（见材料表 ），并遵循制造商说明。使用化学发光成像系统检测信号（参见材料表 ）。
         注意:有关Western印迹分析的详细方案，请参见参考文献16。
   8. 要确定相互作用的蛋白质，请执行步骤2.3.7.1-2.3.7.4在相同印迹上使用适当的抗体。
      注意:如果蛋白质相互作用，结合配偶体将与靶蛋白共同免疫沉淀，因此可通过Western印迹法检测。可以用更多的抗体重复步骤2.3.8，以确定其他蛋白质是否存在于相同的蛋白质复合物中，只要蛋白质的分子量不同就足以在凝胶和膜上分离得很好。
   9. 要确认所识别的绑定伙伴不是工件，应执行互惠IP。
      注意:这是通过重复执行的步骤2.2.1-2.2.20，其具有相同的裂解物，但沉淀步骤3.8中鉴定的结合伴侣之一。然后，使用针对目的蛋白的第一抗体重复步骤3.1-3.8。

Results

为了确定GJ，AJ和TJ组分是否可以在乳腺中相互作用，首先进行共IF测定。分别用特异性抗体探测Cx26，GJ蛋白和β-Catenin，一种AJ蛋白，分别用荧光团缀合的小鼠-647（绿色，假色）和山羊-568（红色）抗体（ 图1B和C ） 。数据显示，在哺乳期第7天（L7），它们在小鼠乳腺的上皮细胞的细胞膜上共同定位，如黄色所反映的（ 图1D ）。其次，紧密连接蛋白-7，TJ蛋白; E-钙粘蛋白，一种AJ蛋白;和连接蛋白26（Cx26），其GJ蛋白用其特异性抗体进行探针，并分别用荧光团缀合的兔-488（绿色），小鼠-555（红色）和小鼠-647（珊瑚蓝;假色）抗体揭示（ 图2B-D ）。 E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7共定位是显示为黄色至浅橙色，而Cx26与E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7共定位导致在怀孕第18天（P18）（ 图2E ）的小鼠乳腺中发生白色斑点染色。

Discussion

通过连接的细胞 - 细胞相互作用是许多器官（如乳腺）的正常功能和发育所必需的。研究表明，连接蛋白可以调节彼此的功能和稳定性，并通过在细胞膜¹⁰处彼此束缚来激活信号转导。目前手稿中提出的方案提供了有关连接蛋白差异表达，定位和正常鼠腺发育相互作用的有趣发现⁹ 。鉴于连接蛋白定位对于蛋白质的功能至关重要，并且由于已知其与支架蛋白和许多激酶³相互作用，所以co-IF和co-IP是细胞 - 细胞相互作用领域中的有效技术。这些方法不仅对于在乳腺发育及其功能障碍中开辟连接关系的必要性至关重要在乳腺癌中的调节，但也可以用于其他组织和使用细胞系的实验中。

乳腺由两个主要部分组成:基质和上皮细胞⁴ 。成年上皮由两层细胞制成。在这种方法中，使用co-IF技术确定了潜在的结合配偶体的接近程度，并且使用co-IP确认了它们的物理相互作用。 Co-IF已被其他人成功地用于证明蛋白质在同一组织，结构，细胞或细胞内区室

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小鼠品系和阶段	St. Constant，魁北克，加拿大		C57BL/6 女性;怀孕第 18 天 （P18） 和哺乳第 14 天 （L14），加拿大查尔斯河
PBS 10x（原液）			1） 溶解 80 g NaCl （F.W.： 58.44）， 2 g KCl （F.W. 74.55）， 26.8 g Na2HPO4·7H2O （F.W.268.07） 和 2.4 g KH2PO4 （F.W.：136.09） 溶于 800 mL 蒸馏水中; 2） 将 PH 调整为 7.4; 3） 加水至达到 1 L 的最终体积。
TBS 10x（原液）			1） 将 60.5 g TRIS、87.6 g NaCl 溶于 800 mL 蒸馏水中; 2） 将 pH 调节至 7.5; 3） 加水至达到 1 L 的最终体积。
Part 1： 免疫荧光
>冷冻培养基	VWR International， Ville Mont-Royal， QC， Canada	95067-840	VMR 冻存切片化合物
切片机	Mississauga， ON， Canada	956640	Microm HM525， Thermo Fisher Scientific HM525 NX 低温恒温器 115 V 60 Hz
刀片	C.L. Sturkey， Inc. Les Produits 科学 ESBE 加拿大魁北克省圣洛朗	BLM1001C	高调的镀金刀片
Pap 笔	Cedarlane，加拿大安大略省伯灵顿	8899	Super PAP 笔，Thermo Fisher Scientific
显微载玻片	Fisher Scientific，加拿大安大略省伯灵顿	12-550-15	Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片
甲醛	BioShop Canada Inc， Burlington， ON， Canada	FOR201.1	Forlmadehyde
牛血清白蛋白 （BSA）	Santa Cruz Biotechnology， Inc， California， USA
封闭液			TBS 中 3% BSA
洗涤液			TBS-Tween 20 0.1%
聚山梨酯 20	Oakville， ON，加拿大	P 9416	吐温 20，Sigma-Aldrich
封固剂	Cedarlane，Burlington，ON	17984-25（EM）	Fluoromount-G
一抗和二抗	Cell Signaling，美国马萨诸塞州贝弗利	见评论	E-钙粘蛋白 （4A2） 小鼠单克隆抗体 （#14472s） 1/50（细胞信号转导）与抗小鼠 IgG Fab2 Alexa Fluor 555 （#4409s），细胞信号转导
一抗 & 二抗	Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 &Cell Signaling， Beverly， MA， USA	查看评论	Claudin-7 （#34-9100） 1/100 （Life Technologies） 与抗兔 IgG Fab2 Alexa Fluor 488 （#4412s） （Cell Signaling）
一抗 & 二抗	Santa Cruz Biotechnology， Inc，美国加利福尼亚州;Fischer Scientific，加拿大安大略省伯灵顿	见评论	&β;-连环蛋白抗体 （C-18）： sc-1496 （SANTA CRUZ） 含抗山羊 IgG （H+L） Alexa Fluor 568 （#A11057）， 分子探针 （Fisher Scientific）
一抗 & 二抗	Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 &Cell Signaling， Beverly， MA， USA	查看评论	Connexin26 （#33-5800） 1/75 （Life Technologies） 含抗小鼠 IgG Fab2 Alexa Fluor 647 （#4410s）
细胞核染色	Fisher Scientific，加拿大安大略省伯灵顿	D1306	DAPI（4'，6-二脒基-2-苯吲哚，二盐酸盐）1/1,000 在 PBS
荧光显微镜	尼康加拿大，加拿大密西沙加，加拿大		尼康 A1R+ 共聚焦显微激光器配备光谱检测器
IF图像分析软件	尼康加拿大，安大略		NIS-elements 软件（版本 4）
第 2 部分：免疫沉淀
三重去污剂裂解缓冲液 （100 mL） pH=8.0			1） 混合 50 mM TRIS （F.W.： 121.14）， 150 mM NaCl（振荡量：58.44）、0.02% 叠氮化钠、0.1% SDS、1% NONIdET P40、0.5% 脱氧胆酸钠溶于 80 mL 蒸馏 H2O./ 2） 用 HCl 6 将 pH 值调节至 8.0 N （~0.5 mL）. 3） 将音量调节至 100 请存放在冰箱中。 在蛋白质提取当天，在计算量的三重洗涤剂裂解缓冲液中使用 1/100 NaVo3、1/100 蛋白酶/磷酸酶抑制剂和 1/25 NAF： 氟化钠（原液）溶液 1.25 M （F.W.： 41.98），原钒酸钠（原液）溶液 1 M （F.W.： 183.9）
蛋白酶/磷酸酶抑制剂	Fisher Scientific，伯灵顿，安大略省	78441	终止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，不含 EDTA （100x）
蛋白质剂量	Thermo Scientific，美国伊利诺伊州罗克福德	23225	Pierce BCA 蛋白检测试剂盒
组织研磨机	Fisher Scientific，伯灵顿，安大略省	FTH-115	Power 125，型号 FTH-115
磁珠和支架	Millipore，怡陶碧谷，安大略省，加拿大		PureProteome 蛋白 G 磁珠系统 （LSKMAGG02）
用于 IP			PBS 或 PBS-Tween20 的洗涤溶液 0.1% 取决于步骤
用于免疫沉淀的一抗	细胞信号传导，美国马萨诸塞州贝弗利	参见评论	（兔（DA1E）mAb IgG同种型对照（#3900s）（细胞信号传导）0.5 µL/200 和微量;L
免疫沉淀一抗	细胞信号传导， 美国马萨诸塞州贝弗利	查看评论	IgG 小鼠小鼠 （G3A1） mAb IgG 同种型对照 （#5415s） （细胞信号传导） 0.5 &微量;L/200 和微量;L
用于免疫沉淀的一抗	Sigma-Aldrich， Oakville， ON， Canada	见评论	Connexin43 （#C6219） （Sigma-Aldrich） 4 &微;L/200 &微;L
免疫沉淀一抗	Cell Signaling， Beverly， MA， USA	参见评论	E-cadherin （4A2） 小鼠单克隆抗体 （#14472s） （Cell Signaling） 1 µL/200 和微量;L
Laemmli 缓冲液	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1610747	4x Laemmli 样品缓冲液（按照制造商的建议添加 &β;-巯基乙醇）
酸性甘氨酸	Fisher Scientific，伯灵顿，安大略省	PB381-5	0.2 M 甘氨酸;用 HCl 调节 pH=2.5
崔斯	Fisher Scientific，安大略省伯灵顿	BP152-1	1 M （pH=8）
SDS-PAGE 丙烯酰胺凝胶	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1610180 -5	TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺溶液（7.8%、10%、12%）
电泳缓冲液 10x	BIO-RAD， 密西沙加， 安大略省， 加拿大	1704272	Tris 30.3 g/甘氨酸 144.1 g /SDS 10 g 溶于 1 L 蒸馏水中
	膜 BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1704272	PVDF 膜，Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 转移试剂盒
转移方法	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1704155	Trans-Blot Turbo Transfer System
干奶	Smucker Food of Canada Co，加拿大安大略省		脂速溶脱脂奶粉，康乃馨
封闭液印迹			5% 奶粉溶于 TBS-Tween 20 0.1%
印迹			TBS-Tween 20 0.1%
印迹一抗和二抗 （10 mL）	Sigma-Aldrich， 奥克维尔， 安大略省 &加拿大安大略省多伦多	Abcam 查看评论	Connexin43 （#C6219） （Sigma-Aldrich） 1/2,500 含 HRP 偶联的 Veriblot 用于 IP 二抗 （ab131366） 1/5,000 （Abcam， Toronto， ON， Canada）
用于印迹的一抗和二抗 （10 mL）	Cell Signaling，美国马萨诸塞州贝弗利 &加拿大安大略省多伦多市 Abcam	查看评论	E-cadherin （24E10） 兔单克隆抗体 1/1,000 （#3195s） （细胞信号传导） 1/1,000 含 HRP 偶联的 Veriblot 用于 IP 二抗 （ab131366） 1/5,000 （Abcam， Toronto， ON， Canada）
用于印迹的一抗和二抗 （10 mL）	Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 &加拿大安大略省多伦多	Abcam 查看评论	Claudin-7 （#34-9100） （Life technologies） 1/1,000 含 HRP 偶联的 Veriblot 用于 IP 二抗 （ab131366） 1/5,000 （Abcam， Toronto， ON， Canada）
用于印迹的一抗和二抗 （10 mL）	Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 &Abcam，多伦多，安大略省，加拿大	查看评论	Claudin3 （#34-1700） （Life technologies） 1/1,000，含 HRP 偶联的 Veriblot，用于 IP 二抗 （ab131366） 1/5,000（Abcam，多伦多，安大略省，加拿大）
用于印迹信号检测的鲁米诺溶液	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1705061 Clarity	Western ECL 印迹底
物成像印迹	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	1708280	ChemiDoc MP 成像系统
分析印迹	BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加	ImageLab 5.2 软件