我们建立了一种方法，可成功地将原本以整体封片方式固定的乳腺组织进行取材、处理、切片和染色，用于组织病理学评估。该方法可能促进在生殖和发育毒性试验指南研究中对乳腺腺体整体封片的采集与评估。
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摘要
摘要
正常乳腺的发育可能受到环境毒物和药物、激素过度暴露以及遗传改变的影响。乳腺全组织切片是一种经济的方法，可用于记录暴露后可能出现的形态学变化过程。然而，在生命后期，当异常更易发生时，仅依赖这一种方法并不总能提供足够的信息以对异常作出正确诊断。传统上，在化学品测试指南研究中，尸检时仅取一侧乳腺制备苏木精和伊红（H&E）染色切片。结合对侧乳腺全组织切片的采集与分析，可降低假阴性评估的可能性。全组织切片的评估受限于载玻片上仅含一个或两个完整的乳腺组织，且在某些情况下，全组织切片中观察到的异常在H&E染色切片中并不能被一致地呈现。 本研究旨在建立一种将封片后的乳腺全组织切片转化为H&E染色切片的实验方案，以便识别那些原本可能被遗漏或难以诊断的病变。本文详细描述了一种从最初制备为全组织切片的乳腺组织制备高质量石蜡包埋H&E染色切片的方法。与专为H&E染色而制备的组织相比，全组织切片需要额外的组织取出和处理步骤。然而，该方法仍被视为经济可行，因其仅需常规实验室试剂且耗时较少。因此，该方法可为化学物质和环境暴露如何影响正常乳腺发育，以及因遗传修饰所引起的改变提供宝贵信息。
引言
乳腺整体封片是一种在多种大鼠和小鼠研究中广泛应用的有用且经济的方法，用于理解正常及化学诱导的异常发育过程。通常，在啮齿类动物发育的不同阶段（例如青春期、性成熟期、妊娠中期至晚期以及退化期）采集的乳腺组织，其组织和细胞结构会表现出受旁分泌、内分泌和自分泌因子影响的形态学变化1。在老龄大鼠中，腺体的上皮和间质部分会变得越来越致密，这使得在整体封片中测量形态学参数变得困难。因此，通常会采集腺体进行组织学评估，以在显微水平上识别变化。这两种方法在涉及化学物质暴露（例如环境或药物）的研究中特别有用，也可用于研究伴随遗传改变而发生的形态学变化。
用于乳腺在风险评估中应用的技术与能力仍在不断发展。尽管全组织制备已成为常规且标准化的操作，但对切片技术的改进仍在持续进行2,3. 来自不同背景的许多研究团队（即， 学术界、政府机构和工业界已将乳腺组织的冠状面/纵向切片作为首选方法，而一些实验室仍在使用穿过皮肤的横切面切片方法4后者会导致表皮（皮肤）的过度呈现，而非目标组织——乳腺上皮2冠状面或纵向切面更适用于表征正常组织5 并由于表面积和结构数量的增加，显著提高对异常和病变的检出率。总体而言，这使得全组织制片成为乳腺组织比较组织病理学评估的适宜方法1,2无论是使用小鼠还是大鼠，器官的取出与保存均需在4th 和 5th 强烈建议使用腹股沟腺体，以便将整体封片与对侧H进行比较&E 部分
当联合使用时，H&E切片与整体封片能够准确反映环境暴露所诱导的细胞及形态学变化。这一点在某些大鼠品系中尤为显著，因为这些模型对肿瘤形成的易感性较低，或肿瘤在肉眼观察下不可见。在某些情况下，可能无法同时通过这两种技术获得所需的组织样本。即， 组织量不足、资源限制或出现意外实验结果）。在本案例中，乳腺全组织制备片中观察到异常，而对侧乳腺的组织病理学检查结果&E 腺体基本正常。对侧腺体之间存在显著差异，这促使我们开发一种经济且高效的流程，以鉴定整体封片中的异常情况。通过改进的处理和包埋流程，可获得高质量的H&E染色切片由石蜡包埋的整体样本制备而成。我们预计该方案将成为检测化学暴露效应的有力工具，并有助于提升实验室间的可比性。
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方案
本研究中所有动物使用和操作程序均经国家环境健康科学研究所（NIEHS）实验动物管理委员会批准
护理与使用委员会，并在评估与认证协会
经实验室动物护理认证的设施。
1. 乳腺全组织制备2,3,6,7
- 按照参考文献3所述方法，取一只未妊娠的 CD-1 雌性小鼠一侧的腹股沟乳腺组织，并将其置于带静电的载玻片上。
- 用防粘纸或薄膜覆盖乳腺组织，再在其上方放置另一张载玻片。施加压力（即，用水作为重物）使组织压平，以便乳腺组织牢固粘附于载玻片上，便于固定。
- 将载玻片浸入固定液（例如，乙醇、氯仿和冰醋酸按 6:3:1 比例混合）中，在室温下固定过夜。
- 从固定液中取出组织，用乙醇洗涤 15–30 分钟。30 分钟洗涤结束后，通过倒出 1/3 乙醇并加入水的方式逐步过渡至水环境。每次加水后静置约 5 分钟，重复此操作共 3 次。
- 用染色剂（例如，卡红明矾溶液）染色 12–24 小时。
注意：较厚的组织需要更长的染色时间。染色细节请参见参考文献3。 - 在规定时间后倒去染液，用清水冲洗载玻片 30 秒。随后依次用 70% 乙醇洗涤 15 分钟，95% 乙醇洗涤 15 分钟，最后用 100% 乙醇洗涤 20 分钟，以完成组织脱水。
- 将组织置于二甲苯中至少 24 小时以清除脂肪；若组织较厚，应延长处理时间，直至所有不透明或白色区域完全消失。
- 从二甲苯中取出组织后，迅速在载玻片上滴加封片介质，避免组织脱水；盖上盖玻片。让载玻片干燥至少 48 小时。
- 按照文献2所述方法评估整体封片组织是否存在异常。
注意：当在整体封片中发现病变且需通过切片进一步确认其性质时，应执行以下步骤。
2. 从载玻片上取下乳腺整体组织
- 将乳腺全组织切片浸入盛有二甲苯的玻璃染色缸中，以去除盖玻片和封片介质 过夜。
注意：较厚的组织或封片剂过多的载玻片可能需要更长时间以去除盖玻片。 - 初次过夜浸泡后，将载玻片放入新鲜二甲苯中浸泡6小时。最后用新鲜二甲苯再过夜浸泡一次。
注意：最后一次浸泡后，盖玻片很容易从载玻片上脱落。 - 戴手套的手握住载玻片，用镊子小心地移除盖玻片，确保其完整地一次性取下。
注意：如果盖玻片仍然附着在载玻片上，请继续浸泡，直至其可轻松取下。 - 盖玻片移除后，将载玻片垂直置于盛有二甲苯的玻璃培养皿中，取一把锋利的一次性剃刀刀片，沿载玻片表面单向匀速刮下。
- 组织取出后，迅速将乳腺垫浸入盛有二甲苯的玻璃培养皿中，以防止组织暴露在空气中干燥。
注意：此步骤需谨慎操作。整个标本较薄（≤ 1 mm），且 因二甲苯处理而变得脆弱。任何压痕或撕裂都可能改变组织形态，从而增加后续评估的难度。
3. 组织处理
- 将组织放入培养皿后，小心地将其转移至已标记的组织学包埋盒中。使用钝头、带锯齿尖端的镊子夹住脂肪垫边缘，以尽量减少对组织的损伤。
- 使用剃刀将较大的组织（尤其是大鼠组织）切成两半，并分别放入两个可容纳组织尺寸的已标记包埋盒中。将组织正面朝上放置（以淋巴结作为参考）。在将组织转移至包埋盒时，确保不含淋巴结的组织部分保持相同、直立的位置。
- 将包埋盒放入盛有二甲苯的容器中，浸泡时间最长为2小时，然后将其放入组织处理仪中。
注意：建议在组织放入包埋盒的当天即开始处理。长时间浸泡在二甲苯中的效果尚未经过测试。 - 手动将尽可能多的包埋盒装入组织处理仪中。
- 开始前，先将本流程中使用的所有试剂信息输入组织处理仪的试剂列表中。为实现从一个步骤自动进入下一个步骤，使用菜单选项创建新程序。完成所有步骤设置后，选择“OK”以继续。
注意：启动前，组织处理仪允许用户查看所有步骤的详细信息。- 设置组织处理仪自动使包埋盒在37 °C条件下于二甲苯中浸泡30分钟，随后在相同条件下于新鲜二甲苯中进行第二次浸泡。再设置仪器自动将包埋盒从二甲苯溶液中取出，并将组织转移至下一个含有1:1二甲苯:熔融石蜡混合液的步骤中，在60 °C下处理30分钟。
注意：随后，组织处理仪会将包埋盒转移至一个含有熔融石蜡的新腔室中，处理1小时。1小时后，样品将自动转移至另一腔室的新鲜熔融石蜡中，继续处理2小时。这两个步骤均在60 °C下进行。 - 随后，组织处理仪将包埋盒转移至含有熔融石蜡的步骤中处理1小时，然后样品将自动转移至最终的新鲜熔融石蜡步骤中，再处理2小时。这两个步骤均在60 °C下进行。
- 设置组织处理仪自动使包埋盒在37 °C条件下于二甲苯中浸泡30分钟，随后在相同条件下于新鲜二甲苯中进行第二次浸泡。再设置仪器自动将包埋盒从二甲苯溶液中取出，并将组织转移至下一个含有1:1二甲苯:熔融石蜡混合液的步骤中，在60 °C下处理30分钟。
4. 包埋处理后的乳腺组织
- 将包埋盒放入包埋机的58 °C石蜡储存罐中，待组织准备包埋至模具时取出。
- 取下包埋盒盖子，以确定最适合组织大小的模具。确保模具足够大，能够容纳组织，并在组织周围留出足够的无组织石蜡边缘。
- 向模具中加入3–4 mm熔融石蜡，将 乳腺全组织切片表面（此前紧贴载玻片底部及包埋盒底部）朝上放置于模具中。
- 将模具转移至冷却板上，并根据需要迅速调整组织位置，使其与模具底部平行。
注意：石蜡一旦凝固，组织即被固定到位。 - 使用预热的镊子，将已标记的包埋盒底半部分置于模具上方，并用镊子用力压紧。
- 连续加入额外的熔融石蜡，直至完全覆盖整个包埋盒。将模具从温热板转移至冷板，以完成蜡块的完全凝固。
- 待石蜡完全固化后，从模具中取出蜡块，以避免产生裂纹或气泡。
注意：将石蜡包埋的组织在室温下保存，直至准备切片。
5. 在切片机上对石蜡包埋的乳腺组织进行切片
- 切片前，将石蜡包埋块置于 -20 °C 环境中孵育 1 小时。
注意：原始封片的整体组织样本中残留有封片剂，冷却包埋块有助于改善切片和带状连续切片的质量。 - 开启水浴锅，加入新鲜蒸馏水，并将温度调节至 42–45 °C，以准备切片。在切片机上安装一把新的低剖面刀片，并将切片厚度设定为 4 µm。
注意：由于组织中残留封片剂的存在，若切片厚度超过 4 µm，切片质量会下降。 - 将包埋块插入切片机，使石蜡面朝向刀片，并与垂直面保持对齐。 然后，用冷水浸湿一块纱布，将其覆盖在包埋块上数分钟。
- 通过顺时针旋转大手轮，并配合使用粗进样轮，进行切片，直至获得完整的切面或具有代表性的组织切片。
注意：由于整体组织处理过程中使用二甲苯透明化，组织本身较薄。应将包埋块与刀片正确对齐，以尽量减少获得代表性切片所需的切削次数。 - 用手拾取切片带，小心地将其漂浮于预热（45 °C）的水浴中（预先准备），待组织皱褶展开后，再小心地将单个切片漂浮至洁净的玻璃载玻片上。
- 将载玻片垂直放置于干燥架上，以去除多余水分。随后将载玻片置于略微打开盖子的玻片盒中，在 37 °C 下孵育过夜。
6. 乳腺组织切片的自动化与手动 H&E 染色
- 染色前，将切片置于室温下保存。
- 进行自动染色时，在主菜单的染色选项中选择 H & E。 脱蜡、染色和脱水均在自动染色仪上完成。使用封片剂和盖玻片对切片进行封片。
- 若手动染色，将切片浸入二甲苯中5分钟以脱蜡。转移至 新鲜二甲苯中，重复5分钟。
- 将切片依次浸入100%乙醇中两次，每次3分钟，进行再水化；随后在新鲜的95%乙醇中重复两次，并在1X洗涤缓冲液中分别洗涤两次，每次5分钟。
- 用蒸馏水冲洗切片。
- 将切片放入苏木精染液中染色1-2分钟。取出切片后，用流动自来水冲洗5分钟。
注意：每次使用前需过滤苏木精染液。 - 将切片放入1%冰醋酸中30秒，以促进染色分化，然后用流动自来水冲洗1分钟。
- 将切片放入1X PBS中30秒至1分钟，使组织切片变蓝，随后用自来水冲洗5分钟，再在95%乙醇中浸泡15-20秒。
- 用伊红溶液复染30秒至1分钟。之后将切片在新鲜95%乙醇中脱水两次，再在新鲜100%乙醇中脱水两次，每次洗涤5分钟。
- 用二甲苯透明切片，更换两次新鲜二甲苯，每次5分钟。
- 用封片剂加盖盖玻片，室温下平放过夜干燥。
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结果
如果原始对侧乳腺垫的H&E切片未显示任何组织学变化，该方法在辅助诊断方面具有显著效果，可避免漏诊。然而，只有在全组织制备初期以及组织进行组织学评估的准备过程中谨慎操作，结果才具有应用价值。石蜡包埋可提供保护作用，并有助于保存组织，以便未来进行切片。
为确定乳腺组织的最佳厚度，制备了4 µm和6 µm的切片。我们测试了超出切片机±1 µm误差范围的深度。6 µm厚度的切片（图1A）细胞密集且排列紧密，整体上切片缺乏进行准确鉴定所需的清晰细胞结构。4 µm厚度为最佳切片厚度（图1B），该厚度下的组织切片效果最佳，上皮和间质区域及其相应的细胞类型均能清晰区分。
本研究采用一项大规模、正在进行的研究中的切片，以展示该方法的简便性和实用性。在多个案例中，发现14月龄未...
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讨论
乳腺全组织切片是一种强大的工具，可用于展示正常的乳腺发育过程以及暴露于化学物质（包括内分泌干扰物）后可能出现并持续存在的形态学改变。当对同一动物的全组织切片和H&E染色切片进行联合评估时，它们能够提供早期改变的准确可视化图像，这些改变可能进一步发展为更严重的病变状态。
获取这一有用信息的关键在于，在切除组织时需谨慎操作，以确保腺体形态得到保存而不受破坏。尽管啮齿类动物沿背部两侧分布有多个乳腺位点，建议采集第4对乳腺th 和 5th 腺体应尽量减少肌肉组织的残留。乳头附着区域和淋巴结也应保留，因为它们可作为有用的形态学标志。腺体还应在一个平坦的表面上展开并拉伸即， 载玻片、卡纸或织物）以紧密模拟组织的天然结构 原位乳腺组织内的异常通常在经二甲苯脱脂或卡红染色后才变得可见。与最初用于组织学切片制备的乳腺组织不同，从载玻片上取下用于石蜡包埋的整体封片组织会非常薄且脆弱。应避免使用镊子造成压痕或组织撕裂，因为这些损伤可能改变细胞形态，并给最终样品的组织病理学评估带来困难。
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披露
作者声明本文章的研究、撰写和/或发表不存在任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）的 Pam Ovwigho、Tenette Jones 和 Natasha Clayton 在本项目中提供的专业技术支持与帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| 佩尔蒙特 | 赛默飞世尔科技 | SP15-100 | 用于封片整体样本的封片介质和H&E 部分 |
| Leica 自动组织脱水机 | Leica Biosystems | 型号 # ST5020 | |
| HM 355S 自动切片机 | 赛默飞世尔科技 | 905200 | |
| 石蜡 | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 4951PLUS-001 | 静电带电的 |
| Fisher Finest 24x60x1 | 赛默飞世尔科技 | 12-548-5P | 盖玻片 |
| Varistain Gemini ES 全自动切片染色机 | 赛默飞世尔科技 | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | 液态粘附剂；切片时用于水浴 |
| 改良哈里斯苏木精 72711 | Richard-Allan Scientific（属于赛默飞世尔科技） | 72711 | |
| 伊红 | Leica Biosystems | 3801600 | |
| 碳酸锂 | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| 冰醋酸 | 赛默飞世尔科技 | A38-500 | 卡诺固定液所需成分 |
| 氯仿 | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | 卡诺固定液所需成分 |
| 100% 乙醇 | 华纳·格雷厄姆公司 | 6505001050000 | 卡诺固定液和洗涤载玻片所需物品 |
| 95% 乙醇 | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| 胭脂红铝 | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| 十二水合硫酸铝钾，Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| 自动化洗涤缓冲液，20X | Biocare Medical | TWB945 |
参考文献
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