本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。
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摘要
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的作用正日益受到关注，原因是人们越来越希望了解其在癌症发生和发展过程中的分子机制。然而，lncRNA及重复序列在癌症中的全基因组表观遗传调控尚未得到充分研究，尤其是在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。本研究采用了一种独特的方法：利用甲基结合域（MBD）蛋白对双链甲基化DNA片段进行基于免疫沉淀的富集，随后结合高通量测序技术（MBD-seq）。研究中使用了属于两种不同预后亚组的CLL患者样本（5份IGVH突变样本 + 5份IGVH未突变样本）。分析结果显示，与正常健康对照相比，共鉴定出5,800个高甲基化和12,570个低甲基化的CLL特异性差异甲基化基因（cllDMGs）。尤为重要的是，本研究识别出多个具有潜在预后价值的CLL特异性差异甲基化lncRNA、重复元件以及蛋白编码基因。本文详细描述了一种为CLL患者样本设计的MBD-seq实验及生物信息学分析流程，用于全面分析富含CpG区域的全基因组甲基化谱。最后，通过焦磷酸测序——一种高度定量的CpG甲基化水平分析方法——对一个蛋白编码基因和一个lncRNA进行了验证，进一步支持了MBD-seq实验结果的可靠性。
引言
近年来，利用下一代测序技术分析全基因组DNA甲基化谱的方法日益普及。基于以下三种原理，已开发出多种全基因组甲基化检测方法，包括基于微阵列和非微阵列的技术：基因组DNA的亚硫酸氢盐转化、甲基化敏感性限制性内切酶消化，以及使用甲基化CpG特异性抗体对甲基化DNA进行免疫沉淀。
异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤（包括慢性淋巴细胞白血病，CLL）的标志性特征之一。此前，包括我们团队在内的多个研究小组利用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，结合微阵列方法或全基因组测序技术，对不同CLL预后亚组以及正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱进行了表征1,2,3,4。基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后，未修饰的胞嘧啶会脱氨为尿嘧啶，而基因组中已甲基化的胞嘧啶则保持不变。转化完成后，可通过PCR扩增和测序，结合不同的定性或定量方法（如基于微阵列的分析或全基因组亚硫酸氢盐测序，WGBS）来确定DNA的甲基化状态。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有多种优势，并已被广泛应用于多种癌症中DNA甲基化水平的分析，但该技术仍存在一些局限性。WGBS测序可在使用较少DNA量的情况下实现单碱基对分辨率，是分析大量样本的最佳选择。然而，该方法无法区分基因组中5mC与5hmC之间的修饰差异5,6。此外，基于微阵列的方法无法对整个基因组提供完全覆盖。
在我们实验室最近的一项研究中7基于免疫沉淀的方法而非亚硫酸氢盐转化法，被用于在全球范围内鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者与正常健康对照者中富含CpG的差异甲基化区域。在甲基化CpG结合结构域（MBD）下一代测序（MBD-seq）中，双链片段化DNA的富集程度取决于CpG甲基化的水平。该方法可克服亚硫酸氢盐转化法的局限性，并能以无偏倚且不依赖PCR的方式实现对CpG甲基化的全基因组覆盖。此外，与基于亚硫酸氢盐转化的微阵列方法不同，MBD-seq可用于分析重复序列元件的甲基化状态，例如长散布核元件（LINEs）、短散布核元件（SINEs）和长末端重复序列（LTRs）。 等等然而，与亚硫酸氢盐转化方法相比，MBD-seq 实验方案需要相对大量的起始 DNA。此外，测序读长的质量和数据质量取决于所用抗体的特异性、亲和力和质量。
本研究介绍了一种详细的甲基化DNA结合测序（MBD-seq）方案，用于富集甲基化DNA以进行下一代测序。该方法采用一种 commercially available 甲基化DNA结合富集试剂盒（见材料表），并结合计算分析流程，对甲基化测序数据进行可视化和解读，以鉴定与正常健康对照相比，慢性淋巴细胞白血病（CLL）特异性的高甲基化和低甲基化区域。该方法的基本原理是利用人MBD2蛋白的甲基化DNA结合结构域（MBD）与甲基化CpG位点的特异性结合能力，从而富集含有甲基化CpG的DNA片段，随后对富集的甲基化DNA进行高通量测序。
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方案
采集慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本的伦理批准日期为2007年5月21日，注册编号为：EPN Gbg dnr 239/07。所有CLL患者均根据最新修订的诊断标准8进行确诊，并在确诊时采集样本。本研究中的患者均来自瑞典西部不同血液科，在获得书面知情同意后纳入研究。本研究仅选取外周血单个核细胞（PBMC）样本中白血病细胞肿瘤比例≥70%的慢性淋巴细胞白血病病例。
1. 准备工作
- 使用商业分离试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书从慢性淋巴细胞白血病（CLL）及正常健康外周血样本中分离PBMCs，用于DNA提取。
- 对1.5 mL离心管进行高压灭菌。解冻甲基化DNA结合试剂盒中的所有试剂（参见材料表）。
- 使用无DNase的水，将试剂盒提供的5倍浓缩洗涤缓冲液稀释，配制10 mL的1倍珠洗缓冲液，用于洗涤磁珠并稀释试剂盒提供的MBD蛋白。
- 预先准备或获取以下试剂：3 M乙酸钠、无水乙醇和70%乙醇，用于DNA沉淀（材料表）。
2. 基因组DNA提取与超声处理
- 根据制造商的说明书，使用市售的DNA提取试剂盒（材料表）从患者和正常PBMC样本中提取基因组DNA。使用分光光度计在260 nm处对基因组DNA进行定量。
注意：DNA提取柱的最大承载能力为500万至600万个细胞；因此，对于超过500万个细胞的样本，必须使用多个提取柱。用总共100 µL的10 mM Tris EDTA（TE）缓冲液分两次等体积洗脱DNA。甲基化DNA结合（MBD）测序所用的甲基化富集试剂盒中的MBD-生物素蛋白不能与单链DNA结合。因此，为保持DNA的双链结构，洗脱后的DNA必须保存在冷冻或4 °C条件下。 - 用TE缓冲液（pH 8）将每个样本的5 µg基因组DNA稀释至总体积200 µL，最终浓度为25 ng/µL。
- 使用超声破碎仪（材料表）在特制的管中进行超声处理，共进行30个循环（每个循环开启30秒，关闭30秒；每完成5个循环后，短暂离心以将液体收集至管底）。
注意：此步骤将产生长度在150 bp至300 bp之间的DNA片段，适用于本实验方案。 - 在进行MBD测序的下一步之前，取1 µL片段化DNA样本与DNA分子量标记物一起，在市售的预制2%琼脂糖凝胶上使用DNA电泳成像设备检测所有样本的超声片段大小范围。使用标准紫外透射仪观察DNA条带。
3. MBD-生物素蛋白结合前的珠粒制备
- 将试剂盒提供的磁性链霉亲和素珠从原管中重悬，轻轻吹打混匀以获得均一的悬浮液。切勿涡旋震荡珠子，也避免其干燥。
- 将50 µL磁珠（每5 µg片段化DNA样本）分别加入已标记的干净1.5 mL离心管中。加入50 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，使终体积达到100 µL。
注意：使用小容量0.5 mL聚合酶链式反应（PCR）条状管洗涤磁珠时，每管加入约150–200 µL洗涤缓冲液，具体请参见试剂盒说明书。然而，若使用1.5 mL离心管，则每管至少加入250 µL至300 µL洗涤缓冲液进行磁珠洗涤。 - 将试管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集于靠近磁铁一侧的管壁内表面。使用200 µL移液器小心吸除上清液，避免触碰磁珠。
- 从磁力架上取下离心管，加入250 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，用移液器轻轻混匀磁珠。
- 对所有样品重复步骤 3.3 和 3.4 至少 4–5 次，最后重悬于 250 µL 1× 磁珠洗涤缓冲液中。置于冰上保存。
4. 将 MBD-biotin 蛋白结合到已洗涤的磁珠上
- 向不同的离心管中加入 35 µL MBD 蛋白（每 1 µg DNA 样品加 7 µL），再用 1x 磁珠洗涤缓冲液将总体积调至 250 µL。
- 将 250 µL 稀释后的 MBD 蛋白加入 250 µL 已洗涤的磁珠中，室温下置于旋转混合仪上旋转 1 小时。
- 磁珠与蛋白混合 1 小时后，洗涤与磁性链霉亲和素磁珠结合的 MBD 蛋白-生物素复合物。
- 将离心管置于磁力架上静置 1 分钟，用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠。加入 250 µL 1x 磁珠洗涤缓冲液，室温下在旋转混合仪上孵育 5 分钟。
- 重复步骤 4.3.1 两次，最后将洗涤后的 MBD-生物素磁珠重悬于 200 µL 1x 磁珠洗涤缓冲液中，即可用于甲基化 DNA 的捕获。
注意：以该方式洗涤 2–3 次可彻底去除未结合的 MBD 蛋白磁珠背景，提高 MBD 蛋白偶联磁珠与片段化基因组 DNA 的结合效率。
5. 使用 MBD-biotin 磁珠结合片段化的基因组 DNA
- 在洁净的1.5 mL无DNase离心管中，加入100 µL 5倍浓度的珠子洗涤缓冲液和180 µL片段化的基因组DNA（步骤2.3）。用无DNase水将终体积调至500 µL。
- 向剩余的20 µL片段化基因组DNA中加入380 µL无DNase水，并将其冷冻保存。将这些样品作为输入DNA对照，在后续实验中与最终洗脱的甲基化DNA样品一同进行沉淀（见步骤7.1）。
- 将含有经洗涤的MBD-生物素珠子的离心管（步骤4.4）置于磁力架上静置1分钟，小心移除上清液，避免扰动珠子。加入500 µL用珠子洗涤缓冲液稀释的片段化基因组DNA。
- 用石蜡膜严密封闭所有离心管，置于4 °C、8–10 rpm的翻转摇床上过夜孵育。
注意：DNA与生物素珠子的结合反应可在室温下进行1小时完成，但4 °C过夜孵育可提高最终甲基化DNA的回收率。
6. 去除未结合的DNA并从磁珠上洗脱甲基化DNA
- DNA与MBD磁珠结合反应完成后，将离心管置于磁力架上1分钟，使所有磁珠聚集于管壁内侧。
- 用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠，并将此未结合的DNA样品组分保存在冰上。
- 向磁珠中加入200 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转仪上，室温旋转3分钟。随后将离心管放回磁力架上静置1分钟，吸除液体。重复该洗涤步骤两次，以彻底去除残留的未结合DNA。
- 最后一次洗涤后，向磁珠中加入200 µL高盐洗脱缓冲液（2,000 mM NaCl，试剂盒中提供），用于DNA的洗脱。
- 将离心管置于旋转仪上，室温旋转15分钟。然后将离心管置于磁力架上静置1分钟，用移液器小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。
- 再次加入200 µL高盐洗脱缓冲液，室温旋转15分钟进行第二次洗脱。将第二次洗脱的上清液加入之前收集第一次200 µL洗脱液的同一离心管中。
注意：最终共400 µL洗脱DNA现已准备好进行乙醇沉淀，以获得适用于下一代测序的纯化DNA。
7. 甲基化DNA的乙醇沉淀与富集
- 向400 µL洗脱的DNA以及在步骤5.2中制备的400 µL输入DNA样品中，各加入1 µL甘油原（20 µg/µL；试剂盒中提供）；40 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）；以及800 µL预冷的无水乙醇。
- 使用涡旋振荡器充分混匀各管，并于-80 °C孵育过夜。
- 在4 °C、12,000 × g（最大转速）条件下离心各管。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。向每管中加入500 µL 70%乙醇，并涡旋振荡混匀。
- 再次于4 °C以最大转速离心15分钟，然后用移液器小心吸除上清液。再于室温下以最大转速离心1分钟，并用移液器尖端彻底去除残留乙醇。
- 将沉淀在室温下空气干燥5分钟。向DNA沉淀中加入10 µL无DNase的水。随后进行甲基化DNA定量（步骤7.6）、MBD测序（步骤7.7）及分析（第8和第9节）。
- 使用市售的荧光定量试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书对最终回收的甲基化DNA样品进行定量。
- 注意：采用本方案，每个样品可回收30–50 ng最终DNA。DNA样品可置于干冰中运输，用于后续文库构建和高通量MBD测序。
- 使用商业平台（材料表）进行DNA文库构建和高通量MBD测序，具体方法见参考文献9。
注意：为对最终甲基化DNA进行初步质量控制，应对所有样品采用50 bp双端测序方式进行文库制备。按步骤8.1所述对原始数据进行测序后质量控制处理，并按以下方法（步骤8.2–9.6）进一步使用生物信息学方法和统计学方法进行分析。
8. 生物信息学分析方法1：鉴定慢性淋巴细胞白血病相关差异甲基化区域（cllDMRs）
- 使用可用的质量控制工具（如 Trimmomatic）对获得的 49-bp 读段（FASTQ 格式）进行接头序列清洁10 或使用 Cutadapt。利用 FastQC 工具包对剪切后的测序读段进行质量交叉验证：
java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:30:10 - 使用短读长基因组比对工具 Bowtie 将清洗后的 FASTQ 文件与参考基因组进行比对11指定以下参数：
- 允许最多两个错配（Bowtie 参数： - v 2).
- 将每条读段的比对结果限制为最佳的六条（Bowtie 参数： - m 6）以控制多重比对的读段。
bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq > SAMPLE.sam
注意：使用 SAMtools 将比对后为各个样本生成的 SAM 文件转换为 BAM 文件。
samtools view -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- 使用基于模型的ChIP-Seq分析（MACS）峰值识别工具对已比对的样本（BAM）进行分析，以预测慢性淋巴细胞白血病（CLL）亚组中的富集/甲基化区域12.
注意：比较 I：以 Input 样本作为对照组，正常样本和 CLL 患者样本均作为处理组。此步骤用于收集所有负向峰（即在 Input/背景中富集的峰）。比较 II：以正常样本组作为对照组，CLL 患者样本组作为处理组。获得的正向峰为 CLL 超甲基化区域，负向峰为 CLL 低甲基化区域（相对于正常样本）或差异甲基化区域（DMRs）。
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam - c SAMPLE_CONTROL.bam --格式 BAM -g hs - 使用 BEDtools 去除差异甲基化区域（DMRs）中的比较 I 背景峰13.
bedtools subtract -a <CLL 富集区> - b <输入富集区域> - 预测重复元件（SINE-Alu、LINE、 等等。富含差异甲基化区域（DMRs）。
- 使用 fastacmd 根据参考基因组 HG19 的染色体坐标提取 DMRs 的 FASTA 序列。
fastacmd -d HG19_genome.fa -s 染色体 -L 起始,终止 -l 50000 > DMRs.fasta - 使用 RepeatMasker 命令行工具预测 DMRs 的 FASTA 序列中重复元件所占的百分比。
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- 使用 fastacmd 根据参考基因组 HG19 的染色体坐标提取 DMRs 的 FASTA 序列。
- 使用 Homer 注释预测的差异甲基化区域 "annotatePeaks.pl" 使用现有的 Ensembl [PMC4919035] 或 Gencode [PMID 22955987] 转录本注释（包括蛋白质编码和非编码转录本）。
annotatePeaks.pl DMRs.bed <基因组> -gtf <Ensembl 或 Gencode GTF>
注意：此数据提供了不同基因区域上峰分布的信息（即， 启动子、外显子、内含子、3'非翻译区和5'非翻译区）以及基因间区域。与差异甲基化区域（DMRs）相关的转录本或基因称为差异甲基化基因（DMGs）。 - 使用更新后或当前的功能数据库，通过富集分析工具找出由CLL差异甲基化基因（仅限蛋白编码基因）显著富集的功能14.
注意：基于功能注释的基因集聚类（GeneSCF）14 是一种基于实时数据的功能富集分析工具，采用更新后的KEGG和基因本体（Gene Ontology）作为参考数据库。
9. 生物信息学分析方法2：鉴定与慢性淋巴细胞白血病相关的显著差异甲基化区域（cll sigDMR）
- 参照方法I（第8节）中的步骤8.1-8.5，并利用步骤9.2-9.6中详述的可用工具，采用基于读段数的差异富集分析，为分析流程增加一个层次的统计学验证。
- 使用正常样本和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本，量化比对到各个峰或差异甲基化区域（DMRs）的读段数量 "featureCounts" 来自 "Subread" 包装15.
subread/bin/featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
注意：可引入比对质量过滤以避免对低质量读段进行定量例如：-Q 30）在此步骤中，为获得的差异甲基化区域（DMRs）准备SAF文件。有关SAF文件格式的更多信息，请访问此链接 http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/。 - 使用包含正常样本组和CLL患者样本组中各峰读段数的RAW读段计数表作为edgeR的输入16.
注意：比较正常样本组与慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本组以鉴定显著差异甲基化区域（sigDMRs）。对于差异富集分析，请参照 edgeR 用户指南中的详细分步说明（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf）。 - 使用 edgeR 预测的错误发现率（FDR）和对数倍数变化对 sigDMRs 进行筛选16.
- 使用 Homer 注释预测的 sigDMR "annotatePeaks.pl" 使用现有的 Ensembl 或 Gencode 转录本注释（蛋白质编码和非编码转录本）。
annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl 或 Gencode GTF> -CpG
注意：此数据提供了不同基因区域上峰分布的信息即， 启动子、外显子、内含子、3'非翻译区和5'非翻译区）以及基因间区域。与显著差异甲基化区域（sigDMRs）相关的转录本或基因称为显著差异甲基化基因（sigDMGs）。 - 使用更新或当前的功能数据库，通过富集分析工具找出由CLL sigDMGs（仅限蛋白质编码基因）显著富集的功能14.
注意：GeneSCF 是一种用于功能富集分析的实时工具，采用 KEGG 和基因本体（Gene Ontology）作为参考数据库。
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结果
最近对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者及其匹配的正常健康对照样本进行了MBD-seq分析，以鉴定CLL特异性的差异高甲基化和低甲基化基因7。用于分析CLL和正常健康样本数据的实验与生物信息学流程如图1A和1B所示。这些分析鉴定出多个CLL特异性的差异甲基化区域（cllDMRs），这些区域在IGHV突变型和IGHV未突变型样本中相较于对照样本显著呈现高/低甲基化状态，p值<0.00001。图2A展示了来自正常B细胞和正常PBMC比较所得的所有cllDMRs。所有cllDMRs均被定位至不同类别的蛋白编码基因和非编码基因，如图2B所示。重要的是，在本分析中，CLL患者样本分别与两种不同的正常对照（分选的B细胞和PBMCs）独立进行比较。有趣的是，当与正常B细胞对照和正常PBMC对照样本比较时，分析结果显示大量共...
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讨论
MBD-seq 是一种基于免疫沉淀的经济高效的技术，可用于研究具有全基因组覆盖范围的甲基化模式。MeDIP-seq（甲基化DNA免疫沉淀后接测序）和 MBD-seq 均可实现富含 CpG 的甲基化 DNA 的富集。然而，与 MeDIP-seq 相比，MBD-seq 对富含 CpG 的区域具有更高的结合亲和力19。利用甲基结合富集试剂盒，可通过高盐和低盐缓冲液分别洗脱出高 CpG 富集和低 CpG 富集的 DNA 区域。在本研究中，仅进行单一分数洗脱，以捕获高度富集的 CpG 富集区域，覆盖大多数 CpG 岛。
MBD-seq 可作为 WGBS 的一种强大替代方法，后者常用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）及其他白血病研究。尽管与基于亚硫酸氢盐转化的方法相比，MBD-seq 需要相对更多的起始 DNA 量，但它能够特异性地检测仅与 5 mC 修饰相关的全基因组甲基化变化，且不会因转化后的 PCR 扩增而引入偏差。因此，MBD-seq 是研究 cllDMGs 的理想方法，这些基因可能是具有预后价值的潜在表观遗传学 CLL 标志基因。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞典研究理事会、瑞典癌症协会、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会（KAW）以及西约塔兰地区研发基金（FoU VästraGötalandsregionen）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNeasy 血液与组织试剂盒 | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep 溶液 | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE 缓冲液 pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor 标准超声破碎仪 | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX Bioruptor 管（1.5 mL） | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M 醋酸钠 | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase 安全成像仪组合试剂盒 | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% 琼脂糖凝胶 | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| MethylMiner 甲基化 DNA 富集试剂盒 | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake 管式振荡器/旋转器 | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| 涡旋混合器 | VWR | 12620-848 | |
| 绝对乙醇 | 任意公司 | ||
| 70% 乙醇 | 任意公司 | ||
| 无 DNA 酶水 | Milli Q | ||
| DNA 沉淀剂（3M 醋酸钠） | Diagenode | C03030002 | |
| 安全密封 1.5 mL Eppendorf 管 | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL 管 | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 平台 | Illumina | ||
| 水浴锅 | Grant | ||
| 加热块 | grant | ||
| 管式旋转器 | Labquake |
参考文献
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