中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

摘要

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1 g）收集Drosophila胚胎，并制备可用于后续蛋白质组学应用（如亲和纯化-质谱分析，AP-MS）的蛋白质提取物。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析已成为研究生物学过程与机制（如细胞信号传导、生物体发育和疾病）不可或缺的方法。通常希望使用体内材料获取PPI信息，以获得最自然且无偏倚的相互作用网络视图。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是研究体内PPI的优良平台，并且适用于生化实验材料的简便分离。特别是果蝇胚胎，是研究PPI的一种便捷组织类型，因为该发育阶段的个体易于收集，且大多数蛋白质在胚胎发生过程中均有表达，从而为揭示大多数PPI提供了相关性高的环境。本文介绍一种中等规模（0.5–1 g）果蝇胚胎收集的实验方案，该数量适用于多种蛋白质组学应用，包括通过亲和纯化-质谱法（AP-MS）分析PPI。我们描述了用于胚胎收集的1 L和5 L培养笼的设计，这些装置可在任何实验室中简单且低成本地搭建。我们还提供了一般性的胚胎收集与蛋白质提取方案，以制备可直接用于后续实验（如AP-MS）的裂解液。我们的目标是为所有研究人员提供一种便捷可行的方法，以开展体内PPI分析。

引言

遗传筛选以及近期发展的基因组学方法已彻底改变了生物学功能的研究。然而，重要的细胞信息编码于蛋白质及其相互作用伙伴的集合之中。尽管传统的遗传修饰因子筛选能够鉴定限速通路组分并发现间接相互作用，蛋白质组学方法的优势在于其能够识别目标蛋白质完整的直接相互作用网络。因此，蛋白质组学是一种研究生物系统的宝贵正交方法，可与基因组学、转录组学以及传统遗传筛选相互补充。亲和纯化-质谱联用技术（AP-MS）已被证明是一种强大的方法，可用于在细胞和组织的天然环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）^1,2。该方法能够在特定发育阶段或组织背景下鉴定直接或间接的相互作用，并已成功应用于多种发育通路中多个新PPI的发现（详见参考文献¹的综述）。尽管PPI研究取得了无可争议的成功，但大多数研究是在培养细胞中进行的，其中目标“"诱饵"”蛋白通常被过表达。在细胞培养中研究PPI存在两个问题：首先，特定的细胞系可能由于某些蛋白质表达缺失而无法提供完整的相互作用谱；其次，此类分析中常用的高水平过表达可能导致诸如蛋白质错误折叠或假阳性相互作用被鉴定等人为假象。

通过分析蛋白质相互作用（PPIs），上述两种局限性均可得到克服 体内此类实验的限制步骤在于用于纯化蛋白质复合物的起始材料的可获得性。 黑腹果蝇

方案

1. 准备可容纳15 cm培养皿的5 L果蝇饲养笼

1. 准备所需材料：一个带盖的5夸脱（4.7 L）容器（图1A）、尼龙网和一把剃刀片。
2. 用剃刀片在容器底部标记一个直径12 cm的圆，并切割出一个孔（图1B）；在盖子上切割一个直径15 cm的孔（图1C）。
3. 将尼龙网裁剪成25 cm × 25 cm的正方形。
4. 将尼龙网覆盖在容器的上边缘，然后用盖子压紧（图1C）。确保尼龙网绷紧且盖子不倾斜。该饲养笼现已准备就绪，可用于放置果蝇（参见步骤5.3）。

2. 准备适合10 cm培养皿的1 L果蝇饲养笼

1. 准备所需材料：电钻、3 英寸（76 mm）切割工具（图 1E 和 图 1F）、带盖的直壁 1 L 塑料罐、尼龙网、剃刀刀片、砂纸、护目镜和工作手套。
2. 在塑料罐底部和盖子上钻出 3 英寸（76 mm）的孔（图 1G），钻孔时需将盖子紧密旋紧....

结果

为了说明本方案在蛋白质复合物纯化实验中的应用，我们构建了一种纯合可存活的果蝇品系 arm-EGFP-ERK，该品系在普遍表达的 armadillo（arm）启动子控制下表达带有EGFP标签的Drosophila细胞外信号调节激酶（ERK，由rolled基因编码）^18,19。arm启动子在Drosophila胚胎发育的大多数阶段均有活性¹⁹。根据所述方案制备裂解液，并通过针对总ERK蛋白的Western印迹检测来确认arm-EGFP-ERK转基因所表达的蛋白，同时检测内源性和转基因EGFP-ERK的水平，其迁移位置分别为42 kDa和69 kDa（图2A）。在y w对照品系中仅检测到一条对应于.......

讨论

本文介绍的方案是一种用于建立中等规模 Drosophila 种群培养笼并从胚胎中制备全细胞蛋白提取物的简单且通用的方法。所获得的提取物可用于多种后续实验，例如在亲和树脂上纯化蛋白复合物。为最大限度减少蛋白质降解，提取步骤必须在冰上操作，并使用强效的蛋白酶抑制剂。如文中所述，该方案适用于分离大多数细胞质蛋白以及部分膜结合蛋白和可溶性核蛋白^6,10,12,15。该方法也可轻松调整，用于更特异性地纯化其他亚细胞组分中的蛋白质，例如通过高盐提取法分离溶解度较低的核蛋白⁵。如步骤5.8所述，可通过精确设定收集时间和胚胎发育时间，以获得不同发育阶段的样本。

通常需要确认目标标记蛋白的表达水平与内源性表达水平相近，这一点我们已通过使用抗总ERK抗体证明

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leaktite 5夸脱天然多用途混合容器（3件装）	家得宝	209330	用于制作5升笼子。
Leaktite 5夸脱天然多用混合盖（3个装）	家得宝	209320	直径8.37英寸，适用于5升笼具的盖子
Fisherbrand 透明盖培养皿，100 × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	材料：聚苯乙烯。与1升笼子配合使用。
Fisherbrand 透明盖培养皿，150 × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	材料：聚苯乙烯。与5升笼子配合使用。
Fisherbrand 透明盖培养皿，60 × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	材料：聚苯乙烯。用于胚胎去壳过程。
Sefar NITEX 尼龙网眼织物	Sefar	03-180/44	180 微米，44% 开放面积，用于果蝇饲养笼。
Milwaukee 3 英寸 Hole Dozer 孔锯（带刀柄）	家得宝	49-56-9670	用于制作1升培养笼的3英寸切割工具。
Nalgene 宽口直边 PMP 瓶，带白色聚丙烯螺旋盖	Fisher Scientific	11-823-33	用于制作1-L笼子。Thermo Scientific 货号 # 21171000。可使用其他1-L容器替代。
红星牌活性干酵母，2磅装 pouch	红星		可从 Amazon.com 或其他供应商处购买。
冷冻100%苹果汁浓缩液			可从杂货店购买。必须说明 "100% 苹果汁" 在罐子上。
对羟基苯甲酸甲酯	Acros Organics	AC126965000	又称对羟基苯甲酸甲酯或Tegosept，用于AJ培养基中作为防腐剂。
分子生物学用 IGEPAL CA-630，100 ml	Sigma	I8896	用于配制裂解缓冲液。
带CN膜的Nalgene快速流速无菌一次性滤器单元	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 μm孔径。用于过滤5倍裂解缓冲液。Thermo Scientific 货号 # 1260020。
CO-RO ROCHE cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	11697498001	20片装小瓶。用于裂解缓冲液中蛋白酶抑制。
Corning SFCA 注射器滤器	Fisher Scientific	09-754-21	SFCA 膜，直径 26 mm，孔径 0.45 μm. 用于过滤最终提取物样品。
BD 无针鲁尔锁一次性注射器	Fisher Scientific	14-823-2A	用于过滤最终提取样品。BD 货号 # 309604。
漂白剂	Clorox		用于胚胎去壳，按50%（体积/体积）比例溶于水，可在任意超市购买。必须使用Clorox品牌，因为其他品牌可能导致去壳不完全或对胚胎产生毒性。
康宁Costar网状培养板	Fisher Scientific	07-200-213	用于胚胎收集的网状容器。74 μm 孔径，6 孔板
Wheaton Dounce 组织研磨器，容量 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	用于胚胎的匀浆器，配松紧两种研杵。Wheaton 货号 # 357544。