本方案描述了一种非侵入性技术，用于采集上呼吸道未受扰动的黏膜衬液。该技术可用于对黏膜衬液中的成分进行定量分析。 体内 各种年龄受试者体内蛋白质介质（如细胞因子和趋化因子）的水平。
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摘要
摘要
本方案描述了一种非侵入性采集未受干扰的上呼吸道黏膜衬液的方法。同时详细介绍了在分析免疫介质之前对液体洗脱物进行提取的步骤，可用于研究上呼吸道局部免疫特征，且无需进行刺激操作（其他技术常需此类步骤）。通过将一片滤纸置于下鼻甲前部并保持2分钟以吸收黏膜衬液来完成采样。随后从滤纸上洗脱分析物，并采用基于电化学发光的免疫分析法检测提取的基于蛋白质的洗脱液，从而在同一份样本中高灵敏度地定量低浓度和高浓度的分析物。我们测定了上呼吸道黏膜中20种预先选定的、与特定免疫信号通路相关的免疫介质的体内水平，但该技术并不局限于这一特定检测面板或采样部位。该方法最初应用于来自哥本哈根儿童哮喘前瞻性研究2000（COPSAC2000）队列中患有变应性鼻炎的7岁儿童，之后进一步用于纵向COPSAC2010出生队列，在1个月、2岁、6岁时以及出现急性呼吸道症状时进行采样。我们在700名1个月大的婴儿中成功获取并分析了620例（89%）样本；少数样本低于检测下限（报告为中位数（四分位距（IQR）））。每种介质检测下限以下的样本数量（即 从0到设定的最低检测限）为29例（7.25 - 119.5）。该技术可实现自出生起对呼吸道黏膜免疫谱的体内定量，适用于纵向研究，并可用于遗传因素与生命早期环境暴露的影响、呼吸系统疾病的病理生理学、内型分型及监测，以及新型治疗手段的研发与评估。
引言
鼻腔黏膜衬里液构成了上呼吸道系统的液体部分。它由上皮细胞与构成抵御入侵微生物第一道防线的免疫细胞相互作用所产生的多种介质组成。鼻黏膜易于接近，且鼻腔与支气管之间存在密切的功能和免疫学关联1。该区域在儿童期常见的呼吸道疾病（如哮喘和过敏性鼻炎）研究中具有特殊意义，同时也与多种在成年后更为常见的呼吸系统疾病相关。
本文介绍了一种利用基于滤纸的无创技术，从鼻腔中采集未受干扰的黏膜衬里液的方法，以及随后从滤纸上洗脱基于蛋白质的分析物以进行定量的提取步骤。例如，该技术可用于获取健康个体及患有各种呼吸系统疾病的个体的体内免疫特征。此外，还可用于分析与特定免疫特征相关的重要暴露因素，并评估该特征是否为后续疾病发展的预测因子或中介因子。
此前，黏膜衬层液体通过鼻腔灌洗法获取2，该方法通常需先进行鼻腔激发试验，即引入高浓度的过敏原以诱发炎症反应3,4。然而，鼻腔灌洗技术在年幼儿童中不可行，且会引入未知的稀释因素，导致稀释后的介质浓度可能低于检测方法的检测限，从而干扰实验结果5。此外，由于稀释因素未知，不同个体间鼻腔激发试验所测得的分析物反应无法相互比较，限制了该技....
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方案
研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则进行。已获得哥本哈根伦理委员会（COPSAC2000 项目编号 KF 01-289/96，COPSAC2010 项目编号 H-B-2008-093）以及丹麦数据保护局的批准，并在纳入每位受试者前获得其父母双方的书面知情同意。
1. 实验设置
- 使用滤纸片（纤维状羟基化聚酯片，参见材料表）6,7。
- 为1个月大的婴儿裁剪尺寸为3 x 15 mm的条状滤纸，对较大儿童和成人则裁剪成L形（5 x 20 x 10 mm（L形短臂））。
- 使用镊子将一片滤纸插入婴儿的每个鼻孔中。将滤纸置于下鼻甲前部（新生儿约插入鼻孔内1 cm，其他年龄段约1.5 cm）。
- 将新生儿置于床上，并给予糖水以缓解不适。
注：对于其他年龄段的儿童，采样时最好让受试者坐在椅子上进行。 - 对于较大儿童，将L形滤纸的长臂插入每个鼻孔中。
- 将新生儿置于床上，并给予糖水以缓解不适。
- 在鼻孔周围使用鼻夹，以减少不适并防止滤纸意外脱落。
- 吸收2分钟后取出滤纸。
- 将滤纸放入标记好的试管中，并立即在-80 °C下冷冻保存....
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结果
气道免疫谱的基线特征：
在纳入COPSAC2010队列的700名儿童中，有620名（89%）在1月龄时获得了上气道黏膜免疫介质水平的完整数据。其中10名新生儿是在检测技术建立之前入组的，另有19名未参加1个月随访。此外，47份样本因在另一实验室提取和检测（用于预试验研究）而被排除，4份样本在运输过程中丢失（见研究流程图，图1）。队列的基线特征见表1。
大多数介质的检出水平较低 <10 pg/mL（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、TGF-β1、IFN-γ、TNF-α、CXCL8、CCL13、CCL4 和 CCL17），而 5 种因子的检测水平 >10 pg/mL（CXCL10、CCL2、CCL11、CCL26 和 CCL2.......
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讨论
通过此处介绍的技术，我们能够确定 体内 早在1月龄儿童中研究上呼吸道黏膜免疫特征，此前尚无此类研究。我们观察到特定呼吸道细菌和鼻病毒的存在7,11以及其他预 以及围产期暴露因素在新生儿气道免疫谱中得到反映。此外，我们利用这些气道免疫谱数据，研究了一项随机化微量营养素试验中大剂量维生素D的作用机制。这些结果强调了黏膜衬液技术作为一种非侵入性采样方法的有效性和实用性 在体内 气道免疫介质的定量分析
在实施该方法之前，需考虑以下几点：为了检测黏膜衬层液体基质中的细胞因子，必须采用基于高灵敏度的免疫测定技术，例如电化学发光检测方法。使用酶联免疫测定可能导致吸光度读数受到干扰。此外，尽管鼻腔与支气管之间存在密切关联，但在上呼吸道检测免疫谱仍存在局限性。采样操作是在黏膜层的上部进行的，因此我们预期所获取的液体主要反映凝胶层的成分，而非溶胶层。我们未检测黏液层标志物以验证这一点，这是本研究的局限之一。理论上，个体间鼻腔分泌液的差异可能.......
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披露
所有作者均声明，对本文稿内容不存在任何潜在、感知或实际的利益冲突。资助机构在研究的设计与实施、数据的收集、管理与解释，以及文稿的撰写、审阅和批准过程中均未发挥任何作用。本研究未涉及任何制药公司。
致谢
我们感谢COPSAC2010队列研究中的儿童及其家庭所提供的所有支持与配合。我们谨向COPSAC研究团队的成员致以诚挚谢意，并感谢丹麦技术大学技术员Lisbeth Buus Rosholm在细胞因子和趋化因子检测方面提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纤维状羟基聚酯片 | Accuwik Ultra | SPR0730 | 滤纸 |
| Milliplex 检测缓冲液 | Millipore | L-AB | 缓冲液 |
| 低蛋白结合储存板 | Thermo Scientific | CLS8161 | 板 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物 |
| 多点板读板仪 | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| 检测试剂盒 | Mesoscale | 人10重TH1/TH2细胞因子检测试剂盒、9重趋化因子检测试剂盒，以及单重IL-17A、TGF-β1和TSLP检测试剂盒。相关说明可访问www.mesoscale.com在线获取 |
参考文献
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflamm....
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