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通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

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DOI：

10.3791/55803

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2017年7月21日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

本文内容

摘要

我们提出了一种新方法，该方法利用光响应性嵌段共聚物实现高效的时间和空间基因沉默控制，且未检测到脱靶效应。此外，通过简单的siRNA释放实验和简化的动力学建模即可预测基因表达的变化。

摘要

需要新的材料和方法来更好地控制结合过程 与 用于需要精确调控基因活性的多种应用中核酸的释放。特别是，具有改进的空间和时间控制能力的新型响应性材料将为药物发现和再生医学技术提供可转化的平台。此外，增强对材料中核酸释放的控制能力，将有助于开发简化的预测纳米载体功效的方法 先验的，从而加快递送载体的筛选。本文介绍了一种通过模块化光响应纳米载体系统预测基因沉默效率并实现基因表达时空控制的实验方案。小干扰RNA（siRNA）与mPEG-b-聚(5-(3-(氨基)丙氧基)-2-硝基苄基甲基丙烯酸酯) (mPEG-b-（APNBMA）聚合物形成稳定的纳米载体，可通过光调控实现可调的、开关式siRNA释放。我们提出了两种互补的检测方法，分别采用荧光相关光谱和凝胶电泳，用于精确量化模拟细胞内环境溶液中siRNA的释放情况。这些检测所获得的信息被整合到一个简化的RNA干扰（RNAi）动力学模型中，以预测在不同光刺激条件下基因沉默的动态响应。基于此，优化的照射条件进一步完善了一种用于时空控制基因沉默的新方案。该方法可实现单细胞分辨率的基因表达空间模式调控，且未检测到脱靶效应。综上所述，本方法提供了一种易于使用的策略，用于预测基因表达的动态变化，并在时间和空间上精确调控siRNA活性。这一系列检测方法可便捷地推广应用于测试多种其他刺激响应系统，以应对生物医学研究和临床医学中广泛存在的关键挑战。

引言

小干扰RNA（siRNAs）通过一种催化性RNA干扰通路介导转录后基因沉默，该通路具有高度特异性、高效性，并可针对几乎任何目的基因进行定制。1这些有前景的特性已推动siRNA疗法进入针对多种疾病（包括转移性黑色素瘤和血友病）的人体临床试验阶段。2,3然而，仍然存在显著的递送问题，阻碍了其转化应用4特别是递送载体必须保持稳定，并保护siRNA免受细胞外降解，同时还能将有效载荷释放到细胞质中5此外，许多RNAi应用需要更优的方法来在空间和时间上调控基因沉默6，这将减少siRNA治疗中的副作用7 并推动从用于药物发现的细胞微阵列到各类应用的变革性进展8 用于调控再生支架中的细胞反应9这些挑战凸显了开发新材料和新方法以更好地控制结合的必要性 与 siRNA 纳米载体中的释放

控制siRNA释放并增强时空调控的最有前景的策略之一是使用刺激响应性材料10。例如，已有多种生物材料被设计为可响应氧化还原电位或pH值的变化，或外加磁场、超声、光照等刺激，从而改变其对核酸的结合亲和力11。尽管这些系统中的许多已展现出对核酸活性更精确的控制，但以光作为触发信号尤为有利，因其具有瞬时的时间响应、精确的空间分辨率以及易于调节的特性12。此外，先进的可诱导启动子系统和光遗传学调控系统已证明光敏技术在调控基因表达方面的潜力；然而，这些系统仍面临诸多挑战，包括调控内源基因的能力有限、安全性问题（如免疫原性），以及多组分复合体系递送困难等13,14,15。光响应型siRNA纳米载体恰好能够克服这些缺点，为基因表达的时空调控提供一种更简单且更稳健的策略16,17,18。遗憾的是，目前仍缺乏准确预测蛋白敲降效果的方法。

一个关键挑战在于，对siRNA释放的定量评估十分罕见19,20，即使进行了此类评估，也未将其与siRNA/蛋白质周转动力学的分析相结合。所释放siRNA的量及其持续时间/寿命均是决定基因沉默动力学的重要因素；因此，缺乏此类信息导致了RNAi中剂量-效应关系准确预测的重大脱节21。解决这一挑战将加速纳米载体中结构-功能关系的建立，并为生物材料设计提供更明确的指导22。此外，此类方法将有助于开发更有效的siRNA给药方案。为了理解动态沉默响应，多个研究团队已探索了RNAi的数学模型23,24,25。这些模型成功揭示了siRNA介导的基因表达变化，并识别出限速步骤26。然而，这些模型仅应用于无法实现可控siRNA释放的商用基因递送系统（例如，Lipofectamine和聚乙烯亚胺（PEI）），且模型本身的复杂性严重限制了其应用价值27。这些不足凸显了对新型材料的需求：这类材料需能够实现siRNA释放的精确调控，并结合简化且易于使用的预测性动力学模型。

我们的方法通过整合一种光敏纳米载体平台与联用技术，以定量游离siRNA并模拟RNA干扰动态，从而应对上述所有挑战。特别是，该平台可精确控制siRNA的释放28 通过两种互补的方法进行监测，以准确定量包封的 与 游离siRNA。这些实验的数据被输入一个简单的动力学模型，以预测基因沉默效率 先验的29最后，这种纳米载体的开关特性可被轻易利用，以在细胞尺度上实现对基因表达空间分布的精确控制，从而生成特定的细胞表达模式。因此，该方法提供了一种易于调整的策略，可用于在多种需要时空调控细胞行为的应用中，实现对基因沉默的控制与预测。

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方案

1. siRNA 纳米载体的制备

  1. 分别配制 siRNA 和 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液，等体积稀释于 pH 6.0 的 20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸 (HEPES) 缓冲液中。
    1. 将 siRNA 以 32 µg/mL 的浓度加入 20 mM HEPES 溶液中。
      注：所用 siRNA 为非靶向的通用阴性对照序列；但也可根据需要设计为靶向任意目的基因的序列。
    2. 将 mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物溶解于 20 mM HEPES 溶液中。加入适量 mPEG-b-P(APNBMA)，配制成 220 µg/mL 的溶液，使 N/P 比值（N 代表 mPEG-b-P(APNBMA) 上的胺基，P 代表 siRNA 上的磷酸基团）为 4。
      注：mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物的合成方法已在其他文献中报道30。
  2. 在涡旋混合器上轻轻混匀的同时，将 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中。加完聚合物后继续涡旋混合 30 秒。将样品避光、室温孵育 30 分钟。

2. 使用凝胶电泳检测siRNA释放

  1. 根据步骤1.1-1.2制备纳米载体，并按所需样本数量相应调整体积。
  2. 将纳米载体与十二烷基硫酸钠（SDS）混合。
    1. 配制1 mg/mL的SDS水溶液。分装所需体积的SDS溶液，以制备S/P比值（S代表SDS上的硫酸根，P代表siRNA上的磷酸根）为15的溶液。
      注意：如果聚复合物溶液含有 1 µg siRNA的 13 µg 需加入SDS以达到15的S/P比。
    2. 将SDS溶液逐滴加入每种纳米载体溶液中，同时在涡旋仪上轻轻混合。加入SDS后继续涡旋30秒。
    3. 将样品在3,000 x g离心5秒。将样品在室温下避光孵育30分钟。
  3. 校准并设置带有365 nm滤光片的紫外激光器，使其强度为200 W/m²。确保从样品溶液底部所处位置测量光强度。
  4. 将纳米载体/SDS 溶液加入由橡胶垫片隔开的载玻片构成的玻璃腔室中。
    1. 将载玻片在体积比为7:3的乙醇/水溶液中预清洗，然后彻底干燥。在橡胶垫片上切出一个孔（约2 × 3 cm的矩形）。将橡胶垫片置于载玻片上。
    2. 将纳米载体/SDS 溶液用移液器滴加到橡胶垫圈孔洞内的载玻片上。加入过量溶液（20 µL 过量）置于载玻片上，同时避免接触橡胶垫圈。
      注意：后续步骤中会损失部分液体。
    3. 将第二张载玻片放在载玻片-垫片组件上方。为避免产生气泡，先将载玻片一端放下，再缓慢降低另一端。
    4. 在玻璃腔室的每一侧安装 binder clips 以保持其闭合。
  5. 照射样品所需的时间（例如，0-60 分钟）使用波长为 365 nm 滤光片的紫外激光，强度为 200 W/m。取下文件夹夹子并打开反应室。
  6. 移液器 25 µL 将辐照后的纳米载体/SDS 样品加入微量离心管中。在室温下避光孵育 30 分钟。
  7. 制备含有预染的2 wt%琼脂糖凝胶 0.5 µg/mL 根据标准方案，在Tris/Borate/EDTA（TBE）缓冲液中使用溴化乙锭31. 准备由3:7（v/v）甘油/水组成的上样缓冲液。
  8. 添加 5 µL 上样缓冲液溶液 25 µL 每种纳米载体/SDS 样品。将样品在室温下避光孵育 10 分钟。
  9. 加载 30 µL 将每种纳米载体/SDS样品加入2%琼脂糖凝胶中。在避光条件下以100 V电压电泳运行30分钟。使用配备溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统拍摄凝胶图像。保存凝胶图像文件，并进入步骤2.10进行条带强度定量。确保条带信号强度足够明亮以清晰可见，但不可过强导致信号饱和。
  10. 使用公开可用的 ImageJ 软件对条带强度进行定量分析32.
    1. 使用 ImageJ 的 ROI 工具，通过在每条带周围绘制矩形来测定各泳道中游离 siRNA 条带的荧光强度。绘制每条泳道的强度曲线，并通过在强度曲线下方绘制一条水平线，然后点击封闭区域内的轮廓魔棒，对曲线下面积进行积分。
    2. 通过将每个样本的曲线下面积除以siRNA阳性对照（无mPEG-）的曲线下面积，计算各泳道的相对强度。b-（添加P(APNBMA)且未添加SDS）。以各样品条带强度的归一化值报告siRNA释放的百分比。

3. 使用荧光相关光谱法（FCS）测量siRNA释放

  1. 获取在正义链5'端标记有单一荧光染料的siRNA。
    注意：siRNA可购买已预先退火且荧光标记位于所需位置的产品。所选荧光染料应具有光稳定性，并在450至750 nm之间吸收/发射荧光，以避免紫外光淬灭以及与mPEG-b-P(APNBMA)之间的能量转移。
  2. 根据步骤1.1–1.2使用标记的siRNA配制纳米载体。按所需样本数量相应调整各组分体积。
  3. 将溶液在SDS中孵育，并根据步骤2.2–2.6在指定时间内进行辐照。
  4. 荧光相关光谱（FCS）样品池的制备。
    1. 用7:3（v/v）乙醇/水溶液清洗载玻片，并使用擦拭纸和气流彻底干燥玻璃表面。
    2. 撕下双面粘性垫片上的保护纸，露出粘性面，将垫片贴附到盖玻片上。
    3. 用移液器将纳米载体/SDS溶液滴加至盖玻片上粘性垫片孔洞的中央位置。
    4. 将载玻片盖在盖玻片上方，轻压载玻片以确保两者紧密贴合并形成密封。
  5. 使用共聚焦显微镜进行FCS测量33。采用数值孔径为1.2的40倍水浸消色差物镜，通过适当的激发激光通道（488 nm）对每个样品至少采集30次、每次10秒的测量数据34。确保每个样品的激光强度和探测器校准保持一致。
    1. 除实验样品外，还需测量对照样品，包括：不含标记siRNA的空白样品；以及仅含标记siRNA但不含mPEG-b-P(APNBMA)的游离siRNA样品。
  6. 使用专用于FCS的数据分析软件进行处理。通过确定无纳米载体通过共聚焦检测体积时的稳定计数率，确定各样品的基线计数率29。
    1. 从每个样品的基线计数率中减去空白样品的计数率。将所得值归一化至游离siRNA对照，以计算游离siRNA的百分比35。

4. 预测基因沉默的动态建模

  1. 使用一组简单的常微分方程编写数学编程语言脚本，以预测基因沉默效果29。
    注：可根据要求提供脚本。
    1. 将常微分方程组写为：
      figure-protocol-1     (1)
      figure-protocol-2     (2)
      figure-protocol-3     (3)
      注：对于方程 1−3，kmRNA、ksiRNA 和 kprot 分别表示 mRNA、siRNA 和蛋白质的生成速率常数；km,deg、ks,deg 和 kp,deg 分别表示 mRNA、siRNA 和蛋白质的降解速率常数。降解速率常数根据各组分的半衰期计算得出，而生成速率常数则通过拟合确定，以确保在无 siRNA 存在时 mRNA 和蛋白质达到稳态水平。
      1. 通过实验（如参考文献36中所述）或文献数据确定目标基因的 mRNA 和蛋白质的半衰期（参见讨论部分）。同时确定细胞系的倍增时间。将这些值输入相应的降解速率表达式中。
      2. 调节生成速率常数，使得在未引入 siRNA 的情况下，基因表达水平保持在归一化值 100 的稳态。具体而言，将 [siRNA] 设为零，并调整 kmRNA、ksiRNA 和 kprot 的生成速率常数，直至在模拟期间 [mRNA] 和 [protein] 的值保持在初始归一化值 100% 的 1% 范围内。
      3. 利用前述凝胶电泳和 FCS 检测所测得的 siRNA 释放相对量作为估计值，调整脚本中 siRNA 的初始相对浓度。具体而言，使 [siRNA] 与释放的 siRNA 相对量成正比，其中数值 100 对应最大释放量29。

5. 细胞培养与 体外 siRNA 递送

  1. 按照供应商提供的方案培养 NIH/3T3 小鼠胚胎成纤维细胞。
    1. 在生长培养基（含10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））中培养细胞。将细胞维持在 37 °C 在含5% CO₂的加湿环境中2.
  2. 将细胞接种于6孔组织培养处理板中。
    1. 按照供应商推荐的传代培养程序进行操作。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞用添加补充物的生长培养基稀释至浓度为75,000个细胞/mL。
    2. 向6孔板的每个孔中加入2 mL细胞悬液（75,000个细胞/mL）。将细胞置于培养箱中孵育，贴壁并恢复24 h。
  3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并加入1.5 mL无血清和抗生素的转染培养基，以准备转染（参见 材料表) 加入每个孔中。
  4. 根据步骤1.1-1.2制备siRNA纳米载体。添加 25 µL 每孔加入含30 pmol siRNA的纳米载体溶液。轻轻吹打混匀培养基。将细胞置于培养箱中孵育3 h。
  5. 吸除转染培养基，用 PBS 洗涤每孔。加入 1 mL 添加物补充的生长培养基，将细胞放入培养箱中孵育 30 分钟以恢复。
  6. 为给予光刺激处理而准备细胞，需移除添加了补剂的生长培养基，向每孔加入 1 mL 转染培养基（不含酚红）。
    注意：确保转染培养基中不含酚红。
  7. 校准并设置带有365 nm滤光片的紫外激光器，使其强度为200 W/m²。确保从细胞板底部所处位置进行光强测量。
  8. 将细胞置于设定温度的加热板上 37 °C. 移去细胞培养板的盖子，使用配备365 nm滤光片、强度为200 W m⁻²的紫外激光从培养板上方照射细胞，照射时间根据需要设定（最长不超过20分钟）。-2.
  9. 吸除转染培养基，加入 2 mL 补充完全的生长培养基。放入培养箱中孵育，待后续分析。例如，qPCR 为 24 小时，Western blotting 为 48 小时。
    1. 使用多种技术（如蛋白质印迹法）检测基因表达水平的变化37 和 qPCR。38 对于具有可见信号的基因（如 GFP），使用荧光显微镜观察29.
      注意：建议使用这些技术是因为它们操作简便且在定量基因表达方面具有较高的准确性

6. 以时空特异性方式调控基因沉默

  1. 按照步骤 5.1–5.7 培养、接种并转染细胞。
  2. 制备一种能完全阻挡365 nm光并最大限度减少反射的光掩模。
    注意：本实验中，使用 10 cm × 10 cm 的铝箔片阻挡光线，使用黑色卡纸减少反光。铝箔与黑色卡纸粘合在一起，形成一个整体单元。
    1. 在光掩模上切割/打孔/加工出所需的形状。例如，分别使用锋利的刀片和打孔器在光掩模上形成直线图案（约5 cm长）和圆形图案（约7 mm直径）。
  3. 将光刻掩模的抗反射面朝下，用胶水固定在6孔板底部，使图案居中对准含有细胞的孔。例如，黑色卡纸）朝向培养板。确保胶水不涂抹在图案边缘附近（约3 mm内）。
  4. 将两个铁架台放置在相距约25 cm的位置，并在每个铁架台上安装一个平台，使两个平台高度相同。将细胞培养板置于两平台顶部之间并悬空架设，确保培养板水平。
  5. 从样品底部使用配备365 nm滤光片、强度为200 W/m²的紫外激光照射细胞，照射时间根据需要设定（最长不超过20分钟）。2.
  6. 移除转染培养基，加入2 mL添加了补加物的生长培养基。放入培养箱中恢复至少24小时。按照所述方法使用荧光显微镜对细胞进行成像29.

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结果

纳米载体构建完成后，进行了siRNA释放实验，以确定后续实验中所采用的辐照条件 体外 转染实验中，通过施加不同剂量的光照以确定siRNA的释放百分比。第一项检测采用凝胶电泳法，将游离的siRNA分子与仍与聚合物形成复合物或结合状态的siRNA分子分离开。未经光照处理的纳米载体保持稳定，未释放任何siRNA。随着照射时间的延长，游离siRNA条带的荧光强度逐渐增强。利用图像分析软件对条带强度进行定量分析表明，经20分钟光照后，约有15%的siRNA被释放。

第二种siRNA释放实验采用FCS测量溶液中自由扩散的siRNA分子的百分比。未暴露于光照的纳米载体样品的基线计数率与空白缓冲液对照样品的计数率相同，表明不存在游离的siRNA。随着照射时间的增加，基线计数率上升。计算得到的游离siRNA百分比与凝胶电泳测得的结果一致。通常情况下，两种技术的估算结果在误差范围内相互吻合（经Student's t检验，p >0.05），并表明s...

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讨论

该方法中有几个步骤尤为关键。在制备纳米载体时，组分添加顺序和混合速度是影响其效能的两个重要参数39。本方案要求将阳离子组分 mPEG-b-P(APNBMA) 在涡旋振荡条件下逐滴加入阴离子组分 siRNA 中。根据总体积的不同，该混合过程通常持续 3–6 秒。为检测纳米载体是否成功形成，可采用动态光散射等技术测定其粒径分布。当 N/P 比值为 4 时，mPEG-b-P(APNBMA)/siRNA 纳米载体的平均直径约为 140 nm，多分散系数约为 0.228。此外，可通过调节 N/P 比值获得不同尺寸和稳定性的聚合物复合物。本研究中选择 N/P 比值为 4，因为这是能够实现溴化乙锭染色完全阻滞和消除的最低比值。

该方法中的另一个关键参数是在siRNA释放实验中向纳米载体溶液中添加SDS。SDS是一种阴离子表面活性剂，用于更好地模拟含有高浓度脂质膜和多阴离子的细胞内环境29,

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所通过资助号为 P20GM103541 的机构发展奖（IDeA）以及资助号为 P20GM10344615 的项目提供的资金支持。本文所述内容并不代表 NIH 的观点。我们还感谢特拉华生物技术研究所（DBI）和特拉华州经济发展办公室（DEDO）通过生物科学先进技术中心（Bioscience CAT）奖项（编号：12A00448）提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
siRNASigma-AldrichSIC001非靶向通用阴性对照
mPEG-b-P(APNBMA)本实验室合成N/A光响应性聚合物
HEPESFisher ScientificBP310-100
十二烷基硫酸钠 Sigma-Aldrich436143
橡胶垫圈McMaster-Carr3788T210.5 mL 厚
紫外激光器 Excelitas TechnologiesOmnicure S2000使用准直透镜和 365 nm 滤光片
琼脂糖Fisher ScientificBP160-100
溴化乙锭Fisher ScientificBP1302-10
标记 Dy547 的 siRNAGE Healthcare Dharmacon, Inc.定制订单荧光染料连接于正义链 5’ 端
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-A3预清洁玻璃
Secure-Seal 间隔片Life TechnologiesS24735双面粘合
LSM 780 Carl ZeissN/A共聚焦显微镜
ZEN 2010Carl ZeissN/AFCS 分析软件
MATLABMathWorksN/A编程语言
NIH/3T3 细胞 ATCCATCC CRL-1658
DMEMMediatech10-013-CV生长培养基
胎牛血清Mediatech35-011-CV热灭活
青霉素-链霉素Mediatech 30-002-CI
6 孔板Fisher Scientific08-772-1B
Opti-MEMLife Technologies11058021转染培养基

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