无创采集黏膜衬层液用于定量分析 体内 上呼吸道免疫介质水平

摘要

本方案描述了一种非侵入性技术，用于采集上呼吸道未受扰动的黏膜衬液。该技术可用于对黏膜衬液中的成分进行定量分析。 体内 各种年龄受试者体内蛋白质介质（如细胞因子和趋化因子）的水平。

摘要

本方案描述了一种非侵入性采集未受干扰的上呼吸道黏膜衬液的方法。同时详细介绍了在分析免疫介质之前对液体洗脱物进行提取的步骤，可用于研究上呼吸道局部免疫特征，且无需进行刺激操作（其他技术常需此类步骤）。通过将一片滤纸置于下鼻甲前部并保持2分钟以吸收黏膜衬液来完成采样。随后从滤纸上洗脱分析物，并采用基于电化学发光的免疫分析法检测提取的基于蛋白质的洗脱液，从而在同一份样本中高灵敏度地定量低浓度和高浓度的分析物。我们测定了上呼吸道黏膜中20种预先选定的、与特定免疫信号通路相关的免疫介质的体内水平，但该技术并不局限于这一特定检测面板或采样部位。该方法最初应用于来自哥本哈根儿童哮喘前瞻性研究₂₀₀₀（COPSAC₂₀₀₀）队列中患有变应性鼻炎的7岁儿童，之后进一步用于纵向COPSAC₂₀₁₀出生队列，在1个月、2岁、6岁时以及出现急性呼吸道症状时进行采样。我们在700名1个月大的婴儿中成功获取并分析了620例（89%）样本；少数样本低于检测下限（报告为中位数（四分位距（IQR）））。每种介质检测下限以下的样本数量（即 从0到设定的最低检测限）为29例（7.25 - 119.5）。该技术可实现自出生起对呼吸道黏膜免疫谱的体内定量，适用于纵向研究，并可用于遗传因素与生命早期环境暴露的影响、呼吸系统疾病的病理生理学、内型分型及监测，以及新型治疗手段的研发与评估。

引言

鼻腔黏膜衬里液构成了上呼吸道系统的液体部分。它由上皮细胞与构成抵御入侵微生物第一道防线的免疫细胞相互作用所产生的多种介质组成。鼻黏膜易于接近，且鼻腔与支气管之间存在密切的功能和免疫学关联¹。该区域在儿童期常见的呼吸道疾病（如哮喘和过敏性鼻炎）研究中具有特殊意义，同时也与多种在成年后更为常见的呼吸系统疾病相关。

本文介绍了一种利用基于滤纸的无创技术，从鼻腔中采集未受干扰的黏膜衬里液的方法，以及随后从滤纸上洗脱基于蛋白质的分析物以进行定量的提取步骤。例如，该技术可用于获取健康个体及患有各种呼吸系统疾病的个体的体内免疫特征。此外，还可用于分析与特定免疫特征相关的重要暴露因素，并评估该特征是否为后续疾病发展的预测因子或中介因子。

此前，黏膜衬层液体通过鼻腔灌洗法获取²，该方法通常需先进行鼻腔激发试验，即引入高浓度的过敏原以诱发炎症反应^3,4。然而，鼻腔灌洗技术在年幼儿童中不可行，且会引入未知的稀释因素，导致稀释后的介质浓度可能低于检测方法的检测限，从而干扰实验结果⁵。此外，由于稀释因素未知，不同个体间鼻腔激发试验所测得的分析物反应无法相互比较，限制了该技术在群体研究中的应用价值。最后，过敏原激发仅适用于已致敏的受试者，而其他类型的激发（如组胺激发）则缺乏生理相关性，可能导致介质释放出现天花板效应。上述问题在本文介绍的基于滤纸的黏膜衬层液体采集技术中得以避免，该方法中个体间的液体分泌量和分析物浓度是影响个体间差异的唯一因素。

在提取过程中，向所有样本加入等体积的缓冲液后，分析物从滤纸上被洗脱出来。这有利于获得相似的 离体 所有样品的稀释。提取步骤使用基于白蛋白的等渗盐溶液作为提取缓冲液；该缓冲液可提取基于蛋白质的介质，并在洗脱蛋白定量前的冷冻过程中稳定蛋白质，以减少变性。为避免提取过程中蛋白质降解，需在提取缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物。

可对未受干扰的样本进行定量分析的技术的实施， 体内在黏膜部位产生免疫介质具有极其重要的意义。首先，黏膜部位构成了人体最大的免疫器官。其次，鼻腔是空气传播物质暴露的主要部位，并与肺部的呼吸免疫区室紧密相连。¹第三，利用一种非侵入性技术对这一重要器官进行检测，有望提供大量关于气道中微生物-免疫相互作用轴在健康与疾病状态下相关信息。第四，该技术还可应用于诸多其他领域，例如在药物和微量营养素的随机对照试验中研究局部免疫学改变。

我们最初在哥本哈根儿童哮喘前瞻性研究₂₀₀₀（COPSAC₂₀₀₀）队列中实施了该技术，测定了患有过敏性鼻炎与健康对照的7岁儿童黏膜衬液的免疫谱型¹³。随后，我们成功将该技术应用于纵向COPSAC₂₀₁₀队列，评估了婴儿在1个月、2岁、6岁以及出现急性呼吸道症状时的气道免疫谱型。来自1月龄新生儿的结果显示，免疫特征与生命早期环境暴露之间存在重要关联^{7,8,9,10,11,12}。

方案

研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则进行。已获得哥本哈根伦理委员会（COPSAC₂₀₀₀ 项目编号 KF 01-289/96，COPSAC₂₀₁₀ 项目编号 H-B-2008-093）以及丹麦数据保护局的批准，并在纳入每位受试者前获得其父母双方的书面知情同意。

1. 实验设置

1. 使用滤纸片（纤维状羟基化聚酯片，参见材料表）^6,7。
   1. 为1个月大的婴儿裁剪尺寸为3 x 15 mm的条状滤纸，对较大儿童和成人则裁剪成L形（5 x 20 x 10 mm（L形短臂））。
2. 使用镊子将一片滤纸插入婴儿的每个鼻孔中。将滤纸置于下鼻甲前部（新生儿约插入鼻孔内1 cm，其他年龄段约1.5 cm）。
   1. 将新生儿置于床上，并给予糖水以缓解不适。
      注：对于其他年龄段的儿童，采样时最好让受试者坐在椅子上进行。
   2. 对于较大儿童，将L形滤纸的长臂插入每个鼻孔中。
3. 在鼻孔周围使用鼻夹，以减少不适并防止滤纸意外脱落。
4. 吸收2分钟后取出滤纸。
5. 将滤纸放入标记好的试管中，并立即在-80 °C下冷冻保存。
6. 记录采样当天儿童出现的任何呼吸道感染症状。
7. 记录采样2分钟期间发生的任何打喷嚏、持续哭闹或鼻出血情况。

2. 气道免疫介质的定量分析

1. 从冰箱中随机取最多10个样本。记录样本编号。整个操作过程中将样本置于冰上。
2. 冰上解冻后，将每个受试者双侧鼻腔的滤纸浸入300 µL新配制的缓冲液中（见材料表），每25 mL缓冲液中含一片完整的蛋白酶抑制剂（见材料表）。
   1. 根据滤纸大小调整缓冲液体积。
      1. 对于尺寸为3 x 15 mm的滤纸，使用300 µL缓冲液。
      2. 若仅有一个滤纸，则使用一半体积的缓冲液（150 µL）。
3. 将样本转移至平板振荡器（400 rpm）中振荡5分钟。使用计时器控制时间。
4. 将湿润的滤纸和检测缓冲液转移至装有微离心管的醋酸纤维素滤杯（孔径0.22 µm）中（见材料表）。
5. 在预冷的离心机（4 °C）中以16,000 x g离心5分钟，获得滤过的鼻腔提取物并收集于管中。
6. 取出滤杯，将收集管置于冰上，并将鼻腔提取物分装至低蛋白结合储存板的孔中（见材料表）。
7. 储存于-80 °C，待分析时使用。
8. 使用基于电化学发光的高灵敏度多重阵列系统测定鼻腔提取物中细胞因子和趋化因子的浓度（见材料表）。
   注：本研究中使用了人源10重T_H1/T_H2细胞因子检测、9重趋化因子检测，以及单重IL-17A、TGF-β1和TSLP检测。
   1. 进行检测时，将鼻腔提取物在4 °C下孵育过夜。按照试剂盒标准操作流程进行测定（见材料表）。
      注：所用免疫检测试剂盒（见材料表）通常具有较高的检测动态范围，范围在1 & 10,000 pg/mL之间，某些检测可达100,000 pg/mL。这意味着所有样本可在相同稀释倍数下进行检测，从而避免了健康与疾病受试者因稀释倍数不同而带来的影响，而此类问题是其他类似免疫检测中常见的。所有细胞因子的最低检测限为1 pg/mL或更低，趋化因子的最低检测限在1 & 50 pg/mL之间。在1月龄时，98%的样本中TSLP无法被检测到。

3. 统计学

1. 在分析前对数据进行对数转换，以获得细胞因子和趋化因子水平的正态分布残差。
2. 若样本分多批次进行分析，需对细胞因子和趋化因子数据进行批次校正，并基于对数转换后的数据进行批次间中心化调整。
   1. 结合总体均值并进行反对数变换，以获得原始测量单位的数据。
      注意：每次进行分析时，应考虑调整影响细胞因子和趋化因子水平的变量。这可能包括母体因素（例如， 孕期饮酒与吸烟、哺乳、采样期间的不良事件、兄弟姐妹、家中宠物 等等。

结果

气道免疫特征的基线情况：
在纳入COPSAC₂₀₁₀队列的700名儿童中，有620名（89%）在1月龄时获得了上气道黏膜免疫介质水平的完整数据。其中10名新生儿在检测技术建立之前即已入组，另有19名未参加1月龄随访。此外，47份样本因在另一实验室提取和检测（用于一项预试验研究）而被排除，4份样本在运输过程中丢失（参见研究流程图，图1）。队列的基线特征见表1。

大多数介质的检出水平较低 <10 pg/mL（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、TGF-β1、IFN-γ、TNF-α、CXCL8、CCL13、CCL4 和 CCL17），而 5 种因子的检测限为 >10 pg/mL（CXCL10、CCL2、CCL11、CCL26 和 ...

讨论

通过此处介绍的技术，我们能够确定 体内 早在1月龄儿童中研究上呼吸道黏膜免疫特征，此前尚无此类研究。我们观察到特定呼吸道细菌和鼻病毒的存在^7,11以及其他预 以及围产期暴露因素在新生儿气道免疫谱中得到反映。此外，我们利用这些气道免疫谱数据，研究了一项随机化微量营养素试验中大剂量维生素D的作用机制。这些结果强调了黏膜衬液技术作为一种非侵入性采样方法的有效性和实用性 在体内 气道免疫介质的定量分析

在实施该方法之前，需考虑以下几点：为了检测黏膜衬层液体基质中的细胞因子，必须采用基于高灵敏度的免疫测定技术，例如电化学发光检测方法。使用酶联免疫测定可能导致吸光度读数受到干扰。此外，尽管鼻腔与支气管之间存在密切关联，但在上呼吸道检测免疫谱仍存在局限性。采样操作是在黏膜层的上部进行的，因此我们预期所获取的液体主要反映凝胶层的成分，而非溶胶层。我们未检测黏液层标志物以验证这一点，这是本研究的局限之一。理论上，个体间鼻腔分泌液的差异可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维状羟基聚酯片	Accuwik Ultra	SPR0730	滤纸
Milliplex 检测缓冲液	Millipore	L-AB	缓冲液
低蛋白结合储存板	Thermo Scientific	CLS8161	板
蛋白酶抑制剂	Roche	11873580001	complete EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物
多点板读板仪	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
检测试剂盒	Mesoscale		人10重TH1/TH2细胞因子检测试剂盒、9重趋化因子检测试剂盒，以及单重IL-17A、TGF-β1和TSLP检测试剂盒。相关说明可访问www.mesoscale.com在线获取