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方法文章

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

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DOI：

10.3791/55775

⸱

2017年6月15日

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

CRISPR相关蛋白Cpf1可通过特别设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，在特定位置切割双链DNA，产生黏性末端。基于这一特性，建立了一种DNA组装标准（C-Brick），本文详细描述了其使用方案。

摘要

CRISPR 相关蛋白 Cpf1 在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链 DNA，产生黏性末端。由于这一特性，Cpf1 已被用于建立一种名为 C-Brick 的 DNA 组装标准，该标准具有识别位点长、疤痕序列短的优点。在标准的 C-Brick 载体上，生物 DNA 片段两侧包含四个 Cpf1 识别位点——前缀区（T1 和 T2 位点）和后缀区（T3 和 T4 位点）。T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，从而实现带有 T2 和 T3 位点的 DNA 片段的组装。同时，在片段连接后会在中间生成一个短的 "GGATCC" 疤痕序列。由于新形成的质粒仍包含四个 Cpf1 切割位点，因此该方法支持 DNA 片段的迭代组装，类似于 BioBrick 和 BglBrick 标准。本文描述了使用 C-Brick 标准组装 DNA 片段的操作流程。C-Brick 标准可被科研人员、研究生、本科生乃至业余爱好者广泛使用。

引言

DNA生物元件的标准化对于合成生物学的发展至关重要1DNA组装方法的开发可替代 特设的 实验设计，并减少在将遗传元件组装成更大系统过程中出现的许多意外结果。BioBrick 标准（BBF RFC 10）是最早提出的 DNA 组装标准之一。该标准使用前缀序列（包含 EcoRI 和 XbaI 酶切位点）和后缀序列（包含 SpeI 和 PstI 酶切位点）2,3由于 XbaI 和 SpeI 具有互补的黏性末端，因此用 XbaI 和 SpeI 切割的 BioBrick DNA 片段可以连接在一起，形成新的 BioBrick，用于进一步的迭代组装。

在使用 BioBrick 标准时已发现一些缺陷4。例如，它会在 DNA 片段之间产生一个 8 bp 的“疤痕”序列，从而无法构建融合蛋白。此外，必须从 DNA 片段中去除上述四种 6 bp 限制性酶切位点，这非常不便。BglBrick 标准的建立旨在解决第一个问题5。它产生一个 6 bp 的 "GGATCT" 疤痕序列，编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），从而实现多个蛋白或蛋白结构域的融合。iBrick 则是为解决第二个问题而开发的6。它利用识别长DNA序列的归巢内切酶（homing endonucleases, HEs）。由于HE的识别位点在天然DNA序列中极为罕见，因此iBrick标准可直接用于构建iBrick元件，而无需修改其DNA序列。然而，iBrick标准在DNA片段之间会留下21 bp的疤痕序列，这可能是其未被广泛采用的原因。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统发展迅速7,8。在CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）中，源自Streptococcus pyogenes的Cas9核酸内切酶目前已得到广泛应用，其主要引起具有平末端的双链DNA断裂（DSBs）9。

2015年，Zhang 及其同事首次对 Cpf1（来自 Prevotella 和 Francisella 1 的 CRISPR）进行了表征。Cpf1 属于第2类 V 型 CRISPR-Cas 系统，是一种由 CRISPR RNA（crRNA）引导的内切核酸酶10。与 Cas9 不同，Cpf1 引发的双链断裂（DSB）具有 4 或 5 个核苷酸的 5' 突出末端10。基于这一特性，研究人员开发了一种 DNA 组装标准——C-Brick4。在 C-Brick 标准载体上，生物元件两侧分别被预置的 T1/T2 和后置的 T3/T4 四个 Cpf1 靶位点所包围，这与 BioBrick 标准类似。由于 T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，因此可在组装 DNA 元件的同时，在元件之间生成一个 "GGATCC" 的短序列“疤痕”。值得注意的是，C-Brick 标准具有两个主要优势：识别较长的靶序列以及留下较短的疤痕序列。C-Brick 产生的 6 bp "GGATCC" 疤痕编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），可用于构建融合蛋白。此外，C-Brick 标准还与 BglBrick 和 BioBrick 标准部分兼容。

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方案

1. crRNA 的制备

  1. crRNA模板的制备
    1. 将各个寡核苷酸（表1）用无RNase的水重悬，配制成10 µM的浓度。
    2. 在0.2 mL的PCR管中加入22.5 µL的上链寡核苷酸（表1中的T7-F）、22.5 µL的下链寡核苷酸（表1）以及5 µL的10×退火缓冲液，总体积应为50 µL。
      注：在表1中列出了六种不同的下链寡核苷酸，每种均应与上链T7-F单独配对使用。表1中的小写字母代表将被转录为crRNA引导序列的序列。可使用10×Taq PCR缓冲液替代10×退火缓冲液。
    3. 将PCR管放入热循环仪中。
    4. 运行退火程序：95 °C初始变性5分钟，随后以每分钟降低1 °C的速率从95 °C降温至20 °C。
      注：退火完成后应立即用于步骤1.2.1。
  2. crRNA的转录与纯化
    1. 在1.5 mL微量离心管中加入38 µL无RNase的水、8 µL步骤1.1.4中的模板、20 µL的5×T7转录缓冲液、20 µL的NTP混合物（10 µM）、4 µL的重组RNase抑制剂（RRI）以及10 µL的T7 RNA聚合酶，总体积应为100 µL。
    2. 将微量离心管置于37 °C水浴中过夜（约16小时）。
    3. 使用RNA纯化与浓缩试剂盒对转录产物进行纯化，操作步骤遵循制造商的说明书。
    4. 使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量，并将RNA稀释至10 µM的浓度。样品应立即使用或储存于-80 °C。
      注：crRNA序列列于表2中。

2. C-Brick 片段的构建（即 将生物片段插入 C-Brick 标准载体）

注意：此步骤包含三个子步骤。对于较短的生物元件（例如启动子和终止子），最好采用直接PCR方法将生物元件插入C-Brick标准载体4。完整载体序列见补充数据，前缀和后缀序列见图1（如下步骤2.1）。对于可通过PCR轻松获得的生物元件（例如以基因组DNA、质粒或从头合成的DNA序列为模板），最好采用无缝克隆方法将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.2）。对于来源于BioBrick和BglBrick标准的元件，可使用限制性内切酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接方法，将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.3）。

  1. 通过直接PCR扩增构建
    1. 设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。
      注意：寡核苷酸的5'-端包含目标DNA片段的序列，而3'-端包含载体序列（即，正向链3'-端为"GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG"，反向链为"GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG"）。寡核苷酸5'-端可设计为无突出端或约20 bp的突出端。具体示例可参见先前的研究4。
    2. 将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。
    3. 在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.1.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL C-Brick标准载体（50 ng）作为模板，以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。
    4. 将PCR管直接放入热循环仪中并启动程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。
    5. 热循环程序：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s、72 °C延伸2 min；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。
    6. 取步骤2.1.4中的混合物9 µL加入1.5 mL微量离心管中。
    7. 加入1 µL DpnI，于37 °C水浴中孵育1 h。
      注意：若引物无重叠序列，则需额外加入0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和0.5 µL T4 DNA连接酶，并于22 °C水浴中孵育1 h。若引物含有约20 nt的重叠序列，则可将DpnI处理后的产物直接转化至E. coli（DH10B）感受态细胞中（步骤2.4）。线性PCR产物将在宿主细胞的重组系统作用下环化。
    8. 样品可立即使用，或于-20 °C保存。
  2. 通过无缝连接构建
    1. 设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。
      注意：寡核苷酸的3'-端包含目标DNA片段的末端序列，5'-端则包含线性化C-Brick标准载体的末端序列（即，正向链5'-端为"CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC"，反向链5'-端为"CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC"）。具体示例可参见先前的研究4。
    2. 将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。
    3. 在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.2.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL模板（20–500 ng）以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。
    4. 将PCR管直接放入热循环仪中并运行程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。
      注意：热循环程序设置为：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s（根据引物的退火温度调整）、72 °C延伸1 min（根据生物元件长度调整）；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。
    5. 使用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。
    6. 用BamHI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液和1 µL BamHI。于37 °C水浴中孵育最多2 h。
    7. 使用凝胶纯化试剂盒对上述产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。
    8. 在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.2.7所得的线性化载体2 µL（50 ng）、步骤2.2.4所得的片段5 µL（200 ng）、5x无缝连接缓冲液2 µL，以及无缝连接试剂盒中的无缝连接酶1 µL。确保总体积为10 µL。
    9. 将反应体系置于37 °C水浴中孵育30 min。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。
  3. 通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接构建。
    注意：对于来源于BioBrick标准（步骤2.3.4–2.3.7）和BglBrick标准（步骤2.3.1–2.3.3）的元件，可通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接，将生物元件插入C-Brick标准载体中。
    1. 用BamHI和BglII酶切BglBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液3、0.5 µL BamHI和0.5 µL BglII。于37 °C水浴中孵育2 h。
    2. 进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒回收目标片段。
    3. 将片段与C-Brick标准载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.1.12所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.3所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。
    4. 用XbaI和SpeI酶切BioBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。
    5. 用XbaI和SpeI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。
    6. 进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒分别回收步骤2.3.4中的片段和步骤2.3.5中的线性化载体；操作遵循制造商说明书。
    7. 将片段与C-Brick载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.3.5所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.4所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。
  4. 取步骤2.1.8、2.2.9、2.3.3或2.3.7所得产物各10 µL，用于化学转化E. coli（DH10B）感受态细胞。
  5. 挑取数个克隆接种至5 mL液体LB培养基中，于37 °C摇床（220 rpm）中过夜培养。
  6. 使用质粒提取试剂盒提取质粒；操作遵循制造商说明书。
  7. 通过Sanger测序鉴定正确克隆11。

3. C-Brick 组装（图 2）

  1. C-Brick 载体的 Cpf1 消化
    1. 向一个1.5 mL微量离心管中加入22.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、10 µL步骤2.6的质粒（1 µg）、0.5 µL RRI和1 µL Cpf1（5 µM）。
      注意：Cpf1 可从商业渠道购买，或根据先前研究中的方案进行纯化4.
    2. 为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T2（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟。 A加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和Cpf1（5 µM），继续孵育30分钟。
      注意：或者，若要将外源DNA片段插入T3和T4位点，可加入1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟；再加入1 µL crRNA-T4（10 µM），继续孵育30分钟。
    3. 加入1 µL热敏碱性磷酸酶，将试管置于37 °C水浴中再孵育1小时。
    4. 进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶回收试剂盒纯化载体。样品可立即使用，或于 -20 °C 冻存备用。
  2. Cpf1 对 DNA 片段的消化
    1. 向一个1.5 mL微量离心管中加入21.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、步骤2.6中的质粒10 µL（2 µg）、0.5 µL RRI和2 µL Cpf1（5 µM）。
    2. 为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。
      注意：也可加入1 µL crRNA-T2（10 µM）和1 µL crRNA-T4（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。
    3. 进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化片段。样品可立即使用，或冷冻后于 -20 °C 保存。
  3. C-Brick 连接组装及进一步验证
    1. 将外源DNA片段与C-Brick载体连接：取2 µL第3.1.4步中线性化的载体（50 ng）和6 µL第3.2.3步中的DNA片段（200 ng），加入1.5 mL微量离心管中。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或于-20 °C冻存备用。
    2. 加入10 µL连接产物（步骤3.3.1）用于化学转化 E. coli (DH10B) 感受态细胞
    3. 将多个克隆加入5 mL液体LB培养基中，置于摇床于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
    4. 使用质粒提取试剂盒提取质粒；按照生产商提供的说明书操作。
    5. 通过Sanger测序鉴定正确克隆11.
  4. 进行新一轮的C-Brick组装。第3.3.4步中筛选出的正确克隆可作为新的C-Brick载体或DNA片段，按照3.1–3.3步骤的相同方案进行后续迭代的C-Brick组装。
    注意：T2' 和 T3' 位点是作为 T2 和 T3 位点的备用设计图1a对于从步骤 2.3.7 获得的质粒，仅可使用 T2' 和 T3' 进行 C-Brick 标准组装。

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结果

本方案展示了三种色素蛋白表达盒（cjBlue (BBa_K592011)、eforRed (BBa_K592012) 和 amilGFP (BBa_K592010)）的构建。首先，将上述三个基因的编码序列及其终止子分别克隆至C-Brick标准载体中。通过PCR扩增将短DNA元件（启动子和终止子）引入C-Brick载体，所用引物在5'端含有相应的短DNA元件序列，随后采用自连法完成连接。三种编码色素蛋白的序列首先被克隆 从头合成 合成后通过无缝克隆技术插入C-Brick标准载体中。引物信息见先前研究4.

随后，cjBlue、eforRed 和 amilGFP 序列按照图中所示相同步骤，与终止子和启动子序列进行连接。 图2正确的质粒构建体被转化至 E. coli，呈现出绚丽的色彩（

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讨论

本方案描述了C-Brick DNA组装标准的操作流程。该方案中最关键的步骤是C-Brick标准载体的线性化；若载体未完全酶切，将严重影响实验成功率。此外，尽管Cpf1主要在"18-23"的切割模式下切割目标DNA序列，但也有研究检测到其在临近两个碱基处发生不精确切割4，这可能导致DNA组装后产生少量突变。因此，需要通过Sanger测序验证组装产物的正确性。

C-Brick 组装的效率低于先前研究中描述的传统限制性内切酶和连接方法4。影响组装效率的主要原因可能是 Cpf1 的切割特性不够精确。未来，提高切割准确性将对标准化具有重要意义，目前相关改进工作正在探索中。

C-Brick 与 BglBrick 和 BioBrick 标准也具有部分兼容性。例如，BglBrick 部件可用 BglII 和 BamHI 切割，然后插入 C-Brick 标准载体的 BamHI 位点，从而生成一个 C-Brick 部件。然而，应验证 B...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢上海兆维生物技术有限公司在C-Brick标准开发过程中提供的技术协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号：XDB19040200）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
商业寡核苷酸Sangon Biotech
10x Taq PCR 缓冲液Transgen#J40928
超纯蒸馏水Invitrogen10977-015
5x RNA 转录缓冲液Thermo ScientificK0441
T7 RNA 聚合酶Thermo Scientific#EP0111
NTP 混合物Sangon#ND0056
RRI（重组 RNase 抑制剂）Takara2313A
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015
UV-Vis 分光光度计Thermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max 缓冲液VazymePB505PCR 缓冲液
dNTPsTransgenAD101
Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶VazymeP505-d1
Ezmax 一步法克隆试剂Tolobio24303-1无缝连接试剂盒
Ezmax 一步法克隆 5x 缓冲液Tolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglII NEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x Buffer 3NEB#B7003S
10x CutSmart 缓冲液NEBB7204S
10x T4 DNA 连接酶缓冲液Tolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA 连接酶Tolobio32210
DpnINEB#R01762
SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统PromegaA9282
质粒小提试剂盒 IOmegaD6943-02质粒制备试剂盒
热敏感碱性磷酸酶 Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 缓冲液Tolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
PCR 仪Applied Biosystemsveriti 96 well
C-Brick 标准载体Tolobio98101
大肠杆菌 [DH10B]Invitrogen18297010
LB 培养基（胰蛋白胨）OxoidLP0042
LB 培养基（酵母提取物）OxoidLP0021
LB 培养基（NaCl）Sangon BiotechB126BA0007

参考文献

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