Method Article

微型固相萃取和LC-MS / MS检测人尿中3-硝基酪氨酸的临床应用

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

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开发了选择性和灵敏的液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）方法与混合模式阳离子交换（MCX）96孔微量培养板上的有效固相萃取相结合，用于测量游离的3-硝基酪氨酸（ 3-NT），具有高通量，适用于临床应用。

Abstract

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游离的3-硝基酪氨酸（3-NT）已广泛用作氧化应激的可能生物标志物。在各种病理状况下报道了3-NT的水平升高。然而，现有方法缺乏足够的灵敏度和/或特异性，可靠地测量3-NT的低内源水平，对于临床应用来说太麻烦了。因此，迫切需要进行分析改进，以准确量化3-NT的水平，并验证3-NT在病理状况中的作用。该方案介绍了新型液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）检测与小型化固相萃取（SPE）的开发，用于快速准确测量人尿中3-NT作为非侵入性生物标志物用于氧化应激。使用96孔板的SPE通过组合样品净化和分析物富集显着简化了工艺，而无需繁琐的衍生化和蒸发步骤，减少溶剂消耗，废物处理，污染风险和整体处理时间。使用pH为9的25mM乙酸铵（NH 4 OAc）作为SPE洗脱溶液，显着提高了选择性。通过调整多重反应监测（MRM）转换，改善了质谱信号的响应。在五氟苯基（PFP）柱（150mm×2.1mm，3μm）上使用0.01％HCOOH作为添加剂将信号响应提高2.5倍，并将总运行时间缩短至7分钟。实现了10 pg / mL（0.044 nM）的定量下限（LLOQ），相对于所报告的测定显示出显着的灵敏度改善。这种简化，快速，选择性和敏感性方法允许在24小时的时间段内处理两个尿液样本（n = 192）。考虑到明显改善的分析性能和非侵入性和便宜的尿液采样，所提出的检测方法有利于临床前和临床学习。

Introduction

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氧化应激的临床表现的影响已被推到前列，近年来1。正在探索的生物标志物之一是3-硝基酪氨酸（3-NT），当活性氮物质（RNS）与酪氨酸，儿茶酚胺神经递质前体相互作用时形成最终稳定的产物。而3-NT可以具有临床价值作为体内 RNS的生物标志物，其属性和酪氨酸的功能的显着变化可能不利地相应的蛋白质和细胞功能1,2影响。新兴的研究表明，3-NT可以在炎症条件下发挥重要作用3，神经退行性疾病4，5，心血管疾病6和7糖尿病，以及与氧化应激的条件。但是，这些都是这样的rvations基于来自缺乏灵敏度和/或选择性8，9，10，11的方法的结果。以前在文献中报道的生物样品的3-NT浓度范围巨大，显示出严重的分析问题与这些检测有关，需要进行....

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Protocol

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所有涉及人体尿液样本的研究都遵循了Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board（IRB）批准的手术。

尿液样品收集和肌酐（Cr）测定

  1. 第二天早晨收集5 mL尿样。 10小时过夜禁食在含有250μL3 N HCl作为防腐剂的5 mL输送管A中，储存于-20°C直至使用。
  2. 解冻并涡旋5 mL运输尿A管和离心机离心机（ 如 Sorvall）（2297 xg，10分钟）。
  3. 从5 mL运输管A等分1 mL尿液两次
  4. 通过尿肌酐法测定Cr 26 。

2.准备标准，IS和质量控制（QC）样品

  1. 在含有0.01％HCOOH流动相A（MA）的水中以100μg/ mL制备3-NT的储备溶液，并储存在-20℃。
  2. 使通过用MA稀释100μg/ mL 3-NT储备溶液，浓度为100ng / mL的3-NT工作标准溶液。
  3. 通过用不含3-NT的0.15M HCl酸化空白尿以及空白和双倍空白样品稀释100ng / mL工作标准，产生5至2500pg / mL的标准品。
  4. 用MA在水中以100μg/ mL制备IS 13 C 9 -3-NT的储....

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Results

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图1说明，在优化的LC条件下，3-NT与其它结构相似的酪氨酸类似物完全色谱分离，这消除了由于这些极度过量的化合物引起的共洗脱干扰，从而提高了测定选择性的程度。此外，以0.01％HCOOH作为添加剂在MA和甲醇中的流动速率为0.45 mL / min的梯度洗脱可以快速洗脱3-NT（ 即 3分钟，周转时间为7分钟）。

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图1: 标准溶液中3-NT与其他酪氨酸类似物的基线LC色谱分离。 （ A ） p-酪氨酸; （ B ） m-酪氨酸; （ .......

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Discussion

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在浓度实质变化先前在文献中内源性游离3-NT报导在人尿样品揭示了与可用的测定8，9，10，11相关联的方法问题。准确测定人尿中3-NT的低基础水平仍然是一项具有挑战性的任务，需要对样品制备和LC-MS / MS分析采取特殊预防措施。该协议概述了一种新型SPE程序，结合选择性LC-MS / MS检测，允许以高通量对尿3-NT进行特异性和灵敏的测定。

仔细选择MRM参数提高了3-NT检测的选择性。血浆27中 3-NT的ISM的MRM转换m / z 236.0> 96.0引起尿液样本的严重污染。更干净，信号增加9倍响应是通过MRM转换m / z 236.0> 189.0实现的。选择MRM转换m / z 227.0> 90.0由于严重干扰使用最密集的转换m / z 227.......

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Disclosures

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作者宣称他们没有利益冲突。

Acknowledgements

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作者将承认斯科特·霍华德（Scott Howard）和阿比盖尔·马里纳克（Abigail Marinack

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-硝基-L-酪氨酸SigmaN7389-5g
3-硝基-L-酪氨酸-13C<亚>9Sigma652296-5.0mg
质谱金尿Golden West Biologicals味精 5000-1L
Oasis MCX 96 孔和微量;洗脱板Waters186001830BA
2 mL 96 孔收集板Phenomenex  AH0-7194
96 正处理器Waters 
LC-MS Ultra CHROMASOLV 甲醇  Sigma14262-2L
LC-MS ULTRA CHROMASOLV 水Sigma14263-2L
用于质谱的甲酸Sigma94318-50ML-F
氢氧化铵溶液Sigma338818-1L
Ultra PFP 丙基色谱柱Restek9179362
5500 三重四极杆AB Sciex /联系制造商了解更多详情
UFLC-XR岛津 /联系制造商了解更多详情
Integra 400 Plus 罗氏/尿肌酐 Jaffé第 2 代方法
LCMS 认证 12 x 32 mm 螺旋颈样品瓶Waters600000751CV
LCGC 认证 12 x 32 mm 螺旋颈全回收样品瓶Waters186000384C
5 mL 运输管PhenixTT-3205
50 mL 离心管Crystalgen 23-2263
15 mL 离心管Crystalgen 23-2266
eLine 电动移液器Sartorius730391
微量离心机 贝克曼库尔特A46474
奥豪斯天平  Kennedy Scales， inc.735
涡旋混合器 伯恩斯特德 ThermolyneM16715
186005521 公司

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
    3. ....

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3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

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