使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

摘要

CRISPR相关蛋白Cpf1可通过特别设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，在特定位置切割双链DNA，产生黏性末端。基于这一特性，建立了一种DNA组装标准（C-Brick），本文详细描述了其使用方案。

摘要

CRISPR 相关蛋白 Cpf1 在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链 DNA，产生黏性末端。由于这一特性，Cpf1 已被用于建立一种名为 C-Brick 的 DNA 组装标准，该标准具有识别位点长、疤痕序列短的优点。在标准的 C-Brick 载体上，生物 DNA 片段两侧包含四个 Cpf1 识别位点——前缀区（T1 和 T2 位点）和后缀区（T3 和 T4 位点）。T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，从而实现带有 T2 和 T3 位点的 DNA 片段的组装。同时，在片段连接后会在中间生成一个短的 "GGATCC" 疤痕序列。由于新形成的质粒仍包含四个 Cpf1 切割位点，因此该方法支持 DNA 片段的迭代组装，类似于 BioBrick 和 BglBrick 标准。本文描述了使用 C-Brick 标准组装 DNA 片段的操作流程。C-Brick 标准可被科研人员、研究生、本科生乃至业余爱好者广泛使用。

引言

DNA生物元件的标准化对于合成生物学的发展至关重要¹DNA组装方法的开发可替代 特设的 实验设计，并减少在将遗传元件组装成更大系统过程中出现的许多意外结果。BioBrick 标准（BBF RFC 10）是最早提出的 DNA 组装标准之一。该标准使用前缀序列（包含 EcoRI 和 XbaI 酶切位点）和后缀序列（包含 SpeI 和 PstI 酶切位点）^2,3由于 XbaI 和 SpeI 具有互补的黏性末端，因此用 XbaI 和 SpeI 切割的 BioBrick DNA 片段可以连接在一起，形成新的 BioBrick，用于进一步的迭代组装。

在使用 BioBrick 标准时已发现一些缺陷⁴。例如，它会在 DNA 片段之间产生一个 8 bp 的“疤痕”序列，从而无法构建融合蛋白。此外，必须从 DNA 片段中去除上述四种 6 bp 限制性酶切位点，这非常不便。BglBrick 标准的建立旨在解决第一个问题⁵。它产生一个 6 bp 的 "GGATCT" 疤痕序列，编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），从而实现多个蛋白或蛋白结构域的融合。iBrick 则是为解决第二个问题而开发的

方案

1. crRNA 的制备

1. crRNA模板的制备
   1. 将各个寡核苷酸（表1）用无RNase的水重悬，配制成10 µM的浓度。
   2. 在0.2 mL的PCR管中加入22.5 µL的上链寡核苷酸（表1中的T7-F）、22.5 µL的下链寡核苷酸（表1）以及5 µL的10×退火缓冲液，总体积应为50 µL。
      注：在表1中列出了六种不同的下链寡核苷酸，每种均应与上链T7-F单独配对使用。表1中的小写字母代表将被转录为crRNA引导序列的序列。可使用10×Taq PCR缓冲液替代10×退火缓冲液。
   3. 将PCR管放入热循环仪中。
   4. 运行退火程序：95 °C初始变性5分钟，随后以每分钟降低1 °C的速率从95 °C降温至20 °C。
      注：退火完成后应立即用于步骤1.2.1。
2. crRNA的转录与纯化
   1. 在1.5 mL微量离心管中加入38 µL无RNase的水、8 µL步骤1.1.4中的模板、20 µL的5×T7转录缓冲液、20 µL的NTP混合物（10 µM）、4 µL的重组RNase抑制剂（RRI）以及10 µL的....

结果

本方案展示了三种色素蛋白表达盒（cjBlue (BBa_K592011)、eforRed (BBa_K592012) 和 amilGFP (BBa_K592010)）的构建。首先，将上述三个基因的编码序列及其终止子分别克隆至C-Brick标准载体中。通过PCR扩增将短DNA元件（启动子和终止子）引入C-Brick载体，所用引物在5'端含有相应的短DNA元件序列，随后采用自连法完成连接。三种编码色素蛋白的序列首先被克隆 从头合成 合成后通过无缝克隆技术插入C-Brick标准载体中。引物信息见先前研究⁴.

随后，cjBlue、eforRed 和 amilGFP 序列按照图中所示相同步骤，与终止子和启动子序列进行连接。 图2正确的质粒构建体被转化至 E. coli，呈现出绚丽的色彩（

讨论

本方案描述了C-Brick DNA组装标准的操作流程。该方案中最关键的步骤是C-Brick标准载体的线性化；若载体未完全酶切，将严重影响实验成功率。此外，尽管Cpf1主要在"18-23"的切割模式下切割目标DNA序列，但也有研究检测到其在临近两个碱基处发生不精确切割⁴，这可能导致DNA组装后产生少量突变。因此，需要通过Sanger测序验证组装产物的正确性。

C-Brick 组装的效率低于先前研究中描述的传统限制性内切酶和连接方法⁴。影响组装效率的主要原因可能是 Cpf1 的切割特性不够精确。未来，提高切割准确性将对标准化具有重要意义，目前相关改进工作正在探索中。

C-Brick 与 BglBrick 和 BioBrick 标准也具有部分兼容性。例如，BglBrick 部件可用 BglII 和 BamHI 切割，然后插入 C-Brick 标准载体的 BamHI 位点，从而生成一个 C-Brick 部件。然而，应验证 B.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
商业寡核苷酸	Sangon Biotech
10x Taq PCR 缓冲液	Transgen	#J40928
超纯蒸馏水	Invitrogen	10977-015
5x RNA 转录缓冲液	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA 聚合酶	Thermo Scientific	#EP0111
NTP 混合物	Sangon	#ND0056
RRI（重组 RNase 抑制剂）	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis 分光光度计	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max 缓冲液	Vazyme	PB505	PCR 缓冲液
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶	Vazyme	P505-d1
Ezmax 一步法克隆试剂	Tolobio	24303-1	无缝连接试剂盒
Ezmax 一步法克隆 5x 缓冲液	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart 缓冲液	NEB	B7204S
10x T4 DNA 连接酶缓冲液	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA 连接酶	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统	Promega	A9282
质粒小提试剂盒 I	Omega	D6943-02	质粒制备试剂盒
热敏感碱性磷酸酶	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 缓冲液	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
PCR 仪	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick 标准载体	Tolobio	98101
大肠杆菌 [DH10B]	Invitrogen	18297010
LB 培养基（胰蛋白胨）	Oxoid	LP0042
LB 培养基（酵母提取物）	Oxoid	LP0021
LB 培养基（NaCl）	Sangon Biotech	B126BA0007