在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析

Summary

该工作描述了优化的甲基CpG结合结构域（MBD）测序方案和用于鉴定慢性淋巴细胞性白血病（CLL）患者中差异甲基化CpG富集区的计算管道。

Abstract

长期非编码RNA（lncRNA）在癌症中的作用已经走在前列，因为在癌症发展和进展期间越来越需要了解其机械功能。尽管如此，在癌症中lncRNA和重复序列的全球表观遗传调控尚未得到很好的研究，特别是在慢性淋巴细胞性白血病（CLL）中。本研究着重于一种独特的方法:使用甲基结合结构域（MBD）蛋白进行基于免疫沉淀的双链甲基化DNA片段捕获，随后进行下一代测序（MBD-seq）。本研究使用属于两个预后亚组（5个IGVH突变样本+ 5个IGVH未突变样本）的CLL患者样本。与正常健康对照相比，分析显示5,800个高甲基化和12,570个低甲基化的CLL特异性差异甲基化基因（cllDMG）。重要的是，这些结果确定了几种CLL特异性差异甲基化的lncRNA具有潜在预后价值的蛋白质编码基因。该工作概述了MBD-seq和生物信息学管道的详细协议，用于使用CLL患者样本全面分析高CpG丰富地区的全球甲基化谱。最后，使用焦磷酸测序验证蛋白质编码基因和lncRNA，这是一种高度定量的方法来分析CpG甲基化水平，以进一步证实MBD-seq方案的发现。

Introduction

近年来，使用下一代测序技术分析全球DNA甲基化谱已越来越受欢迎。基于全基因组的甲基化测定，包括基于微阵列和非微阵列的方法，基于以下方法开发:基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，甲基化敏感的限制酶消化和甲基化DNA的免疫沉淀，使用甲基CpG特异性抗体。

异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤的标志之一，包括慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。早些时候，包括我们在内的几个组织表征不同CLL预后亚组和正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱，使用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，然后是基于微阵列的方法或全基因组测序^{1,2,3 ， 4。基因组DNA的亚硫酸氢盐转化导致未修饰的胞嘧啶脱氨酸尿嘧啶，留下基因组中修饰的甲基化胞嘧啶。一旦转化，DNA的甲基化状态可以通过PCR扩增和使用不同的定量或定性方法如基于微阵列或全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）的测序来测定。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有许多优点，并且广泛用于不同的癌症类型以分析DNA甲基化水平，但与该技术相关的一些缺点是。 WGBS测序允许单碱基对分辨率较低的DNA，是分析大量样品的最佳选择。然而，这种方法不能区分基因组中5mC和5mmC水平之间的修饰。此外，基于微阵列的方法不提供完整的c基因组超量。}

在我们实验室⁷最近的一项研究中，基于免疫沉淀....

Protocol

收集CLL样本的道德准许是2007-05-21，具有以下注册号:EPN Gbg dnr 239/07。所有CLL患者根据最近修订的标准⁸诊断，并在诊断时收集样品。在获得书面同意后，研究中的患者被纳入瑞典西部不同血液学部门。本研究仅选择了白血病细胞百分率≥70％的CLL外周血单个核细胞（PBMC）样本。

准备工作

1. 根据制造商的说明书，使用商业分离试剂盒（参见材料表 ），从CLL和正常的健康外周血样品中分离PBMC进行DNA提取。
2. 高压灭菌1.5 mL管。解冻甲基化DNA结合试剂盒中的所有试剂（参见材料表 ）/ LI>
3. 使用无DNA酶的水从试剂盒提供的5x储备洗涤缓冲液中制备10 mL 1x珠洗涤缓冲液以洗涤珠粒并稀释试剂盒提供的MBD蛋白质。
4. 事先获得或准备以下物品:3M乙酸钠，无水乙醇和70％乙醇用于DNA沉淀（ 材料表 ）。

2.基因组DNA提取和超声处理

1. 使用市售的DNA提取试剂盒（ 材料表 ）根据制造商的方案从患者和正常PBMC样品中分离基因组DNA。使用分光光度计在260nm定量基因组DNA。
   注:DNA提取柱容量为5-6万个细....

Results

最近对CLL患者和匹配的正常健康对照进行了MBD-seq，以鉴定CLL特异性差异超低和低甲基化基因⁷ 。用于分析CLL和正常健康样品产生的数据的实验和生物信息管道如图1A和1B所示 。这些分析确定了几个CLL特异性差异甲基化区域（cllDMR），与对照样品相比，IGHV突变和IGHV未突变样品显着高/低甲基化，p值<0.00001。 图2A显示从正常B细胞​​和正常PMBC比较两者获得的所有clDDMR。所有的cllDMR被映射到不同类型的蛋白质编码和非编码基因， 如图2B所示 。重要的是，在这个分析中，比较是比较的在CLL患者样本之间，两个不同的正常对照，B细胞和PMBCs分选。有趣的是，与正常的B细胞对照和正常的PBMC对照样品相比，分析导致常见的CLL特异性差异甲基化基因（cllDMG; 851高甲基化.......

Discussion

MBD-seq是一种经济有效的基于免疫沉淀的技术，可用于研究具有完整全基因组范围覆盖的甲基化模式。 MeDIP seq（甲基化DNA免疫沉淀随后测序）和MBD-seq均导致富含CpG的甲基化DNA的富集。然而，与MeDIP seq ¹⁹相比，MBD-seq对结合高度富含CpG的区域具有更强的亲和力。使用甲基结合富集试剂盒，可以分别通过高盐和低盐缓冲液洗脱DNA将DNA分馏成高CpG和低CpG富集区。在该研究中，仅进行单次洗脱以捕获覆盖大多数CpG岛的富含富含CpG的区域。

MBD-seq可以是WGBS的强大替代品，它通常用于CLL和其他白血病调查。尽管与亚硫酸氢盐相比，MBD-seq需要相对较高量的输入DNA基于转换的方法，它允许调查仅针对5mC修饰的特异性的全局甲基化变化，而没有在转化后产生任何PCR扩增偏倚。因此，MBD-seq是解决cllDMG的理想方法，其可能是具有预后价值的潜在的基于表观遗传学的CLL特征基因。

执行该方法的关键因素是在结合反应之前使用的片段DNA的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy 血液和组织试剂盒	Qaigen	69504
淋巴制备溶液	A X I S-S H I E L D
纳米滴 2000	Thermo Fischersceintific
TE 缓冲液 pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor 标准超声处理装置	Diagenode	UCD-200
TPX Bioruptor 管 1.5mL	Diagenode	C30010010-300
3 M 乙酸钠	Diagenode	C03030002
E-gel iBase 安全成像仪组合试剂盒	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% 琼脂糖凝胶	Thermo Fischersceintific	G441002
甲基化 DNA 富集试剂盒	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake 管振荡器/旋转器	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
涡旋混合器	VWR	12620-848
无水	任何公司
70% 乙醇	任何公司
不含 DNAse 的水	Milli Q
DNA 沉淀剂（3M 乙酸钠）	二分节点	C03030002
安全密封 1.5 mL eppendorf 管	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5 mL 管	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 平台	Illumina
Water Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake