方法文章

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

DOI：

10.3791/55790

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2018年1月24日

 , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可在接近原子分辨率的水平上解析其晶体结构。然而，蛋白质、DNA、RNA及其复合物的结晶条件无法预先预测。采用多种不同的条件是提高获得优质衍射晶体几率的有效策略。英国剑桥医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）已开发出两套完全自动化的系统，可通过纳升液滴的蒸气扩散法，在1,920种初始条件下进行结晶筛选。此外，还建立了半自动化方案，通过调节试剂浓度、pH值或添加可能改善所得晶体性质的添加剂来优化结晶条件。本文将详细描述并简要讨论所有相关实验方案。综合而言，这些方法使得在多用户共享平台中能够便捷、高效地开展大分子结晶实验，同时使用户能够掌控实验中的关键参数。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X射线晶体学被广泛应用于深入理解生物及疾病机制的原子层面，并进而辅助基于理性设计的药物发现1。为此，需对纯化且浓缩（2–50 mg/mL）的蛋白质、DNA、RNA、其他配体及其复合物等大分子样品进行试验，以评估其通过结晶形成有序三维晶格的能力2,3,4。当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可解析出接近原子分辨率的晶体结构5,6。关键在于，新型样品的结晶条件无法预测，且高质量晶体的获得率通常极低。其根本原因之一在于，许多目标样品具有复杂的生化特性，导致其在相应的结晶时间尺度（通常为数天）内不稳定。最后，样品及其变体的制备耗时，以及纯化与结晶条件的优化过程，进一步延长了整体研究周期7,8。

结晶条件是指含有能够降低样品溶解度的沉淀剂的溶液，这些条件通常还包含缓冲液和添加剂。数百种此类试剂都非常适合用于调节结晶实验的参数，因为它们极少会干扰样品的完整性（例如蛋白质或核酸的去折叠）。尽管测试数百万种结晶试剂组合并不可行，但通过微型化实验和自动化方案，可以对若干至多种筛选试剂盒进行测试——这些试剂盒基于不同的设计策略9,10。从这一角度来看，最适用的技术可能是蒸汽扩散法，即将100–200 nL的液滴置于含有结晶条件溶液（25–250 µL）的储液槽上方的小孔中，该方法在专用的结晶板中实现11,12。在上层小孔中设置液滴时，通常将蛋白质样品与结晶条件溶液以1:1的比例混合，总体积为200 nL。机器人纳米级蛋白质结晶也可采用其他技术和板型实现，例如油下分批法13和脂质立方相法14（后者专门用于在水中溶解度极低的跨膜蛋白）。

英国医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）的结晶设施始于21世纪初，我们早期的自动化实验方案概述于2005年发表15。当时介绍了蛋白质结晶的历史背景，并概述了机器人纳升级方法的优势（该方法在当时是常规实验中的一种新颖手段）。由于大分子结晶本质上是一个随机过程，几乎不存在或仅有极少可用的先验信息，因此采用多种多样的（合适的）初始条件可提高获得高质量衍射晶体的几率16。此外，大规模初筛的一个常被忽视的优势在于，在许多情况下可显著减少后续对样品和晶体进行优化的需求。当然，在某些情况下仍需对部分初始条件进一步优化。通常，会系统地考察试剂浓度和pH值。也可在优化后的条件中引入更多试剂，以进一步调节结晶参数。当然，应尽量使用新鲜制备的样品进行结晶实验，因此相关实验方案必须简洁明了，并可随时获取和使用。

本文全面描述了在 MRC-LMB 设计的两套全自动系统（系统 1 和系统 2）及其相应的操作流程。这两套系统的主要应用是通过悬滴结晶板中的蒸气扩散法进行初步筛选。系统 1 集成了液体处理仪、用于储存板的自动转盘、用于板标记的喷墨打印机以及粘合式板封膜机。在系统 1 上，72 块 96 孔板被填充市售的筛选试剂盒（从试管中 10 mL 的起始体积向储液池转移 80 µL 条件溶液），随后进行标记和封膜。这些板随后储存在 10 °C 培养箱中，供用户随时取用（作为称为“LMB 板”的初步筛选板）。

系统2集成了液体处理仪、纳升级分液器和压敏板封膜机。在系统2上，通过将条件溶液与样品在20块预装有条件溶液的48孔或96孔板的上部孔中混合，生成用于蒸汽扩散实验的悬滴（100–1,000 nL）。这意味着当在系统2上使用20块LMB板时，可同时测试1,920个初筛条件。

机器人也被单独用于优化特定条件，相应的半自动化方案也有描述。常规采用四角法17进行优化筛选。该方案首先需要手动配制4种溶液（“A、B、C和D”）。随后，在结晶板的储液池中自动形成两种浓度的线性梯度（针对两种主要的结晶试剂）。为此，基于注射器的液体处理系统以不同比例分配这4种角溶液。

为进一步优化条件，可采用添加剂筛选方法，以增强所得晶体的性质18有两种方法可用于添加剂筛选：一种方法是在设置液滴前先将添加剂加入结晶板的储液池中（方案1）。 以及另一种将添加剂筛选直接分配到液滴上的方案（方案2）。

本文还介绍了在MRC-LMB为促进大分子自动化结晶而开发的其他实用技术。这些技术主要包括结晶板及相关装置，例如可堆叠的生物分子筛选学会（SBS）盖板，该盖板在使用系统2时可最大限度减少实验条件的蒸发。

为简洁起见，假设用户已熟悉纳升级分液器、喷墨打印机和粘性板封膜机的基本功能与维护。除非另有说明，机器人工作台上的板均放置于板架的后左角朝向位置，即A1孔（“A1角”）朝向板架的后左角。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 两种全自动系统（初步筛选）

  1. 系统1：制备72块含有筛选试剂盒（LMB板）的96孔结晶板
    1. 在执行操作前，确保系统的机器人已初始化且其控制软件已打开。在主程序启动前约30分钟，打开管路冷却载具的制冷机。
    2. 将测试板放置在板封膜仪的电动SBS载板架上。运行板封膜仪，检查封膜是否正确贴合。重复此测试两次，以确认板封膜仪已准备就绪。
    3. 然后，向液体处理仪的主容器中加入 20 L 去离子水。断开小容器（20% 乙醇冲洗液）的耦合接头，并将接头连接至主容器。
    4. 输入适当的屏幕名称（表1在喷墨打印机的触摸屏上点击。然后，打开并关闭转盘门以触发转盘旋转。当第一叠纸张出现时，打开门。
    5. 将第一个堆栈装满22块结晶板，每块板均以第1列朝外。以相同方式装满接下来的两个堆栈。
    6. 将剩余的6块板加载到第四层堆叠的最上方位置，然后关闭转盘门。
    7. 确认冷却器显示屏显示为 14 °C。轻轻反复倒置所选的筛选试剂盒 1 分钟。然后，打开液体处理仪的前面板。
    8. 打开管子，按照标准的96孔布局（A1、A2）将其放入冷却载体中 等等将每支试管放入载体后，将其管盖按相同的96孔布局放置在托盘上。
    9. 核对试管位置，确保所有试管在载体中水平且放置稳固。然后，关闭前面板。
    10. 在液体处理仪软件的“启动”窗口中，选择“运行维护”并打开冲洗程序。运行该程序以冲洗系统中的20%乙醇，并清洗液体分配吸头的外部。
    11. 冲洗完成后，单击“Cancel”返回“Startup”界面。选择“Run an existing process”，然后单击“Start your selection”。打开“MRC kit dispensing”程序，在配置界面中将“Instances”填写为“18”，并运行该程序。
    12. 在前四块板进行标记、加样和封膜时，需对系统进行监控。
    13. 当所有72块板均制备完毕并放回转盘后，将耦合插件从主容器转移至小容器。运行“启动冲洗”程序（见步骤1.1.10）。
    14. 关闭制冷机并丢弃空的筛选试剂盒管。小心地从转盘上取下72块已准备好的微孔板。丢弃填充错误或密封不良的微孔板。将可直接使用的微孔板储存于10 °C。
  2. 系统2：从单个样品在20块LMB板中设置结晶液滴（100 nL蛋白质 + 100 nL条件溶液）
    1. 首先，确保系统机器人已开启，纳升级分液器已初始化并打开其软件，同时液体处理仪的方法管理器也已打开。在主程序启动前约15分钟，打开微管冷却载台。
    2. 将测试板放置在板封膜机的电动SBS载板架上。运行板封膜机，确认板已正确封膜。重复测试板封膜机三次。
    3. 然后，运行纳升级分液器，在检测板上设置100 nL的测试溶液液滴。在显微镜下检查液滴是否正确放置。关闭纳升级分液器软件，并从仪器平台取出条带架模块。
    4. 接下来，将定制设计的板架插入（参见 代表性结果：在LMB开发的结晶装置）含有挥发性试剂相对含量最高的LMB板表1). 从培养板上移除粘性膜。
    5. 打开液体处理仪的前面板，将未密封的板放置在平台上的第一个滑动载架后部（为方便操作，可将滑动载架拉出）。
    6. 用SBS铝盖盖住板。通过轻轻按压盖子的对角，将盖子向载体的后左角方向固定。
    7. 打开密封，将板加载到滑动载体中，并以相同方式覆盖剩余的19块板，操作顺序为从挥发性最强到最弱的条件。当微型管冷却载体温度达到4 °C（由绿灯指示）时，取下其盖子。
    8. 切下含有（至少）440 µL 蛋白质样品的微量离心管管盖表2）。确保样品液面无泡沫，以免干扰液体检测系统。将试管放入微型离心管冷却架的1号位置。
    9. 将PCR板放置在液体处理仪工作台前方的板移动适配器载具前，然后关闭前面板。
    10. 加载托盘后，确保纳升级分液器托盘已离开条带支架模块，且50 µL吸头堆栈后部的托架已离开铝制SBS盖。
    11. 在液体处理仪的“方法管理”界面中，选择“设置板”。监控两个系统的初始化过程，并填写运行参数。遵循方法管理界面中的指南（提示、图示以及吸头管理系统将辅助准备工作）。
    12. 仔细检查所有必需组件是否已准备就绪，然后启动流程。
    13. 在纳升级分液器将液滴加入第一块板后，随即由板封仪对板进行封板，需全程监控系统。
    14. 当所有20块板均制备好结晶液滴并自动返回滑动载体后，打开前面板，轻轻取出板。在将板存放用于结晶之前，检查其密封是否正确。
    15. 使用20%乙醇溶液清洁SBS盖子，然后将其堆叠在液体处理仪左侧以供储存。丢弃PCR板和微量离心管。
    16. 关闭微型离心管冷却装置，并擦去冷凝水。在冷却表面放置一张纸巾以吸收后续产生的冷凝水。然后盖上载体盖板并关闭前面板。

2. 条件优化

  1. 基于注射器的液体处理装置：通过四角法在结晶板的储液池中生成两种浓度的线性梯度。
    1. 首先，确保液体处理仪已开机，并启动其配套软件完成初始化。
    2. 在“梯度”选项卡中：打开所需程序，选择结晶板类型以及储液池中的终体积（表3). 使用含异丙醇溶液时，应将“最大射流体积”高级设置从 6,000 降低至 3,000 > 10% v/v 和 [MPD] > 20% v/v
    3. 准备注射器。将活塞插入每个注射器内（尖端朝下），并将注射器尾部插入机器人头部下方指定的凹槽中。顺时针旋转注射器以锁定其位置（程序仅在所有必需的注射器正确安装后方可启动）。
    4. 准备槽体。取下不锈钢框架，插入槽体。左侧的4个位置对应4个角A、B、C、D。切换到“SET UP”选项卡，该选项卡显示每个注射器所需的溶液体积（在 表3，需在显示体积基础上增加0.5 mL死体积）。将各角的溶液倒入相应的槽中，并将框架放回工作台面上（框架通过工作台前端的两个小磁铁固定位置）。 执行此步骤的另一种方法是，当槽体已放置在平台上时，将溶液倒入槽中。
    5. 将结晶板放置在电动SBS载板架上。
    6. 点击“ASPIRATE”，等待该步骤完成（当活塞上升停止时）。
    7. 切换到“RUN”选项卡并运行程序。
    8. 程序结束后，返回“设置”选项卡并点击“移除”：系统将清除注射器中残留的溶液，然后将活塞完全上提。 可请求使用“PURGE”代替“REMOVE”；这将使活塞保持在底部位置，以便用同一注射器吸取更多溶液。
    9. 通过逆时针旋转移除注射器。
    10. 将注射器和槽体丢弃至适当的垃圾桶中（或用去离子水冲洗，再用20% v/v乙醇溶液冲洗后重复使用）。
    11. 密封培养板并置于微孔板振荡器中，以1,000 rpm振荡3分钟；若混合高黏度溶液，则振荡10分钟。培养板随后可用于纳米升移液器上的结晶液滴设置。
  2. 添加剂筛选方案1（在预装有添加剂筛选试剂的96孔结晶板中设置结晶液滴）
    1. 首先，配制试剂初始浓度提高10%的条件（使用液体处理仪将条件从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。
    2. 确保液体处理仪已准备就绪。打开“向单孔板中添加添加剂”程序（在储液槽中输入体积：“72 µL”）。 提示信息、图示和移液器吸头管理系统（需12盒1,000 µL吸头）有助于确保机器人根据所选设置准备就绪并正常运行。
    3. 从-20 °C冰箱中取出加性筛选板，立即使用板架移除其铝封膜，然后将板放置在液体处理仪的工作台上。 该程序按照纵向布局运行（将微孔板放置于载体上时，A1孔位于载体的前左方）。 同时将装有培养条件的容器放入。运行程序。
    4. 在微孔板的储液槽加满液体后，将其放入微孔板摇床并运行程序。用去离子水和20%乙醇冲洗condition容器，以备重复使用。
    5. 在纳升级分液器上设置液滴首先，打开结晶板的密封（使用板架）。然后，将结晶板和8孔蛋白条带放置于条带架模块的第一个位置。 控制软件中的“设置”选项卡显示了甲板上各个组件的实际位置. 根据所需的液滴大小，向条带的每个孔中加入蛋白样品（表4). 运行程序以制备液滴。
    6. 程序结束后，立即从仪器平台中取出培养板并密封（使用培养板封膜机或3英寸宽的压敏胶带）。将移除的封条丢弃至指定垃圾桶中。
    7. 在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状及居中情况。
  3. 添加剂筛选方案2（使用可重复利用的添加剂筛选试剂盒在96孔结晶板中设置结晶液滴）
    1. 首先，准备添加剂筛选板：将相应的冷冻96孔细胞培养板在室温下解冻40分钟。然后，在1,000 × g离心2分钟。
    2. 准备条件培养基（使用液体处理仪将培养基从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。
    3. 向96孔结晶板的储液池中加入条件溶液。在液体处理仪上操作步骤与方案1的2.2.2步骤相同，但在设置储液池体积时输入“80 µL”。
    4. 在纳升级分液仪上设置液滴，将甲板上的三个组分放置到位（包含添加剂筛选板、结晶板，以及位于条带固定块第一位置的8孔蛋白条带） 表 4).
    5. 用铝箔密封含有筛选样本的细胞培养板，并将其放回 -20 °C 培养箱中。
    6. 在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状及居中情况。

结果

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1. 系统1和LMB平板

图1A展示了基于液体处理仪的系统1，该系统使用液体系统（去离子水）运行。液体系统包括一个容器、一个泵、管路、8个配备阀门的注射器以及8个固定的吸头。液体类型设置已优化，可吸取/分配多种溶液，并向4块板进行多次分配（多次分配需要相对较大的吸取体积余量）。系统下方放置一个22 L的水箱和一个较小的5 L容器（含20 % v/v乙醇），用于为液体系统供液。每个容器均配有两根连接接头：一个接头（蓝色）向系统供液，另一个（红色）用于回流，以降低过压。使用后，先用水冲洗，再用20% v/v乙醇溶液冲洗，以防止微生物生长。一个冷却单元（也位于系统下方）连接至定制的管路冷却支架。系统1的宽度为2050 mm（含转盘），深度为760 mm，高度为88 mm。前方还需额外550 mm空间，用于放置喷墨打印机控制单元和粘合板封膜机的工作台。系统旁边还需预留空间放置控制用PC。生成72块预填充板（即 18轮，每轮4块板）的程序耗时3小时50分钟。

图1B 是主工作台的特写，配备有安装在自动移液臂上的8个固定吸头（图1C）、一个带夹持器的第二机械臂、吸头清洗站、两个4位SBS板载架以及管冷却载架。主程序一次处理4块板，这些板从转盘中自动取出并放置到工作台上，在此处加入结晶条件（储液池中加入80 µL，图1D）。由于吸头具有导电性，液面高度可被自动检测。当液体处理仪向一组板中分配条件时，另一组空板从转盘中取出，进行标记后放置到主工作台上。为将打印机喷头及其传感器安装在主工作台后方，需在液体处理仪后板上定制一个小型支架和开窗。每次分配步骤完成后（即在相应列的储液池中分配4份样品后），8个吸头会从主容器中用水冲洗并清洗。当4块板填充完毕后，系统会自动密封并将它们放回转盘中的原始位置。板封膜动作由特定驱动器触发（由控制软件调用）。封膜装置使用3英寸宽的压敏胶带，通过滚轮在机械压力下将其贴附到板上。程序完成后，预填充的板从转盘堆栈中手动取出，并储存于实验室内配备的10 °C培养箱中。

用于样本处理和分析的自动化液体处理系统，包括移液和微孔板设置。
图1：用初始筛选试剂盒填充储液槽。（A）全自动系统1的概览。转盘是一个独立的自动化单元，带有板堆栈，安装在主甲板右侧由透明丙烯酸板制成的凹槽内。（B）液体处理仪主甲板运行状态，其中（a）为管冷却载体（连接至下方制冷单元，未显示），（b）为快速清洗站（连接至排水系统，未显示），（c）为移液臂正在向96孔结晶板的8个储液槽中加液，（d）为夹持臂将已填充的板转移至（e）板封膜机的电动SBS载体上。甲板后方为（f）喷墨打印机的打印头，连接至封膜机下方的（g）喷墨控制单元。（C）一块已标记的板（筛选名称和生产日期），正由8个由聚四氟乙烯涂层不锈钢制成的导电固定针头填充结晶条件。（D）密封后的结晶孔截面图。储液槽中含有80 µL结晶条件溶液（上部孔为空）。储液槽和上孔的深度规格以毫米为单位。请点击此处查看该图的放大版本。

表1列出了市售筛选试剂盒在试管中的不同配方。这些试剂盒用于定期通过系统1向96孔结晶板（LMB01-LMB22）的储液池中加样。

板名称试剂盒名称供应商目录编号管数基本描述
LMB01Crystal Screen 1Hampton ResearchHR2-11048稀疏矩阵（pH 4.6–8.5）
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-11248随机取样（pH 4.6–9.0）
LMB02Wizard 1Rigaku100953048随机取样（pH 4.5–10.5）
Wizard 2Rigaku100953148随机取样（pH 4.5–10.5）
LMB03Grid Screen Ammonium SulfateHampton ResearchHR2-21124网格筛选，[硫酸铵] = 0.8–3.2 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
Grid Screen PEG/LiClHampton ResearchHR2-21724网格筛选，[PEG 6000] = 0–30 %w/v，LiCl 浓度 = 1.0 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
Quick ScreenHampton ResearchHR2-22124网格筛选，[NaKPO4] = 0.8–1.8 M，pH 5.0–8.2
Grid Screen Sodium ChlorideHampton ResearchHR2-21924网格筛选，[NaCl] = 1.0–4.0 M，缓冲液 pH 4.0–9.0
LMB04Grid Screen PEG 6000Hampton ResearchHR2-21324网格筛选，[PEG 6000] = 5–30 %w/v，缓冲液 pH 4.0–9.0
Grid Screen MPDHampton ResearchHR2-21524网格筛选，[MPD] = 10–65 %w/v，缓冲液 pH 4.0–9.0
MemFacHampton ResearchHR2-11448膜蛋白稀疏矩阵（pH 4.6–8.5）
LMB05PEG-IonHampton ResearchHR2-12648网格筛选，[PEG 3350] = 20 %w/v，多种盐类浓度为 0.2 M（无缓冲液）
NatrixHampton ResearchHR2-11648不完全因子设计（pH 5.6–8.5）
LMB06Crystal Screen LiteHampton ResearchHR2-12848Crystal Screen 1 的沉淀剂浓度减半
Custom Lite screenMolecular Dimensionsn/a48低沉淀剂浓度的附加条件
LMB07Wizard Cryo 1Rigaku100953648使用低分子量 PEG 作为冷冻保护剂的随机取样条件（pH 4.5–9.4）
Wizard Cryo 2Rigaku100953748使用低分子量 PEG 作为冷冻保护剂的随机取样条件（pH 4.5–10.1）
LMB08JBS1JenaBioScienceCS-101L24基于多种 PEG 的不完全因子设计（pH 4.6–9.0）
JBS2JenaBioScienceCS-102L24基于 PEG 4000 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS3JenaBioScienceCS-103L24基于 PEG 4000 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS4JenaBioScienceCS-104L24基于中等分子量 PEG 的不完全因子设计（pH 6.5–8.5）
LMB09JBS5JenaBioScienceCS-105L24基于高分子量 PEG 的不完全因子设计（pH 6.5–9.5）
JBS6JenaBioScienceCS-106L24基于硫酸铵的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS7JenaBioScienceCS-107L24基于 MPD 的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS8JenaBioScienceCS-108L24基于 MPD 和乙醇的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
LMB10JBS9JenaBioScienceCS-109L24基于常见盐类和 2-丙醇的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
JBS10JenaBioScienceCS-110L24基于常见盐类的不完全因子设计（pH 4.6–8.5）
Clear Strategy Screen 1 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB11Clear Strategy Screen 1 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 1 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB12Clear Strategy Screen 2 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
Clear Strategy Screen 2 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24含多种 PEG 的网格筛选
LMB13IndexHampton ResearchHR2-14496小型稀疏矩阵和网格筛选（pH 3.0–9.0）
LMB14SaltRX 1Hampton ResearchHR2-10748包含 22 种不同盐类的网格筛选，考察盐浓度与 pH（4.1–9.0）的影响
SaltRX 2Hampton ResearchHR2-10948包含 22 种不同盐类的网格筛选，考察盐浓度与 pH（4.1–9.0）的影响
LMB15MemStartMolecular DimensionsMD1-2148膜蛋白稀疏矩阵（pH 4.0–10.0）
MemSysMolecular DimensionsMD1-2548膜蛋白网格筛选（主要含 PEG，pH 3.5–9.5）
LMB16JCSG+Qiagen13072096稀疏矩阵（pH 4.0–10.0）
LMB17MORPHEUS screenMolecular DimensionsMD1-4696包含添加剂混合物及冷冻保护条件的网格筛选（pH 6.5–8.5）
LMB18Pi minimal screenJenaBioScienceCS-12796不完全因子设计（pH 4.0–9.5）
LMB19Pi-PEG screenJenaBioScienceCS-12896膜蛋白的不完全因子设计（pH 4.8–8.8）
LMB20MORPHEUS II screenMolecular DimensionsMD1-9196包含添加剂混合物（重原子）及冷冻保护条件的网格筛选（pH 6.5–8.5）
LMB21LMB crystallization screenMolecular DimensionsMD1-9896稀疏矩阵，包含从 LMB 出版物中筛选出的条件
LMB22MORPHEUS III screenMolecular Dimensionsn/a96包含添加剂混合物（药物化合物）及冷冻保护条件的网格筛选（pH 6.5–8.5）

表1：LMB平板中所含试剂盒的配方。每种商用筛选试剂盒最初包含24/48/96种条件，置于试管中。LMB平板存放于实验室内配备的10 °C培养箱中，供用户随时取用。

系统2及液滴制备的要求

图2A展示了基于液体处理仪19的系统2，该仪器采用正置换原理并使用一次性吸头。一次性吸头以可堆叠的架子形式提供，适用于自动化操作。一个三工位纳升级分液器20被集成在系统的右侧。纳升级分液器的吸液/分液操作同样采用正置换原理，并使用一次性微量注射器（以大卷形式提供）。作为独立运行的机器人时，通过可拆卸的条带架模块来加载蛋白质样品；在全自动流程中，则用384孔PCR板替代条带架。系统左侧集成了与系统1类似的粘性板封膜仪。封膜仪和纳升级分液器安装在定制的抬高工作台上，以便主机械臂能够触及这两个集成机器人的板载体（为使机械臂能从主平台外部进入，在液体处理仪两侧面板上均切割了窗口）。主程序会在适当时机调用特定驱动程序，以触发纳升级分液程序和封膜操作。系统2的尺寸为宽2,850 mm、深800 mm、高800 mm。机器人旁边需预留额外空间用于放置控制用PC的显示器。系统下方设有两个废液箱，分别用于收集实验过程中丢弃的吸头和微量注射器（控制用PC也放置在下方）。系统2的一个重要特点是整体布局设计，保留了对三个机器人的便捷访问，使得它们可单独用于前述的优化实验方案，或其他文献中描述的实验方案，例如在脂质介相中进行膜蛋白结晶21以及随机微晶种基质筛选22。

图2B 是配备单个机械臂的平台的特写。该机械臂集成了12个独立的移液探针和主夹持器。探针的位置可在单一方向上独立控制，以便接触探针轴线上不同位置，甚至单个管子。探针可吸取一次性吸头（1-12）或一对用于移动板的适配器。初始装载两组各含50 µL一次性吸头的4层堆栈。由于吸头具有导电性，系统可自动检测液面。板移动适配器内侧设计有两个尖针，可在需要时形成可选的夹持结构。主平台上设有一个24位微管冷却载体，用于放置样品，但此处仅使用1-2个位置。此外，还设有PCR板载体，以及两个用于可堆叠的定制SBS盖板的储存载体（图2C）。最后，设有4个滑动载体，每个载体有5个位置用于放置结晶板（4 × 5 = 20块板）。

Automated liquid handling for DNA/RNA extraction; visual setup, lab equipment, pipetting system.
图2：设置用于蒸气扩散实验的液滴。（A）全自动系统2的概览。 (B) 正在运行中的液体处理仪主平台（aSBS盖板堆叠用储存架b可堆叠吸头，（c) 带有微管样品的冷却载体，(d）用于两个平板移动适配器的载体，（e) 将蛋白质转移至纳升级液体处理机器人的PCR板，(f) 9个已放回初始位置的密封平板，(g可选的夹持器移除10的SBS盖th 平板即将被运送至液体处理仪的加样平台，（h接下来的10个培养板需准备好并盖上SBS板盖，（i用于转运PCR板和结晶板的主要夹持器，（j）集成了12个移液探针（其中2个可选作抓取器使用）以及主抓取器的主要自动化机械臂，以及（k纳升级分液仪的加样平台。C) 自制定制型铝制SBS板盖。板盖集成橡胶垫以防止溶液蒸发，并设有两个小孔，便于选配的机械抓手精确抓取。D) 密封结晶孔的横截面示意图，其中储液池内充满一种结晶条件溶液，上孔中含有由蛋白质样品与该条件溶液混合形成的液滴。由于液滴中的沉淀剂浓度低于储液池中的浓度，因此在蒸气扩散平衡过程中，液滴中的水分逐渐流失（以箭头示意性表示），导致液滴内所有组分的浓度逐渐升高。E100 nL 的光学显微照片及（F使用纳升移液器将200 nL测试溶液（20% v/v 聚乙二醇400，0.001% w/v 红色染料藏红O）分配成液滴。液滴的大小和形状可能因溶液的理化性质不同而有所变化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

主程序首先由可选机械手将SBS盖板从第一块结晶板上移除。盖板转移至相应的储存载体后，结晶板被运送至纳升级分液仪的工作台。随后，移液臂将所需量的样品从通常冷藏的微量离心管转移至PCR板的第一列。接着，主机械手将PCR板移至纳升级分液仪的工作台上，分液仪将根据用户初始设定的参数（例如 液滴大小）制备液滴。具体操作中，先将蛋白样品通过一组8个微量注射器以多通道分液方式加入上排孔中，随后将结晶条件溶液分加至各蛋白液滴上（为避免交叉污染，每行需使用8支新的微量注射器）。完成液滴设置程序后，主机械手将相应的板转移至板封仪进行封板，然后将PCR板放回原位（下一循环中将在PCR板的下一列继续加入蛋白样品）。最后，已封板的结晶板被移回工作台上的原始位置：此时该板中的蒸气扩散实验已经启动（图2D）。此循环根据板的数量重复进行。必要时，可选机械手会移走空的吸头架，以便移液臂获取更多吸头。该程序耗时2小时20分钟，使用440 µL样品，在20块板上制备单个液滴，每孔加入100 nL样品 + 100 nL条件溶液（图2E 和 2F）。

当使用纳升级分液器作为独立机器人处理另外两块板时（参见方案，步骤1.2.3），可设置10°C培养箱中所有可用的初始筛选板（22块LMB板 × 96种条件 = 2,112种条件）。

表2 显示了根据用户在系统2上的选择，主程序所需满足的要求。

板数液滴体积 (nL)样品吸头要求耗时
数量类型体积 1 (µL)体积 2 (µL)50 µL 吸头微量注射器
1096孔板10024008010401 小时 12 分钟
2096孔板100440016020802 小时 20 分钟
1096孔板10024024016020801 小时 45 分钟
2096孔板10044044032041603 小时 05 分钟
1048孔板10006240805601 小时 10 分钟
2048孔板10001208016011202 小时 16 分钟

表2：系统2上用于设置结晶液滴的主要程序选项示例。 所需蛋白样品量、枪头和微量注射器的数量根据程序而异。样品体积“vol. 1”（液滴1）和“vol. 2”（液滴2）的计算方法如下：（PCR板每孔所需体积 × 8个枪头 + 4 µL损失体积）× 结晶板数量 + 微管中死体积40 µL。对于96孔结晶板中100 nL液滴，PCR板每孔所需体积为2 µL；而对于48孔板中1,000 nL液滴，每孔需6.8 µL（PCR板孔内死体积为0.8 µL）。此外还需考虑额外的样品体积（“损失体积”），以补偿微管中的蒸发及其他损耗（如样品黏附在枪头上）。例如，进行20块MRC板、100 nL、单液滴实验时，所需样品体积为：(8 × 2 + 4) × 20 + 40 = 440 µL即，相当于每板22 µL）。每个样品和每块板需要8个一次性50 µL吸头。例如，对于10块板、两滴加样程序，所需吸头数量为8 × 10 × 2 = 160个吸头。微移液管数量的计算方法如下：（8 + 每板条件数）× 样品数 × 板数。例如，对于10块48孔板，所需液体处理吸头数量为：（8 + 48）× 1 × 10 = 560个吸头。

3. 四角溶液的配制、准备与处理

两种形式的四角溶液（“A、B、C 和 D”）及相应的优化筛选实验（图 3A）均由一个 Excel 电子表格 自动生成。针对不同数量的条件——主要是 24、48 和 96 种条件——分别有对应的电子表格，此外还有可在单个板上制备两种不同优化筛选实验的电子表格。通常情况下，会先在试管中配制一组 4 × 10 mL 的四角溶液，由此可制备 2 至 3 次优化筛选实验，具体数量取决于所需条件的数量和体积。这些溶液被倒入储液槽中，随后由基于注射器的液体处理系统吸取，并直接分配到板孔中（图 3B）。两种浓度的线性梯度是通过以系统性变化的比例混合 A、B、C 和 D 四种溶液而形成的（图 3C）。

使用自动化液体处理机器人和数据表进行微孔板检测，用于高通量筛选。
图3：用于制备优化筛选实验的四角法。（A）96孔板布局中两种浓度梯度的示意图。（B）基于注射器的液体处理装置，已准备就绪，机器人头部插入了4个注射器。一个结晶板放置在电动SBS载板架上，四种起始溶液（A、B、C和D）已分别加入各自的槽中（为演示目的，溶液被染成红色）。（C）96个储液槽中溶液A、B、C和D的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

表3 显示了基于注射器的液体处理设备上用户可用程序的各项要求。

板类型条件数板内体积（储液槽，µL）槽内体积（mL）持续时间
96孔板48801.62 分 5 秒
96孔板96802.53 分 50 秒
96孔板2 × 48801.62 分 50 秒
48孔板242001.82 分 25 秒
48孔板4820034 分 20 秒

表3：基于注射器的液体处理系统上用于根据四角法配制优化筛选实验的可用程序。 可使用96孔板配制96个或48个条件的优化筛选实验（当同时配制两个48个条件的筛选实验时，机器人必须配备8个注射器和8个储液槽）。其他程序支持使用48孔板。储液槽中所列体积已包含所需的死体积（0.5 mL）。

4. 添加剂筛选

图4展示了进行添加剂筛选的步骤，起始材料可为已加入结晶板储液池中的96种添加剂溶液（方案1），或加入低剖面细胞培养板孔中的添加剂溶液，该培养板用作可重复使用的添加剂筛选板（方案2）。表4列出了纳米升移液器上针对两种类型方案可用的程序。

结晶实验流程示意图：深孔块、96孔板、蒸气扩散法。
图4：两种添加剂筛选实验流程。 96种添加剂筛选试剂保存于-20 °C。按照方案1，首先将添加剂筛选试剂加入结晶板的储液池中（理想情况下应预先配制好）。使用液体处理仪或多通道移液器将条件溶液加入含有添加剂溶液的储液池中（添加剂筛选试剂体积占储液池终体积的10%：终体积为80 µL时，加入8 µL）。在微孔板混合器上混匀各条件（图中未显示）后，使用基于微注射器的纳升级分液仪设置液滴（表4）。按照方案2，添加剂筛选试剂仅在后续设置结晶液滴时才加入。此时，纳升级分液仪在其工作台上使用额外的组分（即含有添加剂筛选试剂的可重复使用细胞培养板）来制备液滴。请点击此处查看该图的放大版本。

实验方案液滴体积 (nL)试纸类型样品体积 (µL)微型注射器数量持续时间
类型添加剂来源蛋白质条件添加剂每孔（试纸）总计
196孔结晶板10010002 µL2161042 分钟
196孔结晶板20020005 µL3.8311042分10秒
296孔细胞培养板2002001005 µL3.8312003分45秒
296孔细胞培养板5005001005 µL7.4602004分15秒

表4：基于微量注射器的纳升级分液器上可用于添加剂筛选的程序。 8孔条带中每个孔所需的样品体积计算如下：死体积 + 12 × 液滴体积。有两种类型的条带（2 µL 和 5 µL）。2 µL 孔的死体积为 0.8 µL（实际最大容量为 3.2 µL），5 µL 孔的死体积为 1.4 µL（最大容量为 7.5 µL）。所需蛋白质总体积为：8 × 条带中每孔体积（向上取整）。96孔细胞培养板V型孔的死体积为2.5 µL。所需微量注射器的数量根据所选程序而定（8 + 96 = 104；或 8 + 2 × 96 = 200）。

由于在方案1中，条件溶液会因添加物的加入而被稀释，因此需要将其初始浓度按比例配制得更高。最终浓度的增加可通过减少最终加水量至计算所得终体积来最简便地实现。此后，只需按常规操作进行液滴的制备，使条件溶液与样品混合即可例如，100 nL 蛋白质 + 100 nL 已加入添加剂的条件溶液）。方案 2（例如，200 nL 蛋白 + 200 nL 条件溶液 + 100 nL 添加剂）通过简单调整所添加添加剂筛选溶液的体积，即可实现对不同浓度添加剂的筛选。方案 2 会导致液滴发生不同程度的稀释（可能影响结晶）。

系统2中的液体处理仪可使用12个吸头吸取足够的溶液，并将其分装到96孔板的储液槽中（共8份，参见方案，步骤2.2.2），尽管此步骤当然也可使用多通道移液器手动完成（图4）。使用液体处理仪时，可同时向多个孔板加入相同的溶液（以便后续测试不同的添加剂筛选条件）。当准备2块孔板时，需向试剂容器中加入至少23 mL溶液；当准备3块孔板时，需加入至少31 mL溶液。

5. 结晶板及相关设备

两种MRC坐滴式蒸气扩散结晶板（96孔双滴和48孔单滴，图5A 和 图5B）的设计具有可实现可靠且高效的自动化结晶实验的特性，尤其是上层孔的球形结构以及储液池轻微的V形设计，有利于精确加样，同时在需要将液滴居中时也可进行离心操作。此外，上层孔具有透镜效应，可在体视显微镜下实现最佳照明（该聚合物可透射紫外光，用于检测紫外吸收性或荧光性晶体23）。

一种定制密封件（图5C）可实现使用纳升级液体分配仪在两种类型的板上设置悬滴结晶实验（方案未展示）。最后，这两种MRC板具有相同的外部尺寸和边缘。该边缘可嵌入我们自行设计的板架凹槽中（图5D），用于手动粘贴或移除密封胶带时防止液体飞溅。

用于实验室实验的微孔板设计与设置；显示测量、盖子和夹紧系统。
图 5：LMB 开发的 MRC 结晶板及相关装置。（A）96 孔板的 A1 角。储液池（椭圆形）位于结晶孔的左侧，右侧为两个球形上孔。尺寸单位为毫米。（B）48 孔板的 A1 角。储液池位于孔的右侧（仅一个较大的上孔）。（C）MRC 悬滴密封条。（D）实验室自制的板架。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 蛋白质晶体

图6展示了采用我们自动化方案获得的有用晶体的示例。

结晶过程示意图，以及在不同放大倍数下观察到的蛋白质晶体显微镜图像。
图6：采用自动化方案获得的含晶体液滴的光学显微图像。（A、B）通过两种完全自动化的系统制备的OmpF和MreB在初筛板中形成的晶体（参见方案部分1.1和1.2；条件分别为LMB07 A4孔和LMB20 D12孔；液滴体积为100 nL蛋白溶液 + 100 nL筛选条件溶液；Andrzej Szewczak，LMB的研究工作）24。（C、D）Bar结构域晶体在使用四角法优化初始条件前后的对比图像（步骤2.1；LMB02 B6孔；1,000 nL + 1,000 nL；Leonardo Almeida-Souza，LMB未发表工作）。（E、F）人源动力蛋白1 N端结构域重链晶体在使用四角法优化初始条件前后的对比图像（LMB20 E6孔；初始为200 nL + 200 nL，后调整为500 nL + 500 nL；Edgar Morales-Ríos，LMB未发表工作）。（G、H）补体因子D晶体在通过添加剂筛选优化条件前后的对比图像（步骤2.2；初始条件来自实验室自定义筛选板；200 nL + 200 nL；添加剂D6来自96种条件的添加剂筛选板；Matthias Bauer，LMB未发表工作）。（I、J）病毒包膜糖蛋白25晶体在通过添加剂筛选优化条件前后的对比图像（步骤2.3；LMB20 A2孔；初始为150 nL + 150 nL，后调整为200 nL + 200 nL + 100 nL添加剂E5，来自96种条件的添加剂筛选板；Yorgo Modis，英国剑桥大学未发表工作）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- 准备和使用储存在平板中的初始筛选样品

在将筛选试剂盒中的溶液分装到板孔之前，应先进行混匀，因为在储存过程中，某些管内的溶液可能出现轻微沉淀或相分离现象。当筛选实验包含两个试剂盒（2 × 48 管）时，第二个试剂盒的第一管应放置在冷却载体的 E1 位置。当筛选实验包含四个试剂盒（4 × 24 管）时，第二个试剂盒的第一管放置在 C1 位置，第三个试剂盒的第一管放置在 E1 位置，第四个试剂盒的第一管放置在 G1 位置。在将各管插入冷却载体的同时，管盖应按照标准的 96 孔横向布局放置在托盘上。由于制造商通常在管盖顶部标注了孔位编号，此操作可便于核对所有管子是否按正确顺序放置。此外，在仅需填充较少数量的板时，该方法也有助于将正确的管盖重新盖回对应的管子上。

我们将预装好的板存放在10 °C，这一温度可避免结冰，同时避免在4 °C储存可能导致的条件恶化和密封问题。这些板通常可储存数月，密封膜内表面一般不会出现明显冷凝。但对于LMB05、LMB06、LMB09和LMB10板而言，此情况较不理想，因为这些板含有较高浓度挥发性试剂的条件（表1）。密封膜内侧出现少量冷凝会降低密封效率，并在打开板时导致孔间交叉污染。为帮助防止初始冷却过程中产生冷凝，可先将板从转盘转移到一个隔热的便携式冷藏箱中，并在4 °C冷藏室中过夜。这种极缓慢的冷却过程可最大程度减少密封孔内温度梯度的形成，从而整体上减少冷凝15。此外，当板存放在10 °C培养箱中后，会在每叠板的顶部加盖一个实验室自制的SBS聚苯乙烯盖（未示出）。

我们所有预填充的试剂板可作为一个大型初筛体系，用于针对一种新的水溶性蛋白质样品进行筛选。或者，也可选择较少数量的试剂板以满足特定需求。例如，LMB15 和 LMB19 是专为膜蛋白样品设计的筛选试剂板26,27，而 LMB20 则是含有重原子的筛选体系，有助于衍射数据的实验相位解析28（另见：MORPHEUS 蛋白质结晶筛选试剂的配制）。

2. 设置结晶液滴

使用系统2时，应优先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。这可以避免在SBS盖板的橡胶部分形成冷凝水，从而影响盖板操作和板的密封。SBS盖板在板顶部有一定间隙，因此需要先进行对齐（参见方案，步骤1.2.6）。PCR板孔中蛋白质的最小残留体积相对较大（0.8 µL，见表2图注）。需要注意的是，当单独使用纳升级分液器配合8联排管中的蛋白质进行操作时，也采用了同样较大的最小残留体积（表4）。虽然更小的残留体积可能可行，但某些样品会黏附在吸头表面、机器人校准可能略微不准确、室温可能高于常规等情况等，均可能导致样品损失，而较大的最小残留体积可弥补这些损失，从而确保方法的稳健性。

最近的技术进展使得实验的进一步微型化成为可能，因此通过整合相应技术，筛选结晶条件所需的样品体积可显著减少29,30。然而，进一步微型化的一些方面需要仔细考虑，例如液滴的蒸发31和微晶的操作32。

最后，在设置结晶液滴（位于球形上孔中）时，可将离心步骤（2,000 rpm，1 分钟）作为常规的最终操作纳入流程。离心产生的液滴在大小和形状上更为均一，有助于减少重复性问题33,34。此外，居中的液滴将便于后续使用显微镜对实验进行观察，因为整个孔板的所需焦距将趋于一致。

4 角法的优势

四角法最主要的优点是其操作简便，可最大限度减少误差，并便于实现标准化的自动化操作流程。例如，四角溶液在液体处理设备的载具上始终按照相同的布局放置。此外，所有程序均基于溶液之间的固定比例（图3C）。
四角溶液的手工配制优于对高浓度溶液进行自动化操作，因为高浓度溶液通常黏度过高。通过手工方式配制后，可在大多数类型的液体处理设备上实现相对快速且准确的吸液和分液操作，同时对液体类别的优化要求降至最低。然而，某些角溶液的黏度仍可能过高，导致采用常规液体系统的机器人难以高效运行。因此，我们选择了采用正向置换原理的液体处理设备（图3B）。

除了两种浓度的线性梯度外，还需加入第三种组分（即，可在恒定浓度下以便捷的方式测试一系列缓冲液/添加剂。具体方法为：首先配制相对较大体积的核心角溶液组，其浓度适当提高，但不包含待调整的组分；然后加入含有该组分的储备液，以调节至最终所需浓度。例如，先配制50 mL的4种角溶液，其浓度比初始目标浓度高10%。随后将该核心溶液组均分为5个较小的子组，每组包含4种溶液。最后，向每个子组中分别加入体积占比10%的不同缓冲液-pH溶液。

4. 加性筛选的格式与类型

这些筛选板通常保存在 -20 °C（图4），因为它们不经常使用，且含有挥发性或不稳定的化合物。使用储存在深孔板（每孔1 mL）中的冷冻添加剂筛选板时，必须提前规划，因为所有添加剂溶液在室温下完全解冻需要12–24小时。此外，多个用户共用同一块添加剂筛选板，可能导致交叉污染问题。最后，深孔板的高度使其不适用于大多数纳升级分液器。为方便解决上述问题，应将筛选板从深孔板转移至低剖面板（图4）。

传统上，包含多种单一试剂（以单一浓度）的添加剂筛选方法非常流行35,36。然而，其他类型的添加剂筛选方法也已发展出来，包括使用添加剂混合物37，或使用较少种类但以不同浓度存在的单一添加剂38。最后，另一种互补的方法是研究添加剂在结晶前对样品的影响39,40。

5. 其他注意事项

良好实践：大多数屏幕含有有害甚至有毒物质，因此在操作过程中必须采取适当的个人防护措施。同样，机器人的运动部件可能导致伤害，尤其是在程序运行时尝试手动干预的情况下（尽管大多数机器人配有紧急停止按钮/系统）。由于涉及的技术较为复杂，定期使用已知特性的测试样本对机器人、屏幕和程序进行检查，对于持续保持高水平的可重复性至关重要。

通量： 作为参考，系统1每年可生产4,000至8,000块LMB平板（随后由用户用于初步筛选）。当预期使用量远低于此水平时，该系统不适合在10 °C下储存大量预填充的平板，因为在4-5个月后，部分条件会开始恶化并发生蒸发。针对小型至中型实验室，已实施多种不同的自动化方案41。

实验的保存与评估：制备液滴后，将板置于温度严格控制在4或18 °C（最大偏差±0.5 °C）且振动极小的房间内的低振动架上保存。实验通过冷光源显微镜进行评估。目前市面上有多种自动成像系统可供选择，但需仔细考虑以下各个方面：扫描整块板所需的速度是否足以满足高通量需求？除晶体外的其他物体是否会干扰自动对焦？所获得的图像质量是否足以识别非常微小的晶体（尤其是在液滴边缘区域）？42,43,44

结晶条件的比较：在仔细研究最初获得的晶体性质后，可以利用LMB 筛选数据库或 C6 网络工具45分析不同条件之间的趋势与相似性。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们在此声明存在利益冲突，因为 LifeArc 正在商业化以下产品：96 孔和 48 孔 MRC 板、MRC 悬滴密封垫、MORPHEUS、Pi、ANGSTROM 和 LMB 结晶筛选试剂盒。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The MRC-LMB crystallization facility is kindly supported by the Medical Research Council (UK). We thank members of the LMB for their support: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent and Pat Edwards (Structural Studies), Steve Scotcher and the other members of the Mechanical Workshop, Neil Grant and Jo Westmoreland (Visual Aids), Paul Hart and Tom Pratt (IT). We also would like to thank to Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart and Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis and Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Switzerland), George Stephens and Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) and Graham Harris (The Cleveland Agency) for technical help.

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
机器人
Freedom EVO®Tecann/a液体处理仪（系统1）。基于系统液体的吸液/分配功能，集成自动转盘。控制软件为EVOware plus v.2.4.12.0。 
Microlab® STAR™Hamiltonn/a液体处理仪（系统2），基于正向置换原理（CO-RE™ 技术）。控制软件为Hamilton STAR v.4.3.5.4785，配备方法管理界面。
Mosquito®TTP Labtechn/a基于微注射器的纳升级分液仪，用于设置液滴（系统2及独立使用），配备3位板位。控制软件v.3.11.0.1422。 
Dragonfly®TTP Labtechn/a基于注射器的液体处理仪，用于生成优化筛选条件（四角法）。控制软件v.1.2.1.10196。 
粘性板封膜机Brandeln/a集成于系统1和系统2（也可作为独立机器人使用）。
喷墨打印机 9232Markem-Imajen/a集成于系统1，配备触摸屏界面。
结晶筛选试剂盒
Crystal Screen™ 1Hampton ResearchHR2-110结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01
Crystal Screen 2™Hampton ResearchHR2-112结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01
Wizard™ Classic 1Rigaku1009530结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02
Wizard™ Classic 2Rigaku1009531结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02
Grid Screen™ Ammonium SulfateHampton ResearchHR2-211结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ PEG/LiClHampton ResearchHR2-217结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Quick Screen™Hampton ResearchHR2-221结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ Sodium ChlorideHampton ResearchHR2-219结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03
Grid Screen™ PEG 6000Hampton ResearchHR2-213结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
Grid Screen™ MPDHampton ResearchHR2-215结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
MemFac™Hampton ResearchHR2-114结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04
PEG/Ion™Hampton ResearchHR2-126结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05
Natrix™Hampton ResearchHR2-116结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05
Crystal Screen Lite™Hampton ResearchHR2-128结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06
定制Lite筛选试剂盒Molecular Dimensions Ltdn/a结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06
Wizard™ Cryo 1Rigaku1009536结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07
Wizard™ Cryo 2Rigaku1009537结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07
JBS1JenaBioScienceCS-101L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS2JenaBioScienceCS-102L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS3JenaBioScienceCS-103L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS4JenaBioScienceCS-104L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08
JBS5JenaBioScienceCS-105L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS6JenaBioScienceCS-106L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS7JenaBioScienceCS-107L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS8JenaBioScienceCS-108L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09
JBS9JenaBioScienceCS-109L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
JBS10JenaBioScienceCS-110L结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMB结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12
Index™Hampton ResearchHR2-144结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB13
SaltRX™ 1Hampton ResearchHR2-107结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14
SaltRX™ 2Hampton ResearchHR2-109结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14
MemStar™Molecular Dimensions LtdMD1-21结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15
MemSys™Molecular Dimensions LtdMD1-25结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15
JCSG-plus™ SuiteQiagen130720结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB16
MORPHEUS® screenMolecular Dimensions LtdMD1-46结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB17
Pi minimal screenJenaBioScienceCS-127结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB18
Pi-PEG screenJenaBioScienceCS-128结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB19
MORPHEUS® II screenMolecular Dimensions LtdMD1-91结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB20
LMB结晶筛选试剂盒™Molecular Dimensions LtdMD1-98结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB21
添加剂筛选试剂盒
HT添加剂筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-138冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。
MORPHEUS®添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-93-500冷冻于96孔深孔板中（每孔500 µL）。
ANGSTROM添加剂筛选试剂盒™ Molecular Dimensions LtdMD1-100冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。
MORPHEUS®添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions LtdMD1-93冷冻于96孔细胞培养Costar®板（V型孔）中（每孔100 µL）。
ANGSTROM添加剂筛选试剂盒™ Molecular Dimensions LtdMD1-100-FX冷冻于96孔细胞培养Costar®板（V型孔）中（每孔100 µL）。
HIPPOCRATES添加剂筛选试剂盒Molecular Dimensions Ltdn/a48种单一添加剂（来自MORPHEUS® III中的药物化合物）。
其他耗材
96孔MRC双滴板SwissciMRC 96T-UVP坐滴法、蒸气扩散板。推荐储液池体积：80  µL。有效液滴体积范围：10–1000 nL。可透紫外光。
48孔MRC单滴板 （“MAXI板”）SwissciMMX01-UVP 用于放大/优化的坐滴法、蒸气扩散板。推荐储液池体积：200  µL。有效液滴体积范围：0.1–10 µL。可透紫外光。
MRC悬滴密封条Swisscin/a悬滴法，兼容MRC蒸气扩散板（MRC 96T-UVP和MMX01-UVP）。可透紫外光和X射线。
粘性封口膜Hampton ResearchHR4-503英寸宽Duck® HD Clear™，用于封膜仪和手动封口。
粘性铝箔膜Beckman Coulter538619用于重新密封添加剂筛选板。
墨盒Markem-Imaje9651系统1（喷墨打印机）。
溶剂盒Markem-Imaje8652系统1（喷墨打印机）。
50 µL吸头 Hamilton235947系统2（STAR™液体处理仪）。每盒6组，共1920个CO-RE™吸头，一次性堆叠包装。
试剂容器Hamilton194052在添加剂筛选流程中用于向板中分配试剂。 
PCR板Thermo Scientific™AB-2150系统2（用于盛装待转移至Mosquito®的蛋白）。Abgene Diamond ultra，384孔V型底。
微注射器TTP Labtech4150-03020Mosquito®纳升级分液仪用微注射器卷盘（共26,000个，间距9 mm）。
条带支架块TTP Labtech3019-05013Mosquito®条带用SSB装置，又称“四向试剂架”。
2 µL 8通道条带TTP Labtech4150-03110用于Mosquito®平台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积3.2 µL。
5 µL 8通道条带TTP Labtech4150-03100用于Mosquito®平台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积7.5 µL。
5 mL注射器TTP Labtech4150-07100Dragonfly®液体处理仪用注射器本体及活塞。每包100个。
槽/储液器TTP Labtech4150-07103用于Dragonfly®平台上的储备溶液储存。每包50个。
轨道微孔板振荡器CamLab Limitedn/aVariomag®，用于单块板内条件混合（0–2000 rpm）。
微孔板混匀器TTP Labtech3121-01015MxOne。通过96个振动针实现单板内条件混合。

参考文献

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