本文描述了用于分析斑马鱼发育中脑内不同微管群体的免疫标记方法，这些方法也可广泛适用于其他组织。第一个方案概述了一种优化的免疫标记稳定和动态微管的方法。第二个方案提供了一种特异性成像和定量新生微管的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
利用免疫标记分析斑马鱼胚胎中稳定的、动态的和新生的微管
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
微管（MTs）是动态且脆弱的结构，成像难度较大 体内，尤其是在脊椎动物胚胎中。本文描述了用于分析斑马鱼胚胎发育过程中神经管内不同微管（MTs）群体的免疫标记方法。尽管重点在于神经组织，但该方法也可广泛适用于其他组织。实验流程针对体节形成早期至中期（1个体节至12个体节）的胚胎进行了优化，但经过相对较小的调整后，也可适用于其他发育阶段。第一项方案提供了一种评估稳定性和动态性微管空间分布的方法，并利用图像处理软件对这些微管群体进行定量分析。该方法可作为现有实时成像技术的补充，后者依赖于转基因品系或标记构建体的瞬时表达来观察微管的动态变化和分布。尽管这些工具非常有用，但它们难以有效区分动态与稳定的微管。能够对这两类不同的微管群体进行成像与分析，对于理解细胞极化和形态发生背后的机制具有重要意义。第二项方案概述了一种专门用于分析新生微管的技术。该技术通过捕获新生微管的形成过程来实现 从头合成 药物诺考达唑处理导致微管解聚后，以及洗脱药物并经过恢复期后，微管随时间变化的生长特性。该技术尚未应用于斑马鱼胚胎中微管的研究，但是一种有价值的检测方法，可用于研究微管的 体内 参与微管组装的蛋白质功能。
引言
微管（MTs）是由α-和β-微管蛋白聚合形成的多聚体，可组装成线性原纤维，多条原纤维结合形成中空管状结构1，2。微管具有极性结构，其快速生长的正端和缓慢生长的负端分别指向细胞的不同区域，负端通常锚定在中心体或其他微管组织中心（MTOC）3。de novo微管的形成起始于γ-微管蛋白环复合体（γ-TURC）介导的成核过程，该复合体为微管组装提供模板4。在特定细胞中，可区分出两种 turnover 速率不同的微管群体。动态微管通过在生长期和缩短期之间切换来探索细胞环境，这一过程称为动态不稳定性5。与动态微管不同，稳定微管不进行显著生长，且其半衰期长于动态微管6。
数十年来的细胞生物学研究提供了多种复杂的工具，用于研究微管（MT）的结构与功能，从而积累了大量关于这些细胞骨架组分的知识。例如，微管在细胞极性的建立与维持中发挥着核心作用，这不仅归因于其内在的极性，还与稳定型和动态型微管在亚细胞区域的差异性分布密切相关7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：下述实验步骤遵循马里兰大学巴尔的摩县分校的动物护理指南。
1. 使用免疫标记法分析稳定和动态微管（方案1）
- 固定前胚胎的人工去壳
- 通过倒掉过量的系统水，然后将剩余的胚胎收集到一个塑料培养皿中，获取新鲜产下的胚胎（参见材料表）。
- 清除系统水中的任何碎片，并将胚胎转移到盛有胚胎培养基的新培养皿中（参见材料表），以确保胚胎在洁净的环境中发育。
- 将胚胎置于28.5 °C的温控培养箱中，使其发育至所需阶段。
- 将受精后24小时以内（hpf）的胚胎置于玻璃培养皿中，准备去壳。
注：为最大限度促进固定剂快速渗透并保持微管（MT）结构完整性，应在固定前进行去壳。使用胚胎培养基而非系统水，以提供去壳过程中所需的额外Ca2+。 - 在解剖显微镜下，使用精细镊子在培养皿中手动去除胚胎的卵膜。
- 用一对镊子夹住环绕胚胎的圆形透明卵膜的一小部分区域，然后轻轻拉开镊子，使膜破裂。
- 用镊子小心撬动已破裂的卵膜以扩大开口。操作时注意不要触碰胚胎，以免其破裂。
- 发育阶段胚胎的固定
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用免疫标记分析稳定和动态微管
在方案1中，使用Glu-微管蛋白和Tyr-微管蛋白分别作为稳定和动态微管的标志物，揭示了神经管发育早期（神经脊阶段）和晚期（神经索阶段）微管亚群的分布情况。在神经脊阶段（4-5体节），后脑区域以动态微管为主（图2A-D）。随着神经脊发育为神经索（11-12体节），即上皮化增强阶段，使用抗Tyr-微管蛋白抗体进行免疫标记的微管数量在定性上减少（图2E-H），尤其是在神经索腹侧区域更为明显。相比之下，Glu-微管蛋白在神经脊中呈弥散和点状分布（图3A-D），但在神经索腹侧沿微管束路径富集（图3E-H
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
目前已有多种方法可用于成像斑马鱼早期发育过程中的微管（MT）动态，范围涵盖对标记分子的活体成像到对固定组织进行免疫标记11,12,13,14。尽管单个细胞内的微管可处于动态或稳定状态，上皮化则是一个微管随时间推移逐渐稳定化的过程。利用稳定与动态微管的特异性标记物，可实现对该现象的可视化观察。本文所介绍的方法利用三维成像软件，对胚胎斑马鱼组织横截面中微管从动态向稳定群体转变的过程进行定量分析。在方案2中，该方法被用于标记一群新生微管，并追踪其成核及随时间的生长过程。
微管（MTs）由于易于解聚，其天然状态下的成像一直非常困难。因此，本方法的关键在于对整个胚胎内的微管进行快速固定。这一步骤通过在生理温度下开始固定，并使用一种既能稳定微管又能提高胚胎通透性的缓冲液来实现。固定时间也至关重要：固定时间过.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
共聚焦显微镜的购置资金来自美国国家科学基金会（NSF）的资助，资助号为 DBI-0722569。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）资助号 GM085290 以及美国国防部（DOD）资助号 W81XWH-16-1-0466 的支持，上述资助授予 R.M. Brewster。E. Vital 的资助来自霍华德·休斯医学研究所通过预科及本科科学教育项目向马里兰大学巴尔的摩县分校（UMBC）提供的资助，资助号为 52008090。S.P. Brown 获得了美国教育部 GAANN 奖学金、由 NIH/NIGMS 资助号 GM055036 资助的梅耶霍夫研究生奖学金，以及由美国国防部资助号 W81XWH-16-1-0466 资助的研究助理奖学金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | 用于处理培养皿。 制备1%琼脂糖 ：将每100 ml 1X胚胎培养基中加入1克琼脂糖，在微波炉中加热 至完全聚合。 | ||
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P10144 | |
| 小鼠抗-β-微管蛋白抗体 | 发育研究杂交瘤库 | E7 | 1/200 |
| 兔抗-γ-微管蛋白抗体 | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| 兔抗-α-微管蛋白抗体 | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| 兔抗去酪氨酸化微管蛋白抗体 | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* 首次使用新批次抗体时需进行滴定。 |
| 兔抗酪氨酸化微管蛋白抗体 | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| 小鼠抗中心粒蛋白抗体 | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| 山羊抗兔IgG（488标记） | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| 山羊抗兔IgG（594标记） | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| 山羊抗小鼠IgG（594标记） | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| 山羊抗小鼠IgG（488标记） | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| 振动切片机 | Vibratome | 1500 | |
| 镊子 | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm 培养皿 | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm 培养皿 | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml 离心管 | Fisher | 14-432-22 | |
| 编织尼龙网（70 μm） | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| 微量移液器 | Gilson | F123602 | |
| 玻璃移液管 | Fisher | NC-999363-9 | |
| 水族箱密封胶 | Amazon.com，MarineLand品牌 | 硅酮密封剂 1盎司（管装） | |
| 铁架台 | Fisher | 14-675BO | |
| 微孔PTFE管，内径0.022英寸 | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| 油泥 | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | 任何无毒的蜡基或油基油泥均可使用 |
| 夹具 | Fisher | 02-215-466 | |
| 60 ml 注射器 | Fisher | 14-820-11 | |
| 胚胎培养基（E3） | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O 制备60X储备液：将上述成分溶于H2O中，定容至2 L，用NaOH调节pH至7.2，高压灭菌。制备1X工作液时，取16.5 mL 60X储备液稀释至1 L。 | ||
| 封闭液 | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml 正常山羊血清 1 g BSA 625 µl Triton-X | ||
| TBS-NP-40（pH 7.6） | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 | ||
| 2x MAB（pH 6.4） | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 | ||
| 商用三维图像处理软件 | PerkinElmer | Volocity（V 6.2） | |
| 干式恒温仪 | VWR | 12621-108 | 在方案1中用作加热板以融化琼脂糖。 |
| 体视显微镜 | Leica | MZ12 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | SP5 | |
| 平底包埋模具 | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| 公共领域图像处理软件 | NIH | ImageJ（V 1.5） | |
| * 效果因批次不同而异 |
参考文献
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and de....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
