本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。
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本文内容
摘要
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的作用正日益受到关注，原因是人们越来越希望了解其在癌症发生和发展过程中的分子机制。然而，lncRNA及重复序列在癌症中的全基因组表观遗传调控尚未得到充分研究，尤其是在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。本研究采用了一种独特的方法：利用甲基结合域（MBD）蛋白对双链甲基化DNA片段进行基于免疫沉淀的富集，随后结合高通量测序技术（MBD-seq）。研究中使用了属于两种不同预后亚组的CLL患者样本（5份IGVH突变样本 + 5份IGVH未突变样本）。分析结果显示，与正常健康对照相比，共鉴定出5,800个高甲基化和12,570个低甲基化的CLL特异性差异甲基化基因（cllDMGs）。尤为重要的是，本研究识别出多个具有潜在预后价值的CLL特异性差异甲基化lncRNA、重复元件以及蛋白编码基因。本文详细描述了一种为CLL患者样本设计的MBD-seq实验及生物信息学分析流程，用于全面分析富含CpG区域的全基因组甲基化谱。最后，通过焦磷酸测序——一种高度定量的CpG甲基化水平分析方法——对一个蛋白编码基因和一个lncRNA进行了验证，进一步支持了MBD-seq实验结果的可靠性。
引言
近年来，利用下一代测序技术分析全基因组DNA甲基化谱的方法日益普及。基于以下三种原理，已开发出多种全基因组甲基化检测方法，包括基于微阵列和非微阵列的技术：基因组DNA的亚硫酸氢盐转化、甲基化敏感性限制性内切酶消化，以及使用甲基化CpG特异性抗体对甲基化DNA进行免疫沉淀。
异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤（包括慢性淋巴细胞白血病，CLL）的标志性特征之一。此前，包括我们团队在内的多个研究小组利用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，结合微阵列方法或全基因组测序技术，对不同CLL预后亚组以及正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱进行了表征1,2,3,4。基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后，未修饰的胞嘧啶会脱氨为尿嘧啶，而基因组中已甲基化的胞嘧啶则保持不变。转化完成后，可通过PCR扩增和测序，结合不同的定性或定量方法（如基于微阵列的分析或全基因组亚硫酸氢盐测序，WGBS）来确定DNA的甲基化状态。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有多种优势，并已被广泛应用于多种癌症中DNA甲基化水平的分析，但该技术仍存在一些局限性。WGBS测序可在使用较少DNA量的情况下实现单碱基对分辨率，是分析大量样本的最佳选择。然而，该方法无法区分基因组中5mC与5hmC之....
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方案
采集慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本的伦理批准日期为2007年5月21日，注册编号为：EPN Gbg dnr 239/07。所有CLL患者均根据最新修订的诊断标准8进行确诊，并在确诊时采集样本。本研究中的患者均来自瑞典西部不同血液科，在获得书面知情同意后纳入研究。本研究仅选取外周血单个核细胞（PBMC）样本中白血病细胞肿瘤比例≥70%的慢性淋巴细胞白血病病例。
1. 准备工作
- 使用商业分离试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书从慢性淋巴细胞白血病（CLL）及正常健康外周血样本中分离PBMCs，用于DNA提取。
- 对1.5 mL离心管进行高压灭菌。解冻甲基化DNA结合试剂盒中的所有试剂（参见材料表）。
- 使用无DNase的水，将试剂盒提供的5倍浓缩洗涤缓冲液稀释，配制10 mL的1倍珠洗缓冲液，用于洗涤磁珠并稀释试剂盒提供的MBD蛋白。
- 预先准备或获取以下试剂：3 M乙酸钠、无水乙醇和70%乙醇，用于DNA沉淀（材料表）。
2. 基因组DNA提取与超声处理
- 根据制造商的说明书，使用市售的DNA提取试剂盒（材料表）从患者和正常P....
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结果
最近对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者及其匹配的正常健康对照样本进行了MBD-seq分析，以鉴定CLL特异性的差异高甲基化和低甲基化基因7。用于分析CLL和正常健康样本数据的实验与生物信息学流程如图1A和1B所示。这些分析鉴定出多个CLL特异性的差异甲基化区域（cllDMRs），这些区域在IGHV突变型和IGHV未突变型样本中相较于对照样本显著呈现高/低甲基化状态，p值<0.00001。图2A展示了来自正常B细胞和正常PBMC比较所得的所有cllDMRs。所有cllDMRs均被定位至不同类别的蛋白编码基因和非编码基因，如图2B所示。重要的是，在本分析中，CLL患者样本分别与两种不同的正常对照（分选的B细胞和PBMCs）独立进行比较。有趣的是，当与正常B细胞对照和正常PBMC对照样本比较时，分析结果显示大量共.......
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讨论
MBD-seq 是一种基于免疫沉淀的经济高效的技术，可用于研究具有全基因组覆盖范围的甲基化模式。MeDIP-seq（甲基化DNA免疫沉淀后接测序）和 MBD-seq 均可实现富含 CpG 的甲基化 DNA 的富集。然而，与 MeDIP-seq 相比，MBD-seq 对富含 CpG 的区域具有更高的结合亲和力19。利用甲基结合富集试剂盒，可通过高盐和低盐缓冲液分别洗脱出高 CpG 富集和低 CpG 富集的 DNA 区域。在本研究中，仅进行单一分数洗脱，以捕获高度富集的 CpG 富集区域，覆盖大多数 CpG 岛。
MBD-seq 可作为 WGBS 的一种强大替代方法，后者常用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）及其他白血病研究。尽管与基于亚硫酸氢盐转化的方法相比，MBD-seq 需要相对更多的起始 DNA 量，但它能够特异性地检测仅与 5 mC 修饰相关的全基因组甲基化变化，且不会因转化后的 PCR 扩增而引入偏差。因此，MBD-seq 是研究 cllDMGs 的理想方法，这些基因可能是具有预后价值的潜在表观遗传学 CLL 标志基因。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞典研究理事会、瑞典癌症协会、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会（KAW）以及西约塔兰地区研发基金（FoU VästraGötalandsregionen）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNeasy 血液与组织试剂盒 | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep 溶液 | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE 缓冲液 pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor 标准超声破碎仪 | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX Bioruptor 管（1.5 mL） | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M 醋酸钠 | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase 安全成像仪组合试剂盒 | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% 琼脂糖凝胶 | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| MethylMiner 甲基化 DNA 富集试剂盒 | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake 管式振荡器/旋转器 | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| 涡旋混合器 | VWR | 12620-848 | |
| 绝对乙醇 | 任意公司 | ||
| 70% 乙醇 | 任意公司 | ||
| 无 DNA 酶水 | Milli Q | ||
| DNA 沉淀剂（3M 醋酸钠） | Diagenode | C03030002 | |
| 安全密封 1.5 mL Eppendorf 管 | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL 管 | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 平台 | Illumina | ||
| 水浴锅 | Grant | ||
| 加热块 | grant | ||
| 管式旋转器 | Labquake |
参考文献
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al.
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