我们建立了一种方法，可成功地将原本以整体封片方式固定的乳腺组织进行取材、处理、切片和染色，用于组织病理学评估。该方法可能促进在生殖和发育毒性试验指南研究中对乳腺腺体整体封片的采集与评估。
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摘要
摘要
正常乳腺的发育可能受到环境毒物和药物、激素过度暴露以及遗传改变的影响。乳腺全组织切片是一种经济的方法，可用于记录暴露后可能出现的形态学变化过程。然而，在生命后期，当异常更易发生时，仅依赖这一种方法并不总能提供足够的信息以对异常作出正确诊断。传统上，在化学品测试指南研究中，尸检时仅取一侧乳腺制备苏木精和伊红（H&E）染色切片。结合对侧乳腺全组织切片的采集与分析，可降低假阴性评估的可能性。全组织切片的评估受限于载玻片上仅含一个或两个完整的乳腺组织，且在某些情况下，全组织切片中观察到的异常在H&E染色切片中并不能被一致地呈现。 本研究旨在建立一种将封片后的乳腺全组织切片转化为H&E染色切片的实验方案，以便识别那些原本可能被遗漏或难以诊断的病变。本文详细描述了一种从最初制备为全组织切片的乳腺组织制备高质量石蜡包埋H&E染色切片的方法。与专为H&E染色而制备的组织相比，全组织切片需要额外的组织取出和处理步骤。然而，该方法仍被视为经济可行，因其仅需常规实验室试剂且耗时较少。因此，该方法可为化学物质和环境暴露如何影响正常乳腺发育，以及因遗传修饰所引起的改变提供宝贵信息。
引言
乳腺整体封片是一种在多种大鼠和小鼠研究中广泛应用的有用且经济的方法，用于理解正常及化学诱导的异常发育过程。通常，在啮齿类动物发育的不同阶段（例如青春期、性成熟期、妊娠中期至晚期以及退化期）采集的乳腺组织，其组织和细胞结构会表现出受旁分泌、内分泌和自分泌因子影响的形态学变化1。在老龄大鼠中，腺体的上皮和间质部分会变得越来越致密，这使得在整体封片中测量形态学参数变得困难。因此，通常会采集腺体进行组织学评估，以在显微水平上识别变化。这两种方法在涉及化学物质暴露（例如环境或药物）的研究中特别有用，也可用于研究伴随遗传改变而发生的形态学变化。
用于乳腺在风险评估中应用的技术与能力仍在不断发展。尽管全组织制备已成为常规且标准化的操作，但对切片技术的改进仍在持续进行2,3. 来自不同背景的许多研究团队（即， 学术界、政府机构和工业界已将乳腺组织的冠状面/纵向切片作为首选方法，而一些实验室仍在使用穿过皮肤的横切面切片方法4后者会导致表皮（皮肤）的过度呈现，而非目标组织——乳腺上皮2冠状面或纵向切面更适用于表征正常组织5 并由于表面积和....
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方案
本研究中所有动物使用和操作程序均经国家环境健康科学研究所（NIEHS）实验动物管理委员会批准
护理与使用委员会，并在评估与认证协会
经实验室动物护理认证的设施。
1. 乳腺全组织制备2,3,6,7
- 按照参考文献3所述方法，取一只未妊娠的 CD-1 雌性小鼠一侧的腹股沟乳腺组织，并将其置于带静电的载玻片上。
- 用防粘纸或薄膜覆盖乳腺组织，再在其上方放置另一张载玻片。施加压力（即，用水作为重物）使组织压平，以便乳腺组织牢固粘附于载玻片上，便于固定。
- 将载玻片浸入固定液（例如，乙醇、氯仿和冰醋酸按 6:3:1 比例混合）中，在室温下固定过夜。
- 从固定液中取出组织，用乙醇洗涤 15–30 分钟。30 分钟洗涤结束后，通过倒出 1/3 乙醇并加入水的方式逐步过渡至水环境。每次加水后静置约 5 分钟，重复此操作共 3 次。
- 用染色剂（例如，卡红明矾溶液）染色 12–24 小时。
注意：较厚的组织需要更长的染色时间。染色细节请参见参考文....
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结果
如果原始对侧乳腺垫的H&E切片未显示任何组织学变化，则该方法在辅助诊断方面具有显著效果，可避免漏诊。然而，只有在初次整体封片制备以及组织进行组织学评估前处理过程中谨慎操作，才能获得有效的结果。石蜡包埋可提供保护作用，并有助于保存组织，以便将来进行切片。
为确定乳腺组织的最佳厚度，制备了4 µm和6 µm的切片。我们测试了超出切片机±1 µm误差范围的切片深度。6 µm厚度的切片（图1A）细胞密集且排列紧密，整体上切片缺乏进行准确鉴定所需的清晰细胞结构。最佳厚度为4 µm（图1B），该厚度的组织切片结果最佳，上皮区与间质区及其相应的细胞类型均能清晰区分。
本研究采用一项大规模长期研究中的切片，以展示该方法的简便性和实用性。在多个案例中，发现14月龄未交配CD-.......
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讨论
乳腺全组织切片是一种强大的工具，可用于展示正常的乳腺发育过程以及暴露于化学物质（包括内分泌干扰物）后可能出现并持续存在的形态学改变。当对同一动物的全组织切片和H&E染色切片进行联合评估时，它们能够提供早期改变的准确可视化图像，这些改变可能进一步发展为更严重的病变状态。
获取这一有用信息的关键在于，在切除组织时需谨慎操作，以确保腺体形态得到保存而不受破坏。尽管啮齿类动物沿背部两侧分布有多个乳腺位点，建议采集第4对乳腺th 和 5th 腺体应尽量减少肌肉组织的残留。乳头附着区域和淋巴结也应保留，因为它们可作为有用的形态学标志。腺体还应在一个平坦的表面上展开并拉伸即， 载玻片、卡纸或织物）以紧密模拟组织的天然结构 原位乳腺组织内的异常通常在经二甲苯脱脂或卡红染色后才变得可见。与最初用于组织学切片制备的乳腺组织不同，从载玻片上取下用于石蜡包埋的整体封片组织会非常薄且脆弱。应避免使用镊子造成压痕或组织撕裂，因为这些损伤可能改变细胞形态，并给最终样品的组织病理学评估带来困难。
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披露
作者声明本文章的研究、撰写和/或发表不存在任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）的 Pam Ovwigho、Tenette Jones 和 Natasha Clayton 在本项目中提供的专业技术支持与帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| 佩尔蒙特 | 赛默飞世尔科技 | SP15-100 | 用于封片整体样本的封片介质和H&E 部分 |
| Leica 自动组织脱水机 | Leica Biosystems | 型号 # ST5020 | |
| HM 355S 自动切片机 | 赛默飞世尔科技 | 905200 | |
| 石蜡 | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 4951PLUS-001 | 静电带电的 |
| Fisher Finest 24x60x1 | 赛默飞世尔科技 | 12-548-5P | 盖玻片 |
| Varistain Gemini ES 全自动切片染色机 | 赛默飞世尔科技 | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | 液态粘附剂；切片时用于水浴 |
| 改良哈里斯苏木精 72711 | Richard-Allan Scientific（属于赛默飞世尔科技） | 72711 | |
| 伊红 | Leica Biosystems | 3801600 | |
| 碳酸锂 | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| 冰醋酸 | 赛默飞世尔科技 | A38-500 | 卡诺固定液所需成分 |
| 氯仿 | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | 卡诺固定液所需成分 |
| 100% 乙醇 | 华纳·格雷厄姆公司 | 6505001050000 | 卡诺固定液和洗涤载玻片所需物品 |
| 95% 乙醇 | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| 胭脂红铝 | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| 十二水合硫酸铝钾，Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| 自动化洗涤缓冲液，20X | Biocare Medical | TWB945 |
参考文献
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M.
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