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MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

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DOI：

10.3791/55790

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2018年1月24日

 , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

本文内容

摘要

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。

摘要

当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可在接近原子分辨率的水平上解析其晶体结构。然而，蛋白质、DNA、RNA及其复合物的结晶条件无法预先预测。采用多种不同的条件是提高获得优质衍射晶体几率的有效方法。英国剑桥医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）已开发出两套完全自动化的系统，可通过纳升液滴的蒸气扩散法，在1,920种初始条件下进行结晶筛选。此外，还建立了半自动化方案，通过调节试剂浓度、pH值或添加可能改善所得晶体性质的添加剂来优化结晶条件。本文将详细描述并简要讨论所有相关实验方案。综合而言，这些方法使得在多用户实验平台中能够便捷且高效地进行大分子结晶，同时使用户能够掌控实验中的关键参数。

引言

X射线晶体学被广泛应用于深入理解生物和疾病机制的原子层面，并进一步辅助基于理性设计的药物发现1。为此，需对蛋白质、DNA、RNA、其他配体及其复合物等纯化且浓缩（2–50 mg/mL）的大分子样品进行试验，以评估其通过结晶形成有序三维晶格的倾向2,3,4。当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可解析出接近原子分辨率的晶体结构5,6。关键在于，新型样品的结晶条件无法预先预测，且高质量晶体的获得率通常极低。其根本原因之一在于，许多目标样品具有复杂的生化特性，导致其在相应的结晶时间尺度（通常为数天）内不稳定。此外，样品及其变体的制备耗时，以及纯化与结晶条件的优化过程进一步延长了整体周期7,8。

结晶条件是指含有能够降低样品溶解度的沉淀剂的溶液，这些条件通常还包含缓冲液和添加剂。数百种此类试剂都非常适合用于调节结晶实验的参数，因为它们极少会干扰样品的完整性（例如蛋白质或核酸的去折叠）。尽管测试数百万种结晶试剂组合并不可行，但通过微型化实验和自动化方案，可以对多种筛选试剂盒进行测试——这些试剂盒基于不同的设计策略9,10。从这一角度来看，最适用的技术可能是蒸汽扩散法，即将100–200 nL的液滴置于含有结晶条件溶液（25–250 µL）的储液槽上方的小孔中，该方法在专用的结晶板中实现11,12。在上层小孔中制备液滴时，通常将蛋白质样品与结晶条件溶液以1:1的比例混合，总体积为200 nL。机器人纳米级蛋白质结晶也可采用其他技术和板型实现，例如油下批量法13和脂质立方相法14（后者专门用于在水中溶解度极低的跨膜蛋白）。

英国医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）的结晶设施始于21世纪初，我们自动化实验方案的早期总结于2005年发表15。当时介绍了蛋白质结晶技术的历史背景，并概述了机器人纳升级方法的优势（该方法在当时是常规实验中的一种新颖手段）。由于大分子结晶本质上是一个随机过程，几乎不存在可用的先验信息，因此采用多种多样的（合适的）初始条件可提高获得高质量衍射晶体的几率16。此外，大规模初筛的一个常被忽视的优点是，在许多情况下可显著减少后续对样品和晶体进行优化的需求。当然，在某些情况下仍需对部分初始条件进一步优化。通常，会系统地考察试剂浓度和pH值。也可在优化后的条件中引入更多试剂，以进一步调节结晶参数。当然，应尽量使用新鲜制备的样品进行结晶实验，因此相关实验方案必须简洁明了，并可随时使用。

本文全面描述了在MRC-LMB设计的两套全自动系统（系统1和系统2）及其相应的操作流程。这两套系统的主要应用是通过悬滴结晶板中的蒸气扩散法进行初步筛选。系统1集成了液体处理仪、用于储存板的自动转盘、用于板标记的喷墨打印机以及粘性板封膜机。在系统1上，72块96孔板被填充市售筛选试剂盒（从试管中起始体积为10 mL的溶液转移80 µL条件液至储液槽），并进行标记和封膜。随后，这些板被储存在10 °C培养箱中，供用户随时取用（作为称为“LMB板”的初步筛选板）。

系统2集成了液体处理仪、纳升级分液器和粘性板封膜机。在系统2上，通过将条件溶液与样品在20块预装有实验条件的48孔或96孔板的上部孔中混合，生成用于蒸汽扩散实验的悬滴（100–1,000 nL）。这意味着当在系统2上使用20块LMB板时，可同时进行1,920种初始筛选条件的试验。

机器人也被单独用于优化特定条件，相应的半自动化方案也有描述。通常采用四角法17进行优化筛选。该方案首先需要手动配制四种溶液（“A、B、C 和 D”）。随后，在结晶板的储液池中自动形成两种浓度的线性梯度（针对两种主要的结晶试剂）。为此，基于注射器的液体处理系统以不同比例分配四种角落溶液。

为进一步优化条件，可采用添加剂筛选方法，以增强所得晶体的性质18有两种方法可用于添加剂筛选：一种方法是在设置液滴前，先将添加剂加入结晶板的储液池中（方案1）。 以及另一种将添加剂筛选直接分配到液滴上的方案（方案2）。

本文还介绍了在MRC-LMB为促进大分子自动结晶而开发的其他实用技术。这些技术主要包括结晶板及相关装置，例如可堆叠的生物分子筛选学会（SBS）盖板，该盖板在使用系统2时可最大限度减少实验条件的蒸发。

为简洁起见，假设用户已熟悉纳升级分液器、喷墨打印机和粘性板封膜机的基本功能与维护。除非另有说明，机器人工作台上的板均放置在板架的后左角朝向位置，即A1孔（“A1角”）朝向板架的后左角。

方案

1. 两种全自动系统（初步筛选）

  1. 系统1：制备72块装有筛选试剂盒（LMB板）的96孔结晶板
    1. 在执行操作前，确保系统的机器人已完成初始化，并且其控制软件已打开。在主程序启动前约30分钟，打开管路冷却载体的制冷机。
    2. 将测试板放置在板封膜仪的电动SBS载板架上。运行板封膜仪，并检查封膜是否正确贴合。重复此测试两次，以确认板封膜仪已准备就绪。
    3. 然后，向液体处理仪的主容器中加入 20 L 去离子水。断开小容器（20% 乙醇冲洗液）的耦合接头，并将接头连接至主容器。
    4. 输入适当的屏幕名称（表1在喷墨打印机的触摸屏上点击 ）。然后打开并关闭幻灯片架舱门以触发幻灯片架旋转。当第一叠幻灯片出现时，打开舱门。
    5. 将第一个堆栈装满22块结晶板，每块板均以第1列朝外。以相同方式装满接下来的两个堆栈。
    6. 将剩余的6块板加载到第四层堆叠的最高位置，然后关闭转盘门。
    7. 确认冷却器显示屏显示为 14 °C。轻轻反复倒置所选的筛选试剂盒 1 分钟。然后，打开液体处理仪的前面板。
    8. 打开管子，按照标准的96孔板布局（A1、A2）将其放入冷却载体中 等等将每支试管放入载体后，将其管盖按相同的96孔布局放置在托盘上。
    9. 核对试管位置，确保所有试管在载体中水平且放置稳固。然后，关闭前面板。
    10. 在液体处理仪软件的“启动”窗口中，选择“运行维护”并打开冲洗程序。运行该程序，以冲洗系统中的20%乙醇，并清洗液体分配吸头的外部。
    11. 冲洗完成后，单击“Cancel”返回“Startup”界面。选择“Run an existing process”，然后单击“Start your selection”。打开“MRC kit dispensing”程序。在配置界面中将“Instances”设置为“18”，然后运行程序。
    12. 在前四块板进行标记、加样和密封时，监控系统运行。
    13. 当所有72块板均制备完毕并放回转盘后，将耦合接头从主容器切换至小容器，运行“启动冲洗”程序（见步骤1.1.10）。
    14. 关闭制冷机并丢弃空的筛选试剂盒管。小心地从转盘上取下72块已准备好的微孔板。丢弃填充错误或密封不良的微孔板。将可使用的微孔板在10 °C下储存。
  2. 系统2：从单个样品在20块LMB板中设置结晶液滴（100 nL蛋白质 + 100 nL条件溶液）
    1. 首先，确保系统机器人已开启，纳升级分液器已初始化并打开其软件，同时液体处理仪的方法管理器也已打开。在主程序启动前约15分钟，打开微管冷却载体。
    2. 将测试板放置在板封膜机的电动SBS载板架上。运行板封膜机，并确认板已正确密封。重复测试板封膜机三次。
    3. 然后，运行纳升级分液器，在检测板上设置100 nL的测试溶液液滴。在显微镜下检查液滴是否正确放置。关闭纳升级分液器软件，并从仪器平台取出条带架模块。
    4. 接下来，将定制设计的板架插入（参见 代表性结果：在LMB开发的结晶装置）含有挥发性试剂相对含量最高的LMB板表1）。从培养板上移除粘性膜。
    5. 打开液体处理仪的前面板，将未密封的板放置在平台上的第一个滑动载具后部（为方便操作，可将滑动载具拉出）。
    6. 用SBS铝盖盖住板。通过轻轻按压盖子的对角，将盖子向载体的后左角方向固定。
    7. 打开密封，将滑动载体装入，以从最易挥发到最不易挥发的条件顺序，以相同方式覆盖剩余的19块板。当微型管冷却载体温度达到4 °C（由绿灯指示）时，取下其盖子。
    8. 剪下含有至少 440 µL 蛋白质样品的微量离心管管盖表2）。确保样品液面无泡沫，以免干扰液体检测系统。将试管放入微型管冷却载体的1号位置。
    9. 将PCR板放置在液体处理仪工作台前方的板移动适配器载具前，然后关闭前面板。
    10. 加载托盘后，确保纳升级分液仪托盘远离条带固定块，且50 µL吸头堆栈后部的支架远离铝制SBS盖。
    11. 在液体处理仪的“方法管理”界面中，选择“设置板”。监控两个系统的初始化过程，并填写运行参数。遵循方法管理界面中的指南（提示、图示以及吸头管理系统将协助准备工作）。
    12. 仔细检查所有必需组件是否已准备就绪，然后启动流程。
    13. 在纳升级分液器将液滴加入第一块板后，随即由板封仪对板进行封板，需全程监控该系统。
    14. 当所有20块板均制备好结晶液滴并自动返回滑动载体后，打开前面板，轻轻取出板。在将板存放用于结晶之前，检查其密封是否正确。
    15. 使用20%乙醇溶液清洁SBS盖子，然后将其堆叠在液体处理仪左侧以供储存。丢弃PCR板和微量离心管。
    16. 关闭微型离心管冷却装置，并擦去冷凝水。在冷却表面放置一张纸巾，以吸收后续产生的冷凝水。然后盖上载体盖板并关闭前面板。

2. 条件优化

  1. 基于注射器的液体处理装置：通过四角法在结晶板的储液池中生成两种浓度的线性梯度。
    1. 首先，确保液体处理仪已开机，并启动其配套软件完成初始化。
    2. 在“梯度”选项卡中：打开所需程序，选择结晶板类型以及储液池中的终体积（表3). 当使用含有异丙醇的溶液时，应将“最大射流体积”高级设置从 6,000 降低至 3,000 > 10% v/v 和 [MPD] > 20% v/v
    3. 准备注射器。将活塞插入每个注射器内（尖端朝下），并将注射器尾部插入机器人头部下方的指定凹槽中。顺时针旋转注射器以将其固定到位（程序仅在所有必需的注射器正确安装后才会启动）。
    4. 准备槽体。取下不锈钢框架，插入槽体。左侧的4个位置对应4个角A、B、C、D。切换到“SET UP”选项卡，该选项卡显示每个注射器中所需的溶液体积（在 表3，需在显示体积基础上增加0.5 mL死体积）。将各角的溶液倒入相应的槽中，并将支架放回工作台面上（支架通过台面前端的两个小磁铁固定位置）。 执行此步骤的另一种方法是，当槽体已放置在平台上时，将溶液倒入槽中。
    5. 将结晶板放置在电动SBS载板架上。
    6. 点击“ASPIRATE”，并等待此步骤完成（当活塞在上升过程中停止时）。
    7. 切换到“RUN”选项卡并运行程序。
    8. 程序结束后，返回“设置”选项卡并点击“移除”：系统将清除注射器中残留的溶液，然后将活塞完全上提。 可请求执行“PURGE”而非“REMOVE”；此操作将使活塞保持在底部位置，以便使用同一注射器吸取更多溶液。
    9. 通过逆时针旋转移除注射器。
    10. 将注射器和槽体丢弃至适当的垃圾桶中（或用去离子水冲洗，再用20% v/v乙醇溶液冲洗后重复使用）。
    11. 密封培养板并置于微孔板振荡器中，以1,000 rpm振荡3分钟；若混合高黏度溶液，则振荡10分钟。培养板随后可用于纳米升移液器设置结晶液滴。
  2. 添加剂筛选方案1（在预装有添加剂筛选试剂的96孔结晶板中设置结晶液滴）
    1. 首先，配制试剂初始浓度提高10%的条件（使用液体处理仪将反应体系从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。
    2. 确保液体处理仪处于可运行状态。打开“向单孔板中添加添加剂”程序（在储液槽中输入体积：“72 µL”）。 提示信息、图示和移液枪头管理系统（需12盒1,000 µL枪头）有助于确保机器人根据所选设置准备就绪并正常运行。
    3. 从-20 °C冰箱中取出添加剂筛选板，立即用板架移除其铝制封膜，然后将板放置在液体处理仪的工作台上。 程序按照纵向布局运行（将板放置在载体上前左角为A1角）。 同时将装有培养条件的容器放入。运行程序。
    4. 在微孔板的储液槽加样完成后，将其放入微孔板摇床并运行程序。用去离子水和20%乙醇冲洗条件溶液容器，以备重复使用。
    5. 在纳升级分液器上设置液滴首先，打开结晶板的密封（使用板架）。然后，将结晶板和8孔蛋白条带放置在条带架模块的第一个位置。 控制软件中的“设置”选项卡显示甲板上各组件的实际位置. 根据所需的液滴大小，向条带的每个孔中加入蛋白样品（表 4). 运行程序以制备液滴。
    6. 程序结束后，立即从仪器平台取下反应板并密封（使用板封仪或3英寸宽的压敏胶带）。将封条丢弃至指定垃圾桶中。
    7. 在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状和居中情况。
  3. 添加剂筛选方案2（使用可重复利用的添加剂筛选试剂盒在96孔结晶板中设置结晶液滴）
    1. 首先，准备添加物筛选板：将相应的冷冻96孔细胞培养板在室温下放置40分钟以解冻。然后，在1,000 x g条件下离心2分钟。
    2. 准备条件培养基（使用液体处理仪将培养基从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。
    3. 用条件溶液填充96孔结晶板的储液槽。在液体处理仪上操作步骤与方案1的2.2.2步骤相同，但在设置储液槽体积时输入“80 µL”。
    4. 在纳升级分配仪上设置液滴，将甲板上的三个组分进行布置（包含添加剂筛选板、结晶板，以及位于条带固定块第一位置的8孔蛋白条带） 表4).
    5. 用铝箔密封含有筛选样本的细胞培养板，并将其放回 -20 °C 培养箱中。
    6. 在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状及居中情况。

结果

1. 系统1和LMB平板

图1A 展示了基于液体处理系统的系统1，该系统使用液体系统（去离子水）运行。液体系统包括一个容器、泵、管路、8个配备阀门的注射器以及8个固定吸头。液体类型设置已优化，可吸取/分配多种溶液，并向4块板进行多次分配（多次分配需要相对较大的吸取体积余量）。系统下方放置有一个22 L的水箱和一个较小的5 L容器，后者含有20%（v/v）乙醇，用于为液体系统供液。每个容器均配备两个连接插口：一个插口（蓝色）向系统供液，另一个（红色）为回流口，用于降低过压。使用后，依次用去离子水和20%（v/v）乙醇溶液冲洗，以防止微生物生长。一个冷却单元（同样位于系统下方）连接至定制的管路冷却支架。系统1的尺寸为宽2050 mm（含转盘）、深760 mm、高88 mm。前方需额外预留550 mm空间，用于放置喷墨打印机控制单元和粘合板封膜机的工作台。系统旁边还需预留空间用于放置控制用PC。生成72块预填充板的程序（即 18轮，每轮4块板，共需3小时50分钟。

图1B 是主工作台的特写，配备有8个固定吸头（图1C），安装在自动移液臂上，另有一个带夹持器的第二机械臂、吸头清洗站、2个4位SBS板载体以及管冷却载体。主程序一次处理4块板，自动从转盘中取出并放置到工作台上，在其中加入结晶条件溶液（储液池中80 µL，图1D）。由于吸头具有导电性，可自动检测液体液面。当液体处理仪向一组板中分配条件溶液时，另一组空板从转盘中被取出，贴标签后放置到主工作台上。为将打印头及其传感器安置在主工作台后方，需在液体处理仪后板上加装一个小型定制支架和窗口。每次分配步骤完成后，8个吸头会使用主容器中的水进行冲洗和清洗，该分配步骤包括向储液池相应列中加入4份等分试样。当4块板填充完毕后，系统会自动密封并将它们放回转盘中的原始位置。板密封仪由特定驱动程序（由控制软件调用）触发。密封仪使用一卷3英寸宽的压敏胶带，通过滚轮在机械压力作用下将其贴附到板上。程序完成后，预填充的板从转盘堆栈中手动取出，并储存在实验室内配备的10 °C培养箱中。

采用机器人、样品处理和板加载组件的自动化蛋白质纯化装置。
图1：使用初始筛选试剂盒填充储液槽。（A）全自动系统1的概览。转盘是一个独立的自动化单元，包含堆叠的板，安装在主甲板右侧由透明丙烯酸板制成的凹槽内。（B）液体处理仪主甲板运行中的状态，包括（a）管冷却载体（连接至下方的制冷装置，未显示），（b）快速清洗站（连接至排水系统，未显示），（c）移液臂正在向96孔结晶板的8个储液槽中加样，（d）夹持臂将已填充的板转移至（e）板封膜机的电动SBS载体上。甲板后方为（f）喷墨打印机的打印头，连接至封膜机下方的（g）喷墨控制单元。（C）一块已标记的板（显示筛选名称和生产日期），正通过8个由聚四氟乙烯涂层不锈钢制成的导电固定吸头填充结晶条件溶液。（D）密封后的结晶孔截面图。储液槽中含有80 µL结晶条件溶液（上层孔为空）。储液槽和上层孔的深度规格以毫米为单位。请点击此处查看该图的放大版本。

表1列出了市售筛选试剂盒在试管中的不同配方。这些试剂盒用于通过系统1定期填充96孔结晶板（LMB01-LMB22）的储液槽。

板名称试剂盒名称供应商目录号管数基本描述
LMB01Crystal Screen 1Hampton ResearchHR2-11048稀疏矩阵（pH 4.6–8.5）
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-11248随机取样（pH 4.6–9.0）
LMB02Wizard 1Rigaku100953048随机取样（pH 4.5–10.5）
Wizard 2Rigaku100953148随机取样（pH 4.5–10.5）
LMB03Grid Screen Ammonium SulfateHampton ResearchHR2-21124网格筛选，[硫酸铵] = 0.8–3.2 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
Grid Screen PEG/LiClHampton ResearchHR2-21724网格筛选，[PEG 6000] = 0–30 %w/v，LiCl 浓度 = 1.0 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
Quick ScreenHampton ResearchHR2-22124网格筛选，[NaKPO4] = 0.8–1.8 M，pH 5.0–8.2
Grid Screen Sodium ChlorideHampton ResearchHR2-21924网格筛选，[NaCl] = 1.0–4.0 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
LMB04Grid Screen PEG 6000Hampton ResearchHR2-21324网格筛选，[PEG 6000] = 5–30 %w/v，缓冲液 pH 4.0–9.0
Grid Screen MPDHampton ResearchHR2-21524网格筛选，[MPD] = 10–65 %w/v，缓冲液 pH 4.0–9.0
MemFacHampton ResearchHR2-11448膜蛋白稀疏矩阵（pH 4.6–8.5）
LMB05PEG-IonHampton ResearchHR2-12648网格筛选，[PEG 3350] = 20 %w/v，多种盐类浓度为 0.2 M（无缓冲液）
NatrixHampton ResearchHR2-11648不完全因子设计（pH 5.6–8.5）
LMB06Crystal Screen LiteHampton ResearchHR2-12848Crystal Screen 1 的沉淀剂浓度为原始浓度的一半
Custom Lite screenMolecular Dimensionsn/a48低沉淀剂浓度的附加条件
LMB07Wizard Cryo 1Rigaku100953648采用低分子量 PEG 进行冷冻保护的随机取样条件（pH 4.5–9.4）
Wizard Cryo 2Rigaku100953748采用低分子量 PEG 进行冷冻保护的随机取样条件（pH 4.5–10.1）
LMB08JBS1JenaBioScienceCS-101L24基于多种 PEG 的不完全因子设计（pH 4.6–9.0）
JBS2JenaBioScienceCS-102L24基于 PEG 4000 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS3JenaBioScienceCS-103L24基于 PEG 4000 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS4JenaBioScienceCS-104L24基于中等分子量 PEG 的不完全因子设计（pH 6.5–8.5）
LMB09JBS5JenaBioScienceCS-105L24基于高分子量 PEG 的不完全因子设计（pH 6.5–9.5）
JBS6JenaBioScienceCS-106L24基于硫酸铵的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS7JenaBioScienceCS-107L24基于 MPD 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS8JenaBioScienceCS-108L24基于 MPD 和乙醇的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
LMB10JBS9JenaBioScienceCS-109L24基于常见盐类和 2-丙醇的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS10JenaBioScienceCS-110L24基于常见盐类的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
Clear Strategy Screen 1 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB11Clear Strategy Screen 1 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB12Clear Strategy Screen 2 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB13IndexHampton ResearchHR2-14496小型稀疏矩阵和网格筛选（pH 3.0–9.0）
LMB14SaltRX 1Hampton ResearchHR2-10748网格筛选，包含 22 种不同盐类，考察盐浓度与 pH（4.1–9.0）的影响
SaltRX 2Hampton ResearchHR2-10948网格筛选，包含 22 种不同盐类，考察盐浓度与 pH（4.1–9.0）的影响
LMB15MemStartMolecular DimensionsMD1-2148膜蛋白稀疏矩阵（pH 4.0–10.0）
MemSysMolecular DimensionsMD1-2548膜蛋白网格筛选（主要含 PEG，pH 3.5–9.5）
LMB16JCSG+Qiagen13072096稀疏矩阵（pH 4.0–10.0）
LMB17MORPHEUS screenMolecular DimensionsMD1-4696网格筛选，包含添加剂混合物及冷冻保护条件（pH 6.5–8.5）
LMB18Pi minimal screenJenaBioScienceCS-12796不完全因子设计（pH 4.0–9.5）
LMB19Pi-PEG screenJenaBioScienceCS-12896膜蛋白的不完全因子设计（pH 4.8–8.8）
LMB20MORPHEUS II screenMolecular DimensionsMD1-9196网格筛选，包含添加剂混合物（重原子）及冷冻保护条件（pH 6.5–8.5）
LMB21LMB crystallization screenMolecular DimensionsMD1-9896稀疏矩阵，包含从 LMB 发表文献中筛选出的条件
LMB22MORPHEUS III screenMolecular Dimensionsn/a96网格筛选，包含添加剂混合物（药物化合物）及冷冻保护条件（pH 6.5–8.5）

表1：LMB平板中所含试剂盒的配方。每种商用筛选试剂盒最初包含24/48/96种条件，置于离心管中。LMB平板存放于设施内的10 °C培养箱中，可供用户随时取用。

2. 系统2及液滴制备的要求

图2A展示了基于液体处理仪19的系统2，该仪器采用正置换原理并使用一次性吸头。一次性吸头以可堆叠的架子形式提供，适用于自动化操作。一个三工位纳升级分液器20被集成在系统的右侧。纳升级分液器的吸液/分液操作同样采用正置换原理，并使用一次性微量注射器（以大卷形式提供）。作为独立运行的机器人时，通过可拆卸的条带架模块来加载蛋白质样品；在全自动流程中，则用384孔PCR板替代条带架。系统左侧集成了与系统1类似的粘性板封膜仪。封膜仪和纳升级分液器安装在定制的抬高工作台上，以便主机械臂能够触及这两个集成机器人的板载体（为使机械臂能从主平台外部进入，在液体处理仪两侧面板上均切割了窗口）。主程序会在适当时机调用特定驱动程序，以触发纳升级分液程序和封膜操作。系统2的尺寸为宽2,850 mm、深800 mm、高800 mm。机器人旁边需预留额外空间用于放置控制用PC的显示器。系统下方设有两个废液箱，分别用于收集实验过程中废弃的吸头和微量注射器（控制用PC也放置于下方）。系统2的一个重要特点是整体布局设计，保留了对三个机器人的便捷访问，使得它们可单独用于前述的优化实验方案，或其他文献中描述的实验方案，例如在脂质介相中进行膜蛋白结晶21以及随机微晶种基质筛选22。

图2B 是配备单个机械臂的平台局部放大图。该机械臂集成了12个独立的移液探针和主夹持器。探针的位置可在单一方向上独立控制，以便触及探针轴线上不同位置，甚至单个离心管。探针可安装一次性吸头（1-12）或一对板移动适配器。初始装载两组各含4叠50 µL一次性吸头。由于吸头具有导电性，系统可自动检测液面高度。板移动适配器内侧设计有两个尖锐销钉，可在需要时形成可选的夹持结构。主平台上设有一个24位微量管冷却载体，用于放置样品，但此处仅使用1-2个位置。此外，还配备一个PCR板载体，以及两个用于堆叠式定制SBS盖板的储存载体（图2C）。最后，还有4个滑动载体，每个载体有5个位置用于放置结晶板（4 × 5 = 20块板）。

自动化液体处理系统；微孔板布局；蒸发过程示意图；液滴分析
图2：设置用于蒸汽扩散实验的液滴。（A）全自动系统2的概览。 (B) 液体处理仪在运行中的主甲板，配备（aSBS 盖板堆叠用储存载体，b可堆叠吸头，（c) 带有样本的微量离心管的冷却载体，(d）用于2个移板适配器的载体，（e）用于将蛋白质转移至纳升级处理机器人的PCR板，（f) 9个已放回初始位置的密封平板，(g可选夹具移除 SBS 板盖的 10th 平板即将被运送至液体处理仪的工作台，(h接下来的10块板需在顶部放置SBS盖板进行准备，（i用于转运PCR板和结晶板的主要夹爪，(j）集成了12个移液探针（其中2个可选作抓取器使用）的主要自动化臂以及主抓取器，和（k纳升级分液仪的加样平台。C) 自制定制的铝制SBS板盖。板盖集成有橡胶垫以防止溶液蒸发，并设有两个小孔，便于可选的机械抓手精确抓取。D) 密封的结晶井横截面示意图，其中储液池内充满一种结晶条件溶液，上井内含有由蛋白质样品与该条件溶液混合形成的液滴。由于液滴中的沉淀剂浓度低于储液池中的浓度，因此在蒸气扩散平衡过程中，随着水分的流失，液滴内所有组分的浓度逐渐升高（图中以箭头极为简化地表示）。E100 nL 的光学显微照片以及（F使用纳升移液器将测试溶液（20% v/v 聚乙二醇 400，0.001% w/v 沙弗兰作为红色染料）制备 200 nL 液滴。液滴的大小和形状可能根据该条件的理化性质而变化。 请点击此处查看该图的放大版本。

主程序开始时，可选的夹爪将SBS盖子从第一块结晶板上移除。盖子被转移至相应的储存载体后，结晶板被运送至纳升级分液仪的工作台。随后，移液臂将设定液滴所需量的样品从通常冷藏的微量管转移至PCR板的第一列。接着，主夹爪将PCR板移至纳升级分液仪的工作台上，该仪器将根据用户在开始时选择的选项制备液滴例如液滴大小）。首先，使用一组8个微量注射器和多通道分配方式将蛋白质样品分配至上方的孔中，随后将结晶条件溶液分配到蛋白质液滴上（每行需使用8支新的微量注射器，以避免交叉污染）。完成液滴设置程序后，主机械臂将相应的板转移至板封膜机进行密封，然后将PCR板放回原来的位置（后续板的下一列将再次向PCR板中添加更多蛋白质）。最后，密封后的结晶板被移回平台上的原始位置：此板中的蒸汽扩散实验已经启动（图 2D）。根据板子的数量重复此循环。必要时，可选的夹持器会移除空的吸头架，以便移液臂能够接触到更多的吸头。该程序耗时2小时20分钟，并 440 µL 样品量，用于在20块板中制备单个液滴，每份含100 nL样品 + 100 nL条件液图 2E 和 2F).

当将纳升级点样仪作为独立机器人用于另外两块板时（参见方案，步骤1.2.3），可设置10 °C培养箱中所有可用的初始筛选板（22块LMB板 × 96种条件 = 2,112种条件）。

表2 显示了根据用户在系统2上的选择，主程序所需满足的要求。

板液滴体积 (nL)样品吸头要求耗时
数量类型体积 1 (µL)体积 2 (µL)50 µL 吸头微量注射器
1096-孔板10024008010401 小时 12 分钟
2096-孔板100440016020802 小时 20 分钟
1096-孔板10024024016020801 小时 45 分钟
2096-孔板10044044032041603 小时 05 分钟
1048-孔板10006240805601 小时 10 分钟
2048-孔板10001208016011202 小时 16 分钟

表2：系统2中用于设置结晶液滴的主要程序选项示例。 所需蛋白样品量、枪头和微量注射器的数量根据程序而定。样品体积“vol. 1”（液滴1）和“vol. 2”（液滴2）的计算方法如下：（8个枪头 × PCR板每孔所需体积 + 4 µL 损失体积) × 结晶板数量 + 40 µL 微量离心管中的死体积。在96孔结晶板中，每孔PCR板生成100 nL液滴所需的体积为 2 µL 而 6.8 µL 在48孔板中生成1,000 nL液滴时所需（PCR板各孔中的死体积： 0.8 µL）。还需额外考虑因蒸发及其他损耗（如样品黏附在枪头）而损失的样品体积（“损失体积”）。例如，对于20块MRC板，采用100 nL、每孔1滴的方案，所需样品体积为：(8 × 2 + 4) × 20 + 40 = 440 µL (即，相当于 22 µL 每块平板）。八个一次性 50 µL 每块板和每个样本均需使用枪头。例如，对于10块板、采用双滴加样程序时，所需枪头数量为 8 × 10 × 2 = 160 个。微量移液器枪头数量的计算公式如下：（8 + 每板条件数）× 样本数 × 板数。例如，对于10块48孔板，所需液体处理装置枪头数量为：（8 + 48）× 1 × 10 = 560 个。

3. 四角溶液的配制、准备与处理

两种形式的四角溶液（“A、B、C 和 D”）及相应的优化筛选实验（图 3A）均由一个 Excel 电子表格 自动生成。针对不同数量的条件（主要是 24、48 和 96 个条件），使用不同的电子表格，也有用于在一块板上制备两种不同优化筛选实验的电子表格。通常情况下，从试管中配制一组 4 × 10 mL 的四角溶液，根据所需条件的数量和体积，可制备 2–3 次优化筛选实验。将这些溶液倒入储液槽中，通过基于注射器的液体处理系统吸取，随后直接分配到微孔板中（图 3B）。两种浓度的线性梯度是通过以系统变化的比例混合 A、B、C 和 D 形成的（图 3C）。

高通量筛选；自动化移液系统示意图及设置；数据分析结果。
图3：用于制备优化筛选的四角法。 （A）96孔板布局中两种浓度梯度的示意图。 （B）基于注射器的液体处理装置，已准备就绪，机器人头部已插入4个注射器。结晶板放置在电动化的SBS载体中，4种起始溶液（A、B、C和D）已分别加入各自的槽中（为演示目的，溶液被染成红色）。 （C）96个储液槽中溶液A、B、C和D的比例。 请点击此处查看该图的放大版本。

表3 显示了基于注射器的液体处理设备上可供用户使用的程序所需的要求。

板类型条件数量板内体积（储液槽，µL）槽内体积（mL）持续时间
96孔板48801.62 分 5 秒
96孔板96802.53 分 50 秒
96孔板2 × 48801.62 分 50 秒
48孔板242001.82 分 25 秒
48孔板4820034 分 20 秒

表3：基于注射器的液体处理装置上用于根据四角法配制优化筛选实验的可用程序。 96孔板可用于配制96个或48个条件的优化筛选实验（当同时配制两个48个条件的筛选实验时，机器人必须配备8个注射器和8个储液槽）。其他程序支持使用48孔板。列表中储液槽的体积已包含所需的死体积（0.5 mL）。

4. 添加剂筛选

图4展示了进行添加剂筛选的步骤，起始材料可为已加入结晶板储液池中的96种添加剂溶液（方案1），或加入低剖面细胞培养板孔中的添加剂溶液，该培养板用作可重复使用的添加剂筛选板（方案2）。表4列出了纳米级移液器上针对两种类型方案可用的程序。

结晶过程示意图，使用MRC板、纳升级分液、蒸气扩散法的实验方案。
图4：添加剂筛选的两种实验方案。 96种添加剂筛选溶液储存在-20 °C。按照方案1，添加剂筛选溶液最初被加入到结晶板的储液池中（理想情况下应以此方式预先配制）。使用液体处理仪或多通道移液器将条件溶液加入含有添加剂溶液的储液池中（添加剂筛选溶液的体积占储液池终体积的10%：终体积为80 µL时，添加剂体积为8 µL）。在微孔板混合器上混合各条件（图中未示），然后使用基于微注射器的纳升级分液系统设置液滴（表4）。按照方案2，添加剂筛选仅在设置结晶液滴时稍后加入；此时，纳升级分液系统在其平台上的额外组分位点（即可重复使用的细胞培养板，内含添加剂筛选溶液）中取液，用于制备含有添加剂的液滴。请点击此处查看该图的放大版本。

实验方案液滴体积 (nL)试纸条类型样品体积 (µL)微注射器数量持续时间
类型添加剂来源蛋白质条件添加剂每孔（试纸条）总计
196孔结晶板10010002 µL2161042 分钟
196孔结晶板20020005 µL3.8311042分10秒
296孔细胞培养板2002001005 µL3.8312003分45秒
296孔细胞培养板5005001005 µL7.4602004分15秒

表4：基于微量注射器的纳升级分液器上可用于添加剂筛选的程序。 每个8联管条带孔中所需的样品体积计算方式如下：死体积 + 12 × 液滴体积。有两种类型的条带（2 µL 和 5 µL）。2 µL 孔的死体积为 0.8 µL（实际最大容量为 3.2 µL），5 µL 孔的死体积为 1.4 µL（最大容量为 7.5 µL）。所需蛋白总体积为：8 × 条带上每孔的体积（向上取整值）。96孔细胞培养板V型孔的死体积为2.5 µL。所需微量注射器的数量根据所选程序而定（8 + 96 = 104；或 8 + 2 × 96 = 200）。

由于在方案1中，添加剂会对条件溶液产生稀释作用，因此需要将该条件溶液配制为比初始浓度更高比例的浓度。最简便地实现最终浓度增加的方法是：将最终加入的水量减少至计算所得的最终体积。此后，只需按照常规步骤制备液滴，使条件溶液与样品混合即可例如，100 nL 蛋白质 + 100 nL 已加入添加剂的条件溶液）。方案 2（例如200 nL 蛋白质 + 200 nL 条件溶液 + 100 nL 添加剂）通过简单调整所添加添加剂筛选溶液的体积，即可实现对不同浓度添加剂的筛选。方案2会导致液滴发生不同程度的稀释（可能影响结晶）。

系统2的液体处理仪可使用12个吸头吸取足够的培养基，并将其分装至96孔板的储液槽中（共8份，参见方案，步骤2.2.2），尽管此步骤也可使用多通道移液器手动完成（图4）。使用液体处理仪时，可同时为多个孔板加入相同的培养基（以便后续测试不同的添加剂筛选条件）。当准备2块板时，需向试剂容器中加入至少23 mL的液体；当准备3块板时，需加入至少31 mL。

5. 结晶板及相关装置

两种MRC坐滴气相扩散结晶板（96孔双滴和48孔单滴，图5A 和 图5B）的设计具有可实现可靠且高效的自动化结晶实验的特性，其中上孔呈球形，储液池呈轻微的V形，这些特点有利于精确加样，且在需要对液滴进行居中时便于离心操作。此外，上孔具有透镜效应，可在体视显微镜下实现最佳照明（该聚合物可透过紫外光，用于检测紫外吸收性或荧光性晶体23）。

一种定制的密封装置（图5C）可支持在两种类型的板中使用纳升级分液器设置悬滴结晶实验（方案未展示）。最后，两种MRC板具有相同的外部尺寸和边缘结构。该边缘可嵌入我们自行设计的板架（图5D）的凹槽中，用于在不溅出液体的情况下手动贴合或移除密封胶带。

高通量筛选用微孔板的尺寸与设置；A/B：网格测量；C/D：固定系统。
图5：LMB开发的MRC结晶板及相关装置。（A）96孔板的A1角。储液池（椭圆形）位于结晶孔的左侧，两个球形上孔位于右侧。尺寸单位为毫米。（B）48孔板的A1角。储液池位于孔的右侧（仅一个较大的上孔）。（C）MRC悬滴密封条。（D）实验室自制的板架。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 蛋白质晶体

图6展示了采用我们自动化方案获得的有用晶体的示例。

不同尺度下的结晶过程显微镜图像，展示晶体形成的动态过程。
图6：采用全自动方案获得的含晶体液滴的光学显微图像。（A、B）来自OmpF和MreB在两种全自动化系统制备的板中进行初筛所获得的晶体（参见方案部分1.1和1.2，条件分别为LMB07 A4孔和LMB20 D12孔，液滴体积为100 nL蛋白 + 100 nL条件，Andrzej Szewczak，LMB的研究工作）24。（C、D）Bar结构域晶体在使用四角法优化初始条件前后的图像（步骤2.1，LMB02 B6，1,000 nL + 1,000 nL，Leonardo Almeida-Souza，LMB未发表工作）。（E、F）人动力蛋白1重链N端结构域晶体在使用四角法优化初始条件前后的图像（LMB20 E6，200 nL + 200 nL，随后调整为500 nL + 500 nL，Edgar Morales-Ríos，LMB未发表工作）。（G、H）补体因子D晶体在通过添加剂筛选优化条件前后的图像（步骤2.2，初始条件来自实验室自定义筛板，200 nL + 200 nL，添加剂为96种条件添加剂筛板中的D6，Matthias Bauer，LMB未发表工作）。（I、J）病毒包膜糖蛋白25晶体在通过添加剂筛选优化条件前后的图像（步骤2.3，LMB20 A2，150 nL + 150 nL，随后调整为200 nL + 200 nL + 100 nL添加剂E5，来自96种条件添加剂筛板，Yorgo Modis，英国剑桥大学，未发表工作）。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

1- 准备和使用保存在培养板中的初始筛选样本

在将筛选试剂盒中的溶液分装到板孔之前，应先进行混匀，因为在储存过程中，部分管内的溶液可能出现轻微沉淀或相分离现象。当一个筛选实验包含两个试剂盒（2 × 48 管）时，第二个试剂盒的第一管应放置于冷却载体的 E1 位置。当筛选实验包含四个试剂盒（4 × 24 管）时，第二个试剂盒的第一管置于 C1 位置，第三个试剂盒的第一管置于 E1 位置，第四个试剂盒的第一管置于 G1 位置。在将各管插入冷却载体的同时，管盖应按照标准的 96 孔板横向布局放置于托盘上。由于制造商通常在管盖顶部标注了孔位编号，此操作可便于核对所有管子是否按正确顺序放置。此外，在仅需填充较少数量的板时，该方法也有助于将正确的管盖重新盖回对应的管子上。

我们将预装好的板存放在10 °C，这一温度是为避免冻结以及4 °C储存可能导致的条件恶化和密封问题而采取的折中方案。这些板可储存数月，通常在密封膜内表面不会出现明显冷凝。但对于LMB05、LMB06、LMB09和LMB10板而言，此情况较不理想，因为这些板中含有挥发性试剂浓度相对较高的条件（表1）。密封膜内侧出现少量冷凝会降低密封效率，并在打开板时导致孔间交叉污染。为帮助防止初始冷却过程中产生冷凝，可先将板从转盘转移到一个隔热的便携式冷藏箱中，并在4 °C冷藏室中过夜。这种极缓慢的冷却过程可最大程度减少密封孔内温度梯度的形成，从而整体上减少冷凝15。此外，当板存放在10 °C培养箱中后，会在每叠板的顶部加盖一个实验室自制的SBS聚苯乙烯盖（未示出）。

我们所有预装板均可用于对一种新的水溶性蛋白质样品进行大规模初筛。或者，也可选择较少的板以满足特定需求。例如，LMB15 和 LMB19 是专为膜蛋白样品设计的筛选板26,27，而 LMB20 则是一种含有重原子的筛选板，有助于衍射数据的实验相位测定28（另见：MORPHEUS 蛋白质结晶筛选试剂的配制）。

2. 设置结晶液滴

使用系统2时，应优先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。这可以避免在SBS盖板的橡胶部分形成冷凝水，从而影响盖板操作和板的密封性。SBS盖板在放置于板顶部时存在一定的间隙，因此需要在初始阶段进行对齐（见方案，步骤1.2.6）。PCR板各孔中的蛋白质死体积相对充足（0.8 µL，参见表2图注）。需要注意的是，当单独使用纳升级分液器配合8联管条带中的蛋白质进行操作时，同样采用了同样充足的死体积（表4）。虽然更小的死体积可能也能使用，但某些样品可能会黏附在吸头表面，机器校准可能略微不准确，环境温度可能高于常规水平，等等。上述各种因素均可能导致样品损失，而充足的死体积可覆盖这些损失，以确保方法的稳健性。

最近的技术进展使得实验进一步微型化，因此通过整合相应技术，筛选结晶条件所需的样品体积可显著减少29,30。然而，进一步微型化的一些方面需要仔细考虑，例如液滴的蒸发31和微晶的操作32。

最后，在设置结晶液滴（位于球形上孔中）时，可将离心步骤（2,000 rpm，1 分钟）作为常规的最终操作纳入流程。通过离心获得的液滴在大小和形状上更为均一，有助于减少重复性问题33,34。此外，居中的液滴将便于后续使用显微镜对实验结果进行评估，因为整个板上的各液滴所需焦距将趋于一致。

4 角法的优势

四角法最主要的优点是其操作简便，能够最大限度地减少误差，并便于建立直接的自动化流程。例如，四个角溶液始终以相同的布局放置在液体处理设备的样品载台。此外，所有程序均基于各溶液之间的固定比例（图3C）。
我们更倾向于手动配制四个角溶液，而不是对高浓度、可能具有高黏度的溶液进行自动化处理。这样可以在大多数类型的液体处理设备上实现相对快速且准确的吸液和分液操作，同时对液体类别的优化要求最低。然而，某些角溶液可能仍然过于黏稠，导致采用常规液体系统的机器人难以高效运行。因此，我们选择使用正置换式液体处理设备（图3B）。

除了两种浓度的线性梯度外，还包含第三种组分（即，可在恒定浓度下以便捷的方式测试一系列缓冲液/添加剂。具体方法为：首先制备相对较大体积的核心角溶液组，其浓度适当提高，但不包含待调整的组分；然后加入含有该组分的储备液，以调节至最终浓度。例如，先制备50 mL的4种角溶液，其浓度比初始目标浓度高10%。随后将该核心溶液组均分为5个较小的子组，每组包含4种溶液。最后，向每个子组中分别加入体积比为10%的不同缓冲液-pH溶液。

4. 加性筛选的格式与类型

这些筛选板通常保存在 -20 °C（图4），因为它们不经常使用，且含有挥发性或不稳定的化合物。使用储存在深孔板（每孔1 mL）中的冷冻添加剂筛选板时，必须提前规划，因为所有添加剂溶液在室温下完全解冻需要12–24小时。此外，多个用户共用同一块添加剂筛选板，可能导致交叉污染问题。最后，深孔板的高度使其不适用于大多数纳升级分液器。为方便解决上述问题，应将筛选板从深孔板转移至低剖面板（图4）。

传统上，包含多种单一试剂（以单一浓度）的添加剂筛选方法非常流行35,36。然而，也已发展出其他类型的添加剂筛选方法，例如整合多种添加剂混合物37，或使用较少种类的单一添加剂但在不同浓度下进行测试38。最后，另一种互补的方法是研究添加剂在结晶前对样品的影响39,40。

5. 其他注意事项

良好实践： 大多数屏幕含有有害甚至有毒物质，因此在操作过程中必须采取适当的个人防护措施。同样，机器人运动部件可能导致伤害，尤其是在程序运行期间试图手动干预时（尽管大多数机器人配有紧急停止按钮/系统）。由于涉及技术复杂性，定期使用已表征的测试样品对机器人、屏幕和程序进行检查，对于保持高水平的可重复性至关重要。

通量： 作为参考，系统1每年可生产4,000至8,000块LMB平板（随后由用户用于初步筛选）。当预期使用量远低于此水平时，该系统不适合在10 °C下储存大量预填充的平板，因为在4-5个月后，部分条件会开始恶化并发生蒸发。针对小型至中型实验室，已实施多种不同的自动化方案41。

实验的保存与评估： 制备液滴后，将板置于温度严格控制在4或18 °C（最大偏差±0.5 °C）且振动极小的房间内的低振动架上保存。实验通过冷光源显微镜进行评估。目前市面上有多种自动成像系统可供选择，但需仔细考虑以下各个方面：扫描整块板所需的速度是否足以满足高通量需求？除晶体外的其他物体是否会干扰自动对焦？所获得的图像质量是否足以识别非常微小的晶体（尤其是在液滴边缘区域）？42,43,44

结晶条件的比较：在仔细研究最初获得的晶体性质后，可以利用LMB 筛选数据库或 C6 网络工具45分析不同条件之间的趋势与相似性。

披露

我们在此声明存在利益冲突，因为 LifeArc 公司对以下产品进行商业化：96 孔和 48 孔 MRC 板、MRC 悬滴密封垫、MORPHEUS、Pi、ANGSTROM 和 LMB 结晶筛选试剂盒。

致谢

MRC-LMB 结晶设施由英国医学研究理事会（Medical Research Council, UK）慷慨支持。我们感谢 LMB 各位成员的支持：Olga Perisic（PNAC）、Tony Warne、Fusinita Van den Ent 和 Pat Edwards（结构研究部）、Steve Scotcher 以及机械车间的其他成员、Neil Grant 和 Jo Westmoreland（视觉辅助部）、Paul Hart 和 Tom Pratt（信息技术部）。我们还要感谢 Steve Elliot（Tecan, UK）、Mitchell Stuart 和 Heather Ringrose（Hamilton Robotics, UK）、Paul Thaw、Robert Lewis 和 Joby Jenkins（TTP Labtech, UK）、Paul Reardon（Swissci AG, 瑞士）、George Stephens 和 Donald Ogg（Alphabiotech, UK）、Neil Williams（Markem Imaje, UK）以及 Graham Harris（The Cleveland Agency）提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
机器人
Freedom EVO®Tecann/a液体处理仪（系统1）。基于系统液体的吸液/分配功能，集成自动化转盘。EVOware plus 控制软件 v.2.4.12.0。 
Microlab® STAR™Hamiltonn/a液体处理仪（系统2）。基于正向置换原理（CO-RE™ 技术）进行吸液/分配。Hamilton STAR 控制软件 v.4.3.5.4785，配备方法管理界面。
Mosquito®TTP Labtechn/a基于微注射器的纳升级分液器，用于设置液滴（系统2及独立使用），3位板位。控制软件 v.3.11.0.1422。 
Dragonfly®TTP Labtechn/a基于注射器的液体处理仪，用于生成优化筛选条件（四角法）。控制软件 v.1.2.1.10196。 
粘性板封膜机Brandeln/a集成于系统1和系统2（也可作为独立机器人使用）。
喷墨打印机 9232Markem-Imajen/a集成于系统1。配备触摸屏界面。
结晶筛选试剂盒
Crystal Screen™ 1Hampton ResearchHR2-110结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01
Crystal Screen 2™Hampton ResearchHR2-112结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01
Wizard™ Classic 1Rigaku1009530结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02
Wizard™ Classic 2Rigaku1009531结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02
Grid Screen™ Ammonium SulfateHampton ResearchHR2-211结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ PEG/LiClHampton ResearchHR2-217结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Quick Screen™Hampton ResearchHR2-221结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ Sodium ChlorideHampton ResearchHR2-219结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ PEG 6000Hampton ResearchHR2-213结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
Grid Screen™ MPDHampton ResearchHR2-215结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
MemFac™Hampton ResearchHR2-114结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
PEG/Ion™Hampton ResearchHR2-126结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05
Natrix™Hampton ResearchHR2-116结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05
Crystal Screen Lite™Hampton ResearchHR2-128结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06
定制 Lite 筛选试剂盒Molecular Dimensions Ltdn/a结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06
Wizard™ Cryo 1Rigaku1009536结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07
Wizard™ Cryo 2Rigaku1009537结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07
JBS1JenaBioScienceCS-101L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS2JenaBioScienceCS-102L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS3JenaBioScienceCS-103L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS4JenaBioScienceCS-104L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS5JenaBioScienceCS-105L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS6JenaBioScienceCS-106L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS7JenaBioScienceCS-107L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS8JenaBioScienceCS-108L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS9JenaBioScienceCS-109L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
JBS10JenaBioScienceCS-110L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Index™Hampton ResearchHR2-144结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB13
SaltRX™ 1Hampton ResearchHR2-107结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14
SaltRX™ 2Hampton ResearchHR2-109结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14
MemStar™Molecular Dimensions LtdMD1-21结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15
MemSys™Molecular Dimensions LtdMD1-25结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15
JCSG-plus™ SuiteQiagen130720结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB16
MORPHEUS® 筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-46结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB17
Pi minimal 筛选试剂盒JenaBioScienceCS-127结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB18
Pi-PEG 筛选试剂盒JenaBioScienceCS-128结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB19
MORPHEUS® II 筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-91结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB20
LMB 结晶筛选试剂盒™Molecular Dimensions LtdMD1-98结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB21
添加剂筛选试剂盒
HT 添加剂筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-138冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。
MORPHEUS® 添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-93-500冷冻于96孔深孔板中（每孔500 µL）。
ANGSTROM 添加剂筛选试剂盒™ Molecular Dimensions LtdMD1-100冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。
MORPHEUS® 添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-93冷冻于96孔细胞培养 Costar® V型底板中（每孔100 µL）。
ANGSTROM 添加剂筛选试剂盒™ Molecular Dimensions LtdMD1-100-FX冷冻于96孔细胞培养 Costar® V型底板中（每孔100 µL）。
HIPPOCRATES 添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions Ltdn/a48种单一添加剂（来自 MORPHEUS® III 的药物化合物）。
其他耗材
96孔 MRC 双滴板SwissciMRC 96T-UVP坐滴法，蒸汽扩散板。推荐储液池体积：80  µL。有效液滴体积范围：10–1000 nL。可透紫外光。
48孔 MRC 单滴板 （“MAXI 板”）SwissciMMX01-UVP 坐滴法，蒸汽扩散板，用于放大/优化。推荐储液池体积：200  µL。有效液滴体积范围：0.1–10 µL。可透紫外光。
MRC 悬滴密封条Swisscin/a悬滴法，兼容 MRC 蒸汽扩散板（MRC 96T-UVP 和 MMX01-UVP）。可透紫外光和X射线。
粘性封口膜Hampton ResearchHR4-503英寸宽 Duck® HD Clear™，用于封膜仪和手动封口。
粘性铝箔片Beckman Coulter538619用于重新密封添加剂筛选板。
墨盒Markem-Imaje9651系统1（喷墨打印机）。
溶剂盒Markem-Imaje8652系统1（喷墨打印机）。
50 µL 吸头 Hamilton235947系统2（STAR™ 液体处理仪）。每盒6组，共1920个 CO-RE™ 吸头，一次性堆叠包装。
试剂容器Hamilton194052在添加剂筛选流程中用于向板中分配试剂条件。 
PCR 板Thermo Scientific™AB-2150系统2（用于盛装待转移至 Mosquito® 的蛋白）。Abgene Diamond ultra，384孔V型底。
微注射器TTP Labtech4150-03020Mosquito® 纳升级分液器用微注射器卷盘（共26,000支，间距9 mm）。
条带支架块TTP Labtech3019-05013Mosquito® 条带用SSB装置，又称“四通道试剂支架”。
2 µL 8孔条带TTP Labtech4150-03110用于 Mosquito® 工作台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积3.2 µL。
5 µL 8孔条带TTP Labtech4150-03100用于 Mosquito® 工作台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积7.5 µL。
5 mL 注射器TTP Labtech4150-07100Dragonfly® 液体处理仪用注射器本体及活塞。每包100个。
槽/储液槽TTP Labtech4150-07103用于 Dragonfly® 工作台上的储备溶液储存。每包50个。
轨道微孔板振荡器CamLab Limitedn/aVariomag®，用于单块板内条件混合（0–2000 rpm）。
微孔板混匀器TTP Labtech3121-01015MxOne。通过96个振动针实现单板内条件混合。

参考文献

  1. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  2. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  3. Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  4. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).
  5. Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
  6. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
  7. Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
  8. Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
  9. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  10. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
  11. Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
  12. Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
  13. Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
  14. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
  15. Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
  16. Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
  17. Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
  18. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  19. DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
  20. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
  21. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).
  22. Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).
  23. Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
  24. Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
  25. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
  26. Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
  27. Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
  28. Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
  29. Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
  30. Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
  31. Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
  32. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
  33. Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
  34. Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
  35. McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
  36. Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
  37. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
  38. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
  39. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
  40. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
  41. Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
  42. Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
  43. Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
  45. Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).

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