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用于临床应用的人尿中3-硝基酪氨酸的微型固相萃取与液相色谱-串联质谱检测整合方法

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DOI：

10.3791/55778

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2017年7月14日

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

本文内容

摘要

建立了一种高通量的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），该方法选择性强、灵敏度高，并结合高效的混合模式阳离子交换（MCX）96孔微孔板固相萃取技术，用于测定人尿液中游离的3-硝基酪氨酸（3-NT），适用于临床应用。

摘要

游离的3-硝基酪氨酸（3-NT）已被广泛用作氧化应激的潜在生物标志物。已有报道显示，在多种病理状态下，3-NT的水平均有所升高。然而，现有的检测方法在灵敏度和/或特异性方面尚不足以可靠地测定体内较低水平的3-NT，且操作繁琐，难以满足临床应用的需求。因此，亟需改进分析方法，以准确量化3-NT水平，并验证其在病理状态中的作用。本实验方案介绍了一种新型的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测方法，并结合微型固相萃取（SPE）技术，用于快速、准确地测定人尿液中的3-NT，作为氧化应激的无创生物标志物。采用96孔板进行固相萃取，显著简化了操作流程，将样品净化与目标物富集步骤合二为一，无需繁琐的衍生化和溶剂蒸发步骤，减少了溶剂消耗、废液处理、污染风险以及整体处理时间。使用pH 9条件下25 mM的乙酸铵（NH4OAc）作为SPE洗脱液，显著提高了方法的选择性。通过优化多反应监测（MRM）的跃迁参数，进一步增强了质谱信号响应。在五氟苯基（PFP）色谱柱（150 mm × 2.1 mm，3 µm）上添加0.01%甲酸（HCOOH）作为流动相添加剂，使信号响应额外提升了2.5倍，并将总运行时间缩短至7分钟。该方法的定量下限（LLOQ）达到10 pg/mL（0.044 nM），相较于已报道的检测方法，灵敏度显著提高。这一简化、快速、高选择性和高灵敏度的方法可在24小时内完成两板尿液样本（n = 192）的处理。鉴于其显著提升的分析性能，以及尿液采样无创、成本低廉的优势，该检测方法适用于临床前和临床研究。

引言

近年来，氧化应激对临床表现的影响已被推至研究前沿1. 目前正在探索的生物标志物之一是3-硝基酪氨酸（3-NT），它是活性氮物种（RNS）与酪氨酸（一种儿茶酚胺类神经递质前体）相互作用后生成的稳定终产物。尽管3-NT作为RNS的生物标志物可能具有临床价值 体内 酪氨酸性质与功能的显著改变可能对相应蛋白质及细胞功能产生不利影响1,2新兴研究表明，3-硝基酪氨酸（3-NT）可能在炎症性疾病中发挥重要作用3神经退行性疾病4,5心血管疾病6 和糖尿病7 以及与氧化应激相关的各种状况。然而，这些观察结果基于缺乏灵敏度和/或选择性的方法学所得出的数据8,9,10,11文献中先前报道的生物样本中3-NT浓度范围极大，表明这些检测方法存在严重的分析问题，亟需技术改进，以准确定量3-NT水平并验证其在这些疾病病理过程中的作用。

在生物基质中对游离3-硝基酪氨酸（3-NT）进行定量分析对实验人员和仪器提出了特殊挑战8,9,10,11。首先，内源性3-NT含量极低，要求检测方法具有超高的灵敏度；其次，存在大量结构相似的类似物，尤其是酪氨酸，其浓度远高于3-NT，因此需要具备高度的选择性；第三，在样品制备过程中，普遍存在的硝酸盐和亚硝酸盐可能导致酪氨酸发生硝化反应而人为生成3-NT，从而造成3-NT水平的假性高估，这一点必须予以特别考虑。

在多种用于检测3-NT的方法中，由于其卓越的灵敏度和选择性，串联质谱法（MS/MS）被认为是金标准方法11,12,13,14。气相色谱法（GC）联用串联质谱虽具有最佳的灵敏度，但其必需的样品衍生化步骤过于繁琐且耗时，难以满足临床应用的效率需求15,16。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）无需复杂的样品衍生化，因而更具应用前景。然而，仍存在若干挑战需要克服：文献报道的LC-MS/MS方法在检测低丰度3-NT时灵敏度仍需提高7,17,18，同时其相对较长的分析周期也需缩短，以满足高通量应用的需求12,13,17,19。

此外，在考虑临床应用时，所使用的生物基质具有重要作用。该基质应易于获取、成本低廉，并尽可能无创20,21,22。血浆是文献中传统上使用的样本，但并非临床上理想的基质，因此研究人员寻求一种利用尿液的方法，因为尿液具有无创性和成本效益。

已有若干研究尝试使用尿液开发可靠且特异的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法9,10,11。然而，这些方法在选择性、可靠性或效率方面均未能达到临床应用的要求。传统反相固相萃取柱（C18型）作为3-硝基酪氨酸（3-NT）分析样品前处理手段的主流方法，其有效性受到质疑，已有研究提出采用强阳离子交换（SCX）与反相C18-OH串联固相萃取的策略6,7,19。一种近期开发的LC-MS/MS方法采用了多步纯化流程，包括手动C18固相萃取、制备型高效液相色谱（HPLC）以及在线固相萃取，用于3-NT的分析23。尽管该方法具有足够的临床检测灵敏度（定量下限LLOQ为0.041 nM），但其前处理过程复杂且繁琐，并需使用3 mL尿液，限制了其在高通量检测中的可行性。有研究采用分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂以提高前处理效率14，但所得定量下限（0.7 µg/mL）仍不足以满足临床样本的检测需求。另一种方法为实现0.022 nM的检测限（LOD），需采用二维（2D）LC-MS/MS结合免疫亲和色谱进行样品前处理24。尽管上述方法在3-NT检测方面均取得了一定进展，但尚无一种方法同时具备临床应用所需的灵敏度、可靠性与高效性。

为了研究游离3-硝基酪氨酸（3-NT）的病理学意义及其在临床环境中作为氧化应激生物标志物的作用，我们开发了一种简单、高效、准确且精密的方法，适用于高通量的临床应用25。采用微型混合模式阳离子交换（MCX）96孔萃取微孔板，可在单次提取过程中实现样本的简便高效净化和3-NT的富集，避免了现有方法中需要衍生化、蒸发及二维液相色谱（2D-LC）等步骤所带来的局限性。在流动相中添加0.01%甲酸（HCOOH），可显著增强信号响应并缩短分析周期。通过使用温和的乙酸铵（NH4OAc）洗脱液选择性洗脱3-NT，并结合3-NT及其内标（IS）的多反应监测（MRM）离子对转换，进一步提高了方法的选择性。通过采用较少量的13C标记同位素内标进行定量，有效补偿了基质效应。随着该方法的建立，研究人员和临床医生将能够验证3-NT在多种临床疾病状态中的作用，并进一步探索氧化应激的影响。

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方案

所有涉及人类尿液样本的研究均按照Pharmasan/Neuroscience机构审查委员会（IRB）批准的程序进行。

1. 尿液样本采集与肌酐（Cr）测定

  1. 在约10小时过夜禁食后，收集次日晨尿样本5 mL，置于含有250 µL 3 N HCl作为防腐剂的5 mL转运管A中，于-20 °C保存至使用。
  2. 解冻并涡旋振荡5 mL转运尿液A管，然后在离心机中离心例如 Sorvall)（2297 × g，10 分钟）。
  3. 从5 mL转运管A中分装两次，每次1 mL尿液。
  4. 采用尿肌酐法测定 Cr26.

2. 标准品、内标（IS）和质控（QC）样品的制备

  1. 在含有0.01%甲酸的水溶液（流动相A，MA）中配制浓度为100 µg/mL的3-NT储备液，并于-20 °C保存。
  2. 使用甲醇酸（MA）将100 µg/mL的3-NT储备液稀释，配制浓度为100 ng/mL的3-NT工作标准溶液。
  3. 通过将100 ng/mL工作标准品用不含3-NT的0.15 M HCl酸化空白尿液稀释，制备浓度范围为5至2500 pg/mL的标准品溶液，同时包括空白样品和双空白样品。
  4. 配制内标储备液 13C9-3-NT 以 100 µg/mL 溶于水中，与 MA 混合后于 -20 °C 保存。
  5. 通过将 100 µg/mL 的溶液稀释，配制浓度为 500 pg/mL 的内标工作液 13C9-3-NT IS 储备液与 MA。
  6. 建立五个质量控制样本水平，涵盖定量下限、低、中、高浓度水平即，10、25、100、500 和 1,250 pg/mL），通过将3-NT工作标准品在酸化空白尿液中稀释制备。

3. 固相萃取步骤

  1. 解冻尿液样本、标准品和质控样品，并进行涡旋混匀。
  2. 将尿液样本、标准品和质控样品（各250 µL）加入洁净的2 mL 96孔收集板中的32 个孔中。
  3. 除双空白样品孔外，向其余每孔中加入500 pg/mL的内标工作溶液（50 µL）；向双空白样品孔中加入0.01% HCOOH （50 µL）。
  4. 加入含0.1% HCOOH的LC-MS/MS用水（250 µL）。
  5. 使用8通道移液器将上述混合物吹打混匀3次。
  6. 盖上板子，待进行固相萃取上样。
  7. 将MCX 96孔萃取板和收集储液槽置于正压处理器上。
  8. 通过向吸附剂中流过甲醇（MeOH，200 µL）对萃取板进行活化。
  9. 通过向吸附剂中流过含2% HCOOH的水（200 µL）进行平衡。
  10. 使用8通道移液器小心地将预混样品的全部体积加载到已预处理的萃取板中。
  11. 在正压处理器上设置较低的正压（e.g.，3 psi），使混合物缓慢流过吸附剂，必要时调节压力。
  12. 通过向吸附剂中流过含2% HCOOH的水（200 µL）清洗各孔。
  13. 通过向吸附剂中流过甲醇（200 µL）清洗各孔。
  14. 通过向吸附剂中流过水（200 µL）清洗各孔。
  15. 在正压处理器上使用较高的正压设置（e.g.，40 psi）将各孔完全吹干。
  16. 将储液槽更换为洁净的2 mL 96孔收集板。
  17. 加入pH 9的25 mM NH4OAc溶液（50 µL），以洗脱保留在萃取板上的分析物和内标。
  18. 加入含5% HCOOH的LC-MS用水（50 µL）以中和洗出液。
  19. 用8通道移液器吹打混匀3次，随后送至LC-MS/MS分析岗位进行分析。

4. 液相色谱-串联质谱分析

  1. 用量筒准确量取 2,000 mL 液相色谱-质谱用水，并转移至 2 L 瓶中。
  2. 用移液器吸取 200 µL 纯甲酸加入上述装有液相色谱-质谱用水的瓶子中。
  3. 充分混匀，并标记为流动相 A（MA），注明 initials、配制日期和有效期。
  4. 取一瓶 2 L 液相色谱-质谱级甲醇，标记为流动相 B（MB），并注明起始日期和有效期。
  5. 将自动进样器温度设置为 4 °C。
  6. 将装有已制备样品的收集板放入自动进样器中。
  7. 将一根 PFP 色谱柱（150 mm × 2.1 mm 内径，3 µm）及保护柱放入柱温箱中。
  8. 将柱温箱温度设置为 30 °C。
  9. 使用分析方法，按照 表 1 所示的液相梯度洗脱程序平衡系统 10 分钟。
时间（分钟）模块事件参数
0PumpsPump B Conc.5
0.5PumpsPump B Conc.20
1PumpsPump B Conc.50
3PumpsPump B Conc.80
4PumpsPump B Conc.90
4.01PumpsPump B Conc.95
5.5PumpsPump B Conc.95
5.6PumpsPump B Conc.5
7Controller停止

表1： 液相色谱梯度洗脱条件

  1. 创建包含标准品、质控品和尿液样本的批处理列表。
  2. 进样已制备的样品（12 µL），开始运行批处理。

5. 峰识别、积分与数据处理

  1. 使用软件控制数据的采集与处理。
  2. 对所有样品中的3-NT和内标（IS）峰进行识别与积分。
  3. 通过3-NT与内标峰面积比值对名义3-NT浓度进行线性回归（权重因子为1/x），建立用于3-NT定量的10–2,500 pg/mL标准曲线。
  4. 利用标准曲线对所有样品进行定量。
  5. 确定质控（QC）样品的检测结果是否落在既定范围内。
  6. 将尿液样品的检测浓度转换为最终结果，单位为nM或nmol/mmol Cr。

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结果

图1 表明在优化的液相色谱条件下，3-NT 在色谱上与其他结构相似的酪氨酸类似物完全分离，从而消除了这些大量存在的化合物可能引起的共洗脱干扰，进而提高了检测方法的选择性。此外，采用含 0.01% 甲酸的甲醇水溶液（MA）与甲醇进行梯度洗脱，流速为 0.45 mL/min，可实现 3-NT 的快速洗脱（即，3 分钟完成，周转时间为 7 分钟。

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图1： 标准溶液中3-硝基酪氨酸与其他酪氨酸类似物的基线液相色谱分离。 （A）p-酪氨酸；（B）m-酪氨...

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讨论

文献中先前报道的人类尿液样本中内源性游离3-硝基酪氨酸（3-NT）浓度存在显著差异，反映出当前可用检测方法存在的方法学问题8,9,10,11。准确测定人类尿液中低基础水平的3-NT仍是一项具有挑战性的任务，需要在样品制备和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析过程中采取特殊预防措施。本方案介绍了一种新型固相萃取（SPE）方法，并结合选择性LC-MS/MS检测，可实现对尿液中3-NT的特异性、高灵敏度及高通量测定。

精心选择 MRM 参数可提高对 3-NT 检测的选择性。用于血浆中 3-NT 内标物的 MRM 转换 m/z 236.0 >96.0 在尿液样本中引起严重污染27。采用 MRM 转换 m/z 236.0 >189.0 后，信号响应 cleaner，提高...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢 Scott Howard 和 Abigail Marinack 对本工作的总体支持与协调。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-硝基-L-酪氨酸SigmaN7389-5g
3-硝基-L-酪氨酸-13C9Sigma652296-5.0mg
质谱级金标尿液Golden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96孔µ洗脱板Waters186001830BA
2 mL 96孔收集板Phenomenex  AH0-7194
96孔正压处理器Waters 186005521
LC-MS 超纯 CHROMASOLV 甲醇  Sigma14262-2L
LC-MS 超纯 CHROMASOLV 水Sigma14263-2L
用于质谱的甲酸Sigma94318-50ML-F
氢氧化铵溶液Sigma338818-1L
Ultra PFP 丙基色谱柱Restek9179362
5500 三重四极杆质谱仪AB Sciex /请联系制造商获取更多详情
UFLC-XRShimadzu /请联系制造商获取更多详情
Integra 400 Plus Roche/尿肌酐 Jaffé Gen 2 方法
LCMS 认证 12 x 32 mm 螺口小瓶Waters600000751CV
LCGC 认证 12 x 32 mm 螺口全回收小瓶Waters186000384C
5 mL 转运管PhenixTT-3205
50 mL 离心管Crystalgen 23-2263
15 mL 离心管Crystalgen 23-2266
eLine 电子移液器Sartorius730391
微量离心机 Beckman CoulterA46474
OHAUS 天平  Kennedy Scales, inc.735
涡旋混合器 Bernstead ThermolyneM16715

参考文献

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