细胞间连接是乳腺在特定发育阶段发挥功能和发育所必需的结构。本文提供了一种利用小鼠乳腺组织研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）及共定位的详细实验方案。这些技术可用于探究不同发育阶段下细胞间连接结构之间物理关联的动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
细胞间相互作用在维持乳腺组织完整性和不同区室之间的屏障中起着关键作用。这些相互作用由连接蛋白介导，连接蛋白在相邻细胞之间形成连接结构。连接蛋白的错误定位及其与结合伴侣之间物理关联的减少可能导致功能丧失，进而引起器官功能障碍。因此，在正常和疾病相关组织中鉴定蛋白质定位及蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）对于发现导致疾病进展或发育状态改变的新证据和机制至关重要。本文介绍了一种两步法，用于评估小鼠乳腺中的蛋白质-蛋白质相互作用。在方案第1部分中，描述了使用针对目标蛋白的特异性抗体进行共免疫荧光（co-IF）检测的方法，随后使用荧光染料标记的二抗进行检测。尽管共免疫荧光可用于展示蛋白之间的空间邻近性，但无法用于研究其物理相互作用。因此，在方案第2部分中提供了共免疫共沉淀（co-IP）的详细操作流程。该方法用于确定蛋白质之间的物理相互作用，但不能确认这些相互作用是直接还是间接的。近年来，共免疫荧光和共免疫共沉淀技术已证明，细胞间连接的某些组分在乳腺发育过程中共定位并相互作用，形成依赖于发育阶段且动态变化的连接结构。
引言
乳腺的生长和发育主要发生在出生后。该器官在整个哺乳动物的生殖生命周期中持续进行自我重塑1。成年乳腺上皮由内层的腔面上皮细胞和外层主要由肌上皮细胞构成的基底细胞层组成，其外周由基底膜包绕2。关于乳腺结构与发育的综述，读者可参考Sternlicht1。通过间隙连接（GJ）、紧密连接（TJ）和黏附连接（AJ）介导的细胞间相互作用对乳腺的正常发育和功能至关重要1,3,4,5,6。这些连接结构在小鼠乳腺中的主要组分包括：Cx26、Cx30、Cx32 和 Cx43（GJ）；Claudin-1、-3、-4、-7 以及 ZO-1（TJ）；以及 E-cadherin、P-cadherin 和 β-catenin（AJ）7,8。这些不同连接蛋白的表达水平在乳腺发育的不同阶段呈现时序依赖性变化，提示细胞间相互作用的需求存在差异9
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方案
本研究中使用的所有动物实验方案均经加拿大拉瓦尔市国立科学研究院-阿芒·弗拉里研究所动物护理委员会批准。
1. 鉴定蛋白质共定位
- 从组织到显微镜载玻片
注意：组织和切片应在干冰上操作。- 从动物体内切除乳腺组织（有关该操作的完整描述，请参见 Plante et al.)14。
- 将切除的组织置于干冰上的冷冻/包埋介质中包埋。加入足量介质以覆盖腺体。待介质凝固后，将组织转移至 -80 °C 冰箱中保存以备后续使用9。
- 使用设定温度 ≤ -35 °C 的冷冻切片机，将组织切成 7–10 μm 厚的切片，并将其放置于显微镜载玻片上。
注意：如有可能，每张载玻片放置两个切片；左侧切片用作阴性对照，以验证抗体的特异性和组织的自发荧光，右侧切片则用于抗体标记。 - 将切片保存在 -80 °C 环境中以备后续使用。
- 共免疫荧光染色（Co-IF）
- 从冰箱中取出合适的显微镜载玻片，并立即在室温（RT）下将其浸入 4% 甲醛中固定 15 分钟。
- 随后将载玻片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温下....
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结果
为了确定缝隙连接（GJ）、黏附连接（AJ）和紧密连接（TJ）组分是否能够在乳腺中相互作用，首先进行了共免疫荧光（co-IF）检测。使用特异性抗体分别检测GJ蛋白Cx26和AJ蛋白β-Catenin，并用荧光素偶联的鼠抗647（绿色，伪彩色）和羊抗568（红色）抗体进行显色（图1B和C）。结果显示，在哺乳第7天（L7）的小鼠乳腺上皮细胞细胞膜上，两者存在共定位，表现为黄色信号（图1D）。其次，使用特异性抗体分别检测TJ蛋白Claudin-7、AJ蛋白E-cadherin以及GJ蛋白Connexin26（Cx26），并分别用荧光素偶联的兔抗488（绿色）、鼠抗555（红色）和鼠抗647（珊瑚蓝，伪彩色）抗体进行显色（图2B-D）。在妊娠第18天（P18）的小鼠乳腺组织中，E-cadherin与Claudin-7的共定位呈现为黄至浅橙色，而Cx26与E-cadherin及Claudin-7的共定位则表现为白色点状染色（图2E
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讨论
通过连接结构实现的细胞间相互作用对于多种器官（如乳腺）的正常功能和发育至关重要。研究表明，连接蛋白可通过在细胞膜上相互锚定，调节彼此的功能与稳定性，并激活信号转导10。本论文所采用的实验方案已揭示了在正常小鼠乳腺发育过程中，连接蛋白在表达差异、定位及相互作用方面的若干重要发现9。鉴于连接蛋白的定位对其功能至关重要，且已知其可与支架蛋白及多种激酶发生相互作用3，共免疫荧光（co-IF）和共免疫沉淀（co-IP）已成为研究细胞间相互作用领域的有效技术。这些方法不仅对于阐明连接结构在乳腺发育中的必要性及其在乳腺癌中的异常调控具有重要意义，还可广泛应用于其他组织以及细胞系实验中。
乳腺由两个主要区室组成：间质和上皮4。成年上皮由两层细胞构成。在本方法中，使用共免疫荧光（co-IF）技术确定潜在结合伴侣之间的接近性，并通过共免疫共沉淀（co-IP）验证其物理相互作用。此前已有研究成功应用co-IF技术，.......
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致谢
I.P. 获得加拿大自然科学与工程研究理事会基金（NSERC #418233-2012）、魁北克卫生研究基金会（FRQS）、魁北克乳腺癌基金会职业奖以及加拿大创新基金会 Leader Founds 基金的资助。E.D. 获得了阿尔芒-弗拉皮耶大学基金会提供的奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠品系与发育阶段 | 加拿大魁北克省圣康斯坦 | C57BL/6 雌性小鼠；妊娠第18天（P18）和泌乳第14天（L14），Charles River Canada | |
| PBS 10x（储存液） | 1) 溶解 80 g NaCl（分子量：58.44）、2 g KCl（分子量：74.55）、26.8 g Na2HPO4·7H2O（F.W. 268.07）和2.4 g KH2PO4 (F.W.：136.09) 溶于 800 mL 蒸馏水中； 2) 将pH值调节至7.4； 3) 加水至终体积为 1 L。 | ||
| TBS 10倍（储存液） | 1) 将 60.5 g TRIS 和 87.6 g NaCl 溶解于 800 mL 蒸馏水中； 2）将 pH 值调节至 7.5； 3）加水至终体积 1 L。 | ||
| 第1部分：免疫荧光 | |||
| 冻存培养基 | VWR International，加拿大魁北克省蒙特皇家市 | 95067-840 | VMR冷冻切片复合物 |
| 切片机 | 加拿大安大略省密西沙加 | 956640 | Microm HM525，Thermo Fisher Scientific HM525 NX 冷冻切片机 115 V 60 Hz |
| 刀片 | C.L. Sturkey, Inc. 产品 科研人员 ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | 高精度镀金刀片 |
| Pap笔 | Cedarlane，Burlington，ON，加拿大 | 8899 | Super PAP笔，Thermo Fisher Scientific |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific，Burlington，ON，加拿大 | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 |
| 甲醛 | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | 甲醛 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| 封闭液 | TBS 中含 3% BSA | ||
| 洗涤液 | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| 聚山梨酯 20 | 加拿大安大略省奥克维尔 | P 9416 | Tween 20，Sigma-Aldrich |
| 封片剂 | Cedarlane，Burlington，ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| 首先 &和二抗 | 细胞信号传导，美国马萨诸塞州贝弗利 | 请参见评论 | E-钙黏蛋白 (4A2) 小鼠单克隆抗体 (#14472s) 1/50 (Cell Signaling)，使用 Cell Signaling 的抗小鼠 IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s) |
| 首先 &和二抗 | Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 && 细胞信号转导，美国马萨诸塞州贝弗利 | 参见评论 | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies)，使用抗兔 IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| 首先 &和二抗 | 美国加利福尼亚州 Santa Cruz Biotechnology, Inc；加拿大安大略省伯灵顿 Fischer Scientific | 参见评论 | ββ-连环蛋白抗体（C-18）：sc-1496（SANTA CRUZ），使用抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 568（#A11057），Molecular Probes（Fisher Scientific） |
| 首先 &和二抗 | Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 & Cell Signaling，美国马萨诸塞州贝弗利 | 参见评论 | 连接蛋白26 (#33-5800) 1/75（Life Technologies），使用抗小鼠IgG Fab2 Alexa Fluor 647（#4410s） |
| 细胞核染色 | Fisher Scientific，Burlington，ON，加拿大 | D1306 | DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）1/1,000 溶于 PBS |
| 荧光显微镜 | Nikon Canada，密西沙加，安大略省，加拿大 | 配备光谱检测器的尼康A1R+共聚焦激光显微镜 | |
| IF 图像分析软件 | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements 软件（版本 4） | |
| 第2部分：免疫沉淀 | |||
| 三重去垢剂裂解缓冲液（100 mL) pH=8.0 | 1) 混合50 mM TRIS（F.W.：121.14）、150 mM NaCl（分子量：58.44），0.02% 叠氮化钠，0.1% SDS，1% NONIdET P40，0.5% 脱氧胆酸钠溶于 80 mL 蒸馏 H2O. 2) 用6 M HCl将pH值调至8.0 N（约0.5 mL 3) 将体积调至 100 毫升。置于冰箱中保存。 在蛋白质提取当天，使用 1/100 的 NaVo3，按计算量加入1/100蛋白酶/磷酸酶抑制剂和1/25 NAF的Triple去垢剂裂解缓冲液： 氟化钠（储备液）溶液 1.25 M（F.W.：41.98），原钒酸钠（储存液）溶液1 M（F.W.：183.9） | ||
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂 | Fisher Scientific，Burlington，ON | 78441 | Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，不含EDTA（100倍浓缩液） |
| 蛋白质剂量 | Thermo Scientific，美国伊利诺伊州罗克福德 | 23225 | Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 |
| 组织研磨器 | Fisher Scientific，安大略省伯灵顿 | FTH-115 | Power 125，型号 FTH-115 |
| 磁珠与磁力架 | Millipore，加拿大安大略省密西沙加 | PureProteome Protein G 磁珠系统（LSKMAGG02） | |
| 免疫沉淀洗涤液 | PBS 或含 0.1% Tween20 的 PBS，根据步骤选择 | ||
| 用于免疫沉淀的一抗 | 细胞信号传导，美国马萨诸塞州贝弗利 | 请参见评论 | IgG 兔（兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG 同型对照 (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| 用于免疫沉淀的一抗 | 细胞信号传导，美国马萨诸塞州贝弗利 | 参见评论 | 小鼠 IgG (G3A1) 单克隆抗体 IgG 同型对照 (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| 用于免疫沉淀的一抗 | Sigma-Aldrich，加拿大安大略省奥克维尔 | 参见评论 | 连接蛋白43（#C6219）（Sigma-Aldrich）4 µL/200 µL |
| 用于免疫沉淀的一抗 | Cell Signaling，美国马萨诸塞州贝弗利 | 参见评论 | E-cadherin (4A2) 小鼠单克隆抗体 (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli缓冲液 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1610747 | 4x Laemmli 样品缓冲液（添加 β-巯基乙醇，按照制造商的说明） |
| 酸性甘氨酸 | Fisher Scientific，Burlington，ON | PB381-5 | 0.2 M 甘氨酸；用 HCl 调节 pH 至 2.5 |
| Tris | Fisher Scientific，Burlington，ON | BP152-1 | 1 M（pH=8） |
| SDS-PAGE 丙烯酰胺凝胶 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺溶液（7.8%、10%、12%） |
| 运行缓冲液 10x | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1704272 | Tris 30.3 g/甘氨酸 144.1 g/SDS 10 g 溶于 1 L 蒸馏水中 |
| 膜 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1704272 | PVDF膜，Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 转膜试剂盒 |
| 转移方法 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1704155 | Trans-Blot Turbo 转膜系统 |
| 脱脂奶粉 | 加拿大安大略省万锦市，加拿大斯穆克食品公司 | 无脂速溶脱脂奶粉，Carnation | |
| 印迹实验用封闭液 | TBS-Tween 20 0.1% 中的 5% 脱脂奶粉 | ||
| 印迹洗涤液 | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| 用于印迹的初级和次级抗体（10 mL | Sigma-Aldrich，安大略省奥克维尔 & Abcam，加拿大安大略省多伦多市 | 参见评论 | 连接蛋白43（#C6219，Sigma-Aldrich）1/2,500，与HRP偶联的Veriblot用于IP二抗（ab131366）1/5,000（Abcam，多伦多，ON，加拿大） |
| 用于印迹的初代和次代抗体（10 mL | 细胞信号传导，Beverly，MA，USA && Abcam，加拿大安大略省多伦多市 | 参见评论 | E-cadherin（24E10）兔单克隆抗体 1/1,000（#3195s，Cell Signaling），与HRP偶联的Veriblot for IP二抗（ab131366）1/5,000（Abcam，加拿大安大略省多伦多市） |
| 用于印迹的初级和次级抗体（10 mL | Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 && Abcam，加拿大安大略省多伦多市 | 参见评论 | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000，与 HRP 标记的 Veriblot for IP 二抗 (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| 用于印迹的初级和次级抗体（10 mL | Life technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 && Abcam，加拿大安大略省多伦多市 | 参见评论 | Claudin3（#34-1700）（Life technologies）1/1,000，与 HRP 偶联的 Veriblot for IP 二抗（ab131366）1/5,000（Abcam，多伦多，安大略省，加拿大） |
| 用于印迹信号检测的鲁米诺溶液 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1705061 | Clarity Western ECL 印迹底物 |
| 成像印迹 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | 1708280 | ChemiDoc MP 成像系统 |
| 分析印迹 | BIO-RAD，加拿大安大略省密西沙加 | ImageLab 5.2 软件 |
参考文献
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J.
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