本文报道了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立三维（3-D）培养体系的方案，称为无血清拟胚体（SFEB）。该三维模型可类似于器官型脑片培养，用于模拟人类大脑皮层发育过程，并对发育中的神经环路进行生理学研究。
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本文内容
摘要
摘要
尽管有多种 体外 已利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立疾病模型，但其中一个局限在于，这些二维（2-D）体系可能无法充分反映携带疑似致病变异个体中所存在的细胞结构和功能复杂性。传统的2-D模型仍是对真实情况不完整的再现 体内类结构，且无法充分反映大脑的复杂性。因此，迫切需要开发更多基于三维人诱导多能干细胞（hiPSC）的模型，以更真实地模拟大脑中细胞间的相互作用和功能表现 体内 系统
本文报道了一种基于无血清拟胚体（SFEB）技术，由未分化的人诱导多能干细胞（hiPSCs）构建三维（3-D）培养体系的实验方案。该三维模型可模拟腹侧化新皮质发育过程中的若干特征，适用于研究活体神经细胞及完整组织中的关键功能，如细胞迁移、连接性、信号传导以及成熟过程。具体而言，我们证明了采用本方案生成的SFEB可通过生理相关性强且信息含量高的基于细胞的功能检测方法进行分析，例如钙成像和多电极阵列（MEA）记录，而无需进行冷冻切片处理。在MEA记录中，我们发现SFEB在长期培养过程中，其尖峰放电活动和网络层面的簇状放电活动均显著增强。该SFEB方案为研究三维模型中神经网络的发育形成提供了一个稳定且可扩展的系统，能够再现早期皮质发育的关键特征。
引言
我们此前报道过一种源自患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）的三维模型系统，该系统可重现早期皮层网络发育的某些方面1该三维模型是一种无血清拟胚体（SFEB），在以往简单的hiPSC聚集模型基础上进行了改进2,3越来越多的研究表明，类似于我们所用的SFEBs的三维结构，能够近似再现通常观察到的神经发育的某些特征 体内 且早于在二维（2-D）/单层 hiPSC 模型中观察到的时间点4,5早期研究主要集中在三维结构的自组织复杂性上，尚未展示其生理复杂性。2.
本方案已应用于由成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）衍生的未分化人诱导多能干细胞（hiPSCs）。这些细胞培养在经γ射线照射的小鼠胚胎饲养层细胞（MEFs）上。人工清除hiPSC克隆中自发分化的细胞后，通过酶法收获细胞，并重悬于含有Rho激酶抑制剂Y-27632（ROCKi）的培养基中。未分化的hiPSCs经解离和离心处理后，转移至96孔低吸附V型底培养板中。接种后，采用双SMAD抑制法（SB431542、LDN193189联合dickkopf 1（DKK-1））启动神经诱....
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方案
1. 神经前体细胞的制备
- 将来源于成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）的hiPSCs在6孔板中培养于经γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上，使用添加小分子化合物的人iPSC培养基（见材料表）。
注：日常维护步骤为先前报道方法的改良版本1,16。- 将6 × 105个MEF细胞接种至6孔组织培养板的每孔中，每孔加入300 μL推荐培养基（按照制造商说明书操作）。
- 48小时后，将MEF细胞的培养基更换为每孔300 μL的hiPSC培养基，孵育1小时后再接种hiPSCs。
- 在37 °C水浴中快速解冻hiPSCs，缓慢逐滴加入1 mL hiPSC培养基。将细胞与培养基转移至15 mL锥形离心管中，补加培养基至总体积5 mL。以129 × g离心4分钟，吸除上清液，轻轻将沉淀重悬于含ROCK抑制剂（1:1,000浓度）的1 mL hiPSC培养基中。
- 将细胞悬液（通常接种密度为300,000个细胞/孔）接种至MEF饲养层上，于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养。
- 使用光学显微镜密切观察iPSC培养状态。48小时后，移除边缘不规则、呈囊状生长或在光学显微镜下呈现黄褐色的培养物....
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结果
采用本技术培养的SFEBs生成的组织具有类似早期发育皮质下室下区的形态学特征，其中含有大量Tuj1阳性神经元以及神经前体细胞（图3A）。在SFEB的外层和内层均观察到多个正在发育的皮质玫瑰花结构（图3B）。SFEB的外缘类似于正在发育的皮质板，包含终末分裂后的神经元。这一特征由Brn2的表达所支持，Brn2是发育中最腹侧皮质外层神经前体细胞的标志物。在SFEB中还可观察到表达Reelin的细胞，这些细胞可能是Cajal-Retzius细胞或其前体细胞，通常存在于发育中皮质的外层（图3C）。采用本方案培养的SFEBs表达的标志物特征提示其来源为混合性的尾侧神经节隆起（CGE）和内侧神经节隆起（MGE）。在培养物中可观察到表达CGE标志物Couptf2的细胞以及表达MGE标志物Nkx2.1的其他细胞（图3D）。这一现象可能部分归因于本方案中.......
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讨论
本文所述方案提供了将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为类前脑皮层早期发育阶段的三维结构的条件。该方法所获得的结构既可用于电生理学研究，也适用于显微成像。最终形成的悬浮脑类器官（SFEB）在形态上类似于脑组织切片培养物，可实现高质量的共聚焦显微详细成像。本方案可成功利用成纤维细胞和外周血单个核细胞来源的hiPSC生成SFEB。由外周血单个核细胞来源的hiPSC所生成的SFEB在形态学特征上与成纤维细胞来源的hiPSC生成的SFEB相似。
该过程与其他三维培养方案类似，利用小分子细胞外信号来引导细胞命运的决定。同时结合了细胞间接触的内在特性，从而为神经网络的形成和神经元功能提供了更为真实的环境。已有研究报道表明，适当组合的小分子细胞外信号足以诱导特定的细胞命运决定，例如中脑多巴胺能神经元8,22以及皮层中间神经元8,16,
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
感谢 Elizabeth Benevides 对本文的校对。感谢 John Hussman 博士和 Gene Blatt 博士富有建设性的讨论和意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SFEB 神经元分化细胞培养基。试剂。组分 | |||
| STEMdiff 神经诱导培养基（hiPSC 培养基） | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM 培养基（MEF 培养基） | GlobalStem | GSM-2001 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| DM1 培养基组分 | |||
| D-MEM/F-12 (1x)，含 Glutamax 液体，1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout 血清替代物 | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM 非必需氨基酸溶液 10 mM (100x)，液体 | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-巯基乙醇 (1,000x)，液体 | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| DM2 培养基组分 | |||
| D-MEM/F-12 (1x)，含 Glutamax 液体，1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 补充剂 (100x)，液体 | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| DM3 培养基组分 | |||
| NEUROBASAL 培养基 (1x)，液体 | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 补充剂（不含维生素 A）(50x)，液体 | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 小分子 | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 重组蛋白 | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 组分/材料 | |||
| 细胞培养插件 0.4 μM，30 mm 直径 | Millicell | PICM0RG50 | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 孔 V 型底板（带盖） | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| 磷酸盐缓冲盐水（PBS） | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| 正常驴血清 | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5（核标记物） | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA 板 | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 孔平底板 | Falcon | 353046 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 抗体 | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
参考文献
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al.
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