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方法文章

中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

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DOI：

10.3791/55804

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2017年5月30日

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

本文内容

摘要

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1 g）收集Drosophila胚胎，并制备可用于后续蛋白质组学应用（如亲和纯化-质谱分析，AP-MS）的蛋白质提取物。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析已成为研究生物学过程与机制（如细胞信号传导、生物体发育和疾病）不可或缺的方法。通常希望使用体内材料获取PPI信息，以获得最自然且无偏倚的相互作用网络视图。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是研究体内PPI的优良平台，并且适用于生化实验材料的简便分离。特别是果蝇胚胎，是研究PPI的一种便捷组织类型，因为该发育阶段的个体易于收集，且大多数蛋白质在胚胎发生过程中均有表达，从而为揭示大多数PPI提供了相关性高的环境。本文介绍一种中等规模（0.5–1 g）果蝇胚胎收集的实验方案，该数量适用于多种蛋白质组学应用，包括通过亲和纯化-质谱法（AP-MS）分析PPI。我们描述了用于胚胎收集的1 L和5 L培养笼的设计，这些装置可在任何实验室中简单且低成本地搭建。我们还提供了一般性的胚胎收集与蛋白质提取方案，以制备可直接用于后续实验（如AP-MS）的裂解液。我们的目标是为所有研究人员提供一种便捷可行的方法，以开展体内PPI分析。

引言

遗传筛选以及近期发展的基因组学方法已彻底改变了生物学功能的研究。然而，重要的细胞信息编码于蛋白质及其相互作用伙伴的集合之中。尽管传统的遗传修饰因子筛选能够鉴定限速通路组分并发现间接相互作用，蛋白质组学方法的优势在于其能够识别目标蛋白质完整的直接相互作用网络。因此，蛋白质组学是一种研究生物系统的宝贵正交方法，可与基因组学、转录组学以及传统遗传筛选相互补充。亲和纯化-质谱联用技术（AP-MS）已被证明是一种强大的方法，可用于在细胞和组织的天然环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）1,2。该方法能够在特定发育阶段或组织背景下鉴定直接或间接的相互作用，并已成功应用于多种发育通路中多个新PPI的发现（详见参考文献1的综述）。尽管PPI研究取得了无可争议的成功，但大多数研究是在培养细胞中进行的，其中目标“"诱饵"”蛋白通常被过表达。在细胞培养中研究PPI存在两个问题：首先，特定的细胞系可能由于某些蛋白质表达缺失而无法提供完整的相互作用谱；其次，此类分析中常用的高水平过表达可能导致诸如蛋白质错误折叠或假阳性相互作用被鉴定等人为假象。

通过分析蛋白质相互作用（PPIs），上述两种局限性均可得到克服 体内此类实验的限制步骤在于用于纯化蛋白质复合物的起始材料的可获得性。 黑腹果蝇 长期以来被用作功能分析的模型，最近也被证明是研究蛋白质相互作用（PPIs）的优良体系 体内. 黑腹果蝇 胚胎发生是研究蛋白质相互作用（PPI）的一个极具吸引力的组织类型，因为胚胎可以大量且易于收集，同时也因为大多数基因（>88%）在胚胎发生过程中表达，从而提供了一个丰富的 体内 检测相关蛋白质相互作用的环境3.

传统上，果蝇的生化研究需要大规模的胚胎收集（100–150 g），例如纯化具有功能活性的转录裂解物所需的样本量4,5。以往在Drosophila中进行的亲和纯化-质谱（AP-MS）研究同样需要大量胚胎（5–10 g），因为这些研究依赖于两步纯化方法（如串联亲和纯化，TAP），每一步都会导致样品损失6。大量起始材料的需求意味着必须在大型群体饲养笼中进行胚胎收集，这不仅成本高昂（若商业购买），而且在维持和清洁方面耗时耗力7,8,9。

近年来，单步亲和纯化技术的不断发展以及质谱仪灵敏度的持续提高，已使实验所需的起始材料量减少了近一个数量级。利用链霉亲和素结合肽（SBP）或绿色荧光蛋白（GFP）等标签，从不足1 g的胚胎材料出发，即可分离获得足够量的目标蛋白及其相互作用组分，从而满足质谱鉴定的要求10,11。

本方案旨在帮助研究人员克服蛋白质相互作用生化分析中所面临的认知障碍 体内为此，我们提供了一种简单且低成本的收集方法 果蝇 中等规模（0.5–1 g）胚胎，随后进行一步法全细胞蛋白提取，所得提取物适用于后续AP-MS或其他方法分析。本方法依赖于实验室可自行制备的定制1升或5升群体培养笼。此外，本文所采用的提取条件已在多项研究中得到验证，适用于培养细胞及 体内10,12,13,14,15,16,17.

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方案

1. 准备可容纳15 cm培养皿的5 L果蝇饲养笼

  1. 准备所需材料：一个带盖的5夸脱（4.7 L）容器（图1A）、尼龙网和一把剃刀片。
  2. 用剃刀片在容器底部标记一个直径12 cm的圆，并切割出一个孔（图1B）；在盖子上切割一个直径15 cm的孔（图1C）。
  3. 将尼龙网裁剪成25 cm × 25 cm的正方形。
  4. 将尼龙网覆盖在容器的上边缘，然后用盖子压紧（图1C）。确保尼龙网绷紧且盖子不倾斜。该饲养笼现已准备就绪，可用于放置果蝇（参见步骤5.3）。

2. 准备适合10 cm培养皿的1 L果蝇饲养笼

  1. 准备所需材料：电钻、3 英寸（76 mm）切割工具（图 1E 和 图 1F）、带盖的直壁 1 L 塑料罐、尼龙网、剃刀刀片、砂纸、护目镜和工作手套。
  2. 在塑料罐底部和盖子上钻出 3 英寸（76 mm）的孔（图 1G），钻孔时需将盖子紧密旋紧在容器上。开始打孔时，将切割工具置于圆心位置。
    注意：此步骤中需佩戴护目镜和工作手套。
  3. 使用剃刀刀片和砂纸将孔的边缘打磨光滑。
  4. 将尼龙网裁剪成 18 × 18 cm 的正方形。
  5. 将网片覆盖在罐口上缘，旋紧盖子以固定（图 1G）。确保网面绷紧且盖子无倾斜。此时笼子已准备好用于饲养果蝇（参见步骤 5.3）。

3. 苹果汁（AJ）平板的制备

  1. 在2 L的烧瓶中加入19 g琼脂和1 L的18.2 MΩ·cm水。加入一个搅拌子，短暂混合。
  2. 121°C高压灭菌30分钟。在此期间，将冷冻保存的100%苹果汁浓缩液解冻，并配制10 mL的10%（质量/体积）对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液。
  3. 灭菌结束后，将烧瓶置于磁力搅拌器上开始搅拌，加入80 mL 100%苹果汁浓缩液和10 mL 10%（质量/体积）对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液。持续搅拌，于室温下冷却。
  4. 倒入15 cm的培养皿（用于5 L饲养笼）或10 cm的培养皿（用于1 L饲养笼），使每皿中琼脂厚度约为5 mm。于室温下静置凝固后，用塑料袋封装。AJ培养基可在4 °C保存两周。
    注意：培养皿可清洗后重复使用。
  5. 制备湿酵母糊：取适量活性干酵母放入带盖的100 mL容器中（盖子便于混合），边搅拌边少量加水，直至形成浓稠且充分混匀的糊状物。4 °C保存，最长可保存2周。

4. 裂解试剂的制备

  1. 配制5倍裂解缓冲液：250 mM Tris（pH 7.5）、25% 甘油、1% 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630）、7.5 mM MgCl2、625 mM NaCl、125 mM NaF、5 mM Na3VO4。
    1. 配制200 mL：在71 mL水中持续搅拌，完全溶解1 g NaF粉末和184 mg Na3VO4粉末。加入50 mL 1 M Tris（pH 7.5）、2 mL 100% IGEPAL、1.5 mL 1 M MgCl2和25 mL 5 M NaCl。然后加入50 mL甘油（最后加入），继续搅拌1小时。
    2. 使用250 mL滤器进行过滤除菌。此步骤可能较慢，但过滤对去除不溶性颗粒至关重要。将溶液分装至50 mL离心管中，每管10 mL，于-80 °C保存。
  2. 用水配制1 M 二硫苏糖醇（DTT）溶液。以1 mL分装量于-20 °C保存。
  3. 获取含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑制剂混合片剂。于4 °C保存。
  4. 准备10 mL注射器和针头滤器：直径26 mm，无表面活性剂醋酸纤维素（SFCA）膜，孔径0.45 µm。

5. 果蝇胚胎的收集

  1. 扩增携带目的标签蛋白的转基因果蝇品系至培养瓶中（每瓶约100只果蝇），每2天换瓶一次，直至每个果蝇品系积累25–30瓶。同时扩增对照品系例如 的 y w 以类似方式（line）。
  2. 将 AJ 平板置于室温下预热（约 1–2 小时，也可过夜）。用戴手套的手指将适量湿酵母糊涂抹在 AJ 平板中央，15 cm 平板涂抹成直径约 6 cm 的圆形区域，10 cm 平板涂抹成直径约 4 cm 的圆形区域。
  3. 使用标准的二氧化碳气流麻醉果蝇 黑腹果蝇 舞台设置，并转移至笼中（每5升笼子约15瓶生长良好的果蝇，每1升笼子5瓶）。
    1. 用5.2步骤中准备好的AJ平板覆盖笼子底部，并用两条胶带将AJ平板固定在笼子上图1D 和 1H将粘附在培养皿上的胶带末端折回，便于更换培养皿时轻松剥离。
    2. 果蝇从麻醉中恢复后，将培养笼保持为平板在底部、网筛在上方的朝向。
      注意：必须等待果蝇完全恢复，否则它们会粘附在AJ培养板和酵母糊上。
    3. 实验结束后，为准备清洗笼子，将笼子放入冰箱冷冻数小时。将网筛浸泡在水中数小时有助于清洁。
  4. 将装有果蝇的笼子在室温下孵育2-3天，每天更换AJ培养基平板两次。更换平板时，将笼子倒置，揭开平板上的胶带，但用手将平板按住贴紧笼子，轻轻敲击整个笼子于实验台面，迅速用新平板替换旧平板，注意避免果蝇逃逸。
    注意：果蝇需要适应笼子环境，通常从第3天开始产卵量达到最佳。产卵高峰期可持续约4-5天。两个5 L的笼子在产卵高峰期过夜收集可获得多达1 g的胚胎。小规模实验可使用1 L的笼子。
  5. 让果蝇在新鲜的AJ平板上产卵过夜（约16小时），或根据需要设定其他时长。
  6. 次日早晨，为用于收集胚胎的每个果蝇品系分别标记并称重网状容器。
  7. 在50 mL离心管中，将40 mL水加入10 mL 5x浓缩裂解缓冲液（储存于-80 °C）中，配制成1x裂解缓冲液（注意：现用现配，必须在提取前配制）。
    1. 加入50 µL的1 M DTT至终浓度为1 mM，充分混匀后分装至两个50 mL离心管中，每管25 mL。向其中一管加入一片蛋白酶抑制剂片剂，在4 °C下旋转孵育30分钟。在片剂溶解期间，收集并去壳胚胎（步骤5.8至6.6）。检查确认片剂已完全溶解，并将缓冲液置于冰上保存。
      注意：含有DTT的1×缓冲液的第二管可保存于-80 °C，下次实验前只需加入药片即可。考虑到蛋白质纯化步骤中的后续洗涤，25 mL裂解缓冲液足以用于最多2个样品。
  8. 在笼子上的AJ培养板上标记所用果蝇品系的基因型，并更换为新的培养板。
    注意：此步骤可刮去平板上多余的酵母糊。胚胎可在25 °C或室温下于平板上继续培养，以获得所需发育时间窗口。
  9. 加入足量的水以浸没每块AJ培养板。用软毛画笔（平头，宽度约10 mm，适用于大培养板）轻轻刷下培养板上的胚胎。将胚胎倒入预先称重并标记好的网状容器中，沥去多余的水分。
    1. 如有需要，对培养板进行第二次冲洗和刷洗，以去除所有胚胎。将同一批果蝇品系的其他培养板中的胚胎合并至同一个滤网容器中。
  10. 用纸巾轻轻按压网膜以去除多余水分。

6. 胚胎去壳

  1. 用50%的次氯酸钠溶液（体积比，溶于水）填充6 cm的培养皿至一半。
    注意：有关次氯酸钠品牌的注意事项，请参见材料与试剂表。
    注意：佩戴手套，避免次氯酸钠接触衣物。
  2. 准备两个较大的培养皿，盛装去离子水。
  3. 将装有胚胎的筛网容器浸入50%次氯酸钠溶液中90秒。孵育期间轻轻敲击筛网数次，使胚胎在次氯酸钠溶液中充分悬浮。
  4. 90秒孵育结束后，将筛网容器依次在两个盛水的培养皿中各清洗约10秒。
  5. 使用洗瓶以18.2 MΩ·cm的超纯水彻底冲洗筛网容器。同时冲洗筛网容器的侧面和外壁。
    注意：彻底清洗后不应再有次氯酸钠气味。
  6. 用纸巾吸干筛网容器表面水分。称量带有胚胎的筛网容器重量，并减去步骤5.6中测得的空容器重量。记录所得胚胎重量。理想的胚胎用量为0.5 - 1 g。

7. 胚胎提取物的制备

  1. 向Dounce玻璃匀浆器中加入1 mL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（来自步骤5.7），并将匀浆器置于冰上。将筛网容器中的胚胎转移至匀浆器中。
    注意：可用金属刮勺的平头端或刷子拾取胚胎，并直接转移至缓冲液中。本步骤中的所有操作均需在冰上进行。
  2. 用额外的1 mL裂解缓冲液冲洗筛网上残留的胚胎，并将冲洗液加入匀浆器中的样品中。让胚胎沉降至匀浆器底部，然后小心吸除上清液。
  3. 向匀浆器中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（来自步骤5.7），使裂解缓冲液的体积达到每克胚胎5–6 mL。
  4. 使用松配合的研杵进行4–6次研磨，以匀浆胚胎。
    注意：在最初的几次研磨中阻力较大。应尽量保持研杵连续运动，避免溶液飞溅。
  5. 使用紧配合的研杵进行8–10次研磨，进一步匀浆胚胎。
  6. 将匀浆液置于冰上孵育20分钟。
  7. 将匀浆液转移至微量离心管中，在4 °C、最大转速（约13,000 × g）下离心15分钟。
  8. 避免触及沉淀及最上层的脂质层，将上清液转移至新的微量离心管中，在4 °C、最大转速（约13,000 × g）下再次离心15分钟。
  9. 用1 mL吸头小心吸取上清液，加载至预冷的、装有0.45 µm滤器的10 mL注射器中（将同一样品的分装液合并至同一注射器）。将全部溶液推入冰上预冷的、已标记的15 mL离心管中。提取物可立即用于后续蛋白质纯化实验，或在液氮中速冻后于-80 °C保存以备后续使用。
    注意：相比冷冻胚胎，更推荐冷冻提取物，因为在胚胎后续解冻过程中蛋白酶可能被激活，导致蛋白质降解。

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结果

为了说明本方案在蛋白质复合物纯化实验中的应用，我们构建了一个纯合可存活的果蝇品系， arm-EGFP-ERK，表达EGFP标签的 果蝇 细胞外信号调节激酶（ERK，由 卷曲的 基因）在普遍表达启动子的调控下 穿山甲 (上肢) 启动子18,19。该 臂 启动子在大多数阶段均具有活性 果蝇 胚胎发生19. 采用所述方案制备裂解液，并检测蛋白的表达情况 arm-EGFP-ERK 通过针对总ERK蛋白的Western印迹检测确认了转基因表达，可同时检测内源性ERK和转基因EGFP-ERK的水平，其迁移位置分别为42 kDa和69 kDa（图 2A）。检测到一条对应于无标签内源性ERK（42 kDa）的单一条带

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讨论

本文介绍的方案是一种用于建立中等规模 Drosophila 种群培养笼并从胚胎中制备全细胞蛋白提取物的简单且通用的方法。所获得的提取物可用于多种后续实验，例如在亲和树脂上纯化蛋白复合物。为最大限度减少蛋白质降解，提取步骤必须在冰上操作，并使用强效的蛋白酶抑制剂。如文中所述，该方案适用于分离大多数细胞质蛋白以及部分膜结合蛋白和可溶性核蛋白6,10,12,15。该方法也可轻松调整，用于更特异性地纯化其他亚细胞组分中的蛋白质，例如通过高盐提取法分离溶解度较低的核蛋白5。如步骤5.8所述，可通过精确设定收集时间和胚胎发育时间，以获得不同发育阶段的样本。

通常需要确认目标标记蛋白的表达水平与内源性表达水平相近，这一点我们已通过使用抗总ERK抗体证明

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Veraksa 实验室成员对本文手稿提出的有益评论以及对实验方案改进的建议。A.V. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 GM105813 和 NS096402 的资助。L.Y. 获得了马萨诸塞大学波士顿分校赛诺菲健赞博士奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leaktite 5夸脱天然多用途混合容器（3件装）家得宝209330用于制作5升笼子。
Leaktite 5夸脱天然多用混合盖（3个装）家得宝209320直径8.37英寸，适用于5升笼具的盖子
Fisherbrand 透明盖培养皿，100 × 15 mmFisher ScientificFB0875712材料：聚苯乙烯。与1升笼子配合使用。
Fisherbrand 透明盖培养皿，150 × 15 mmFisher ScientificFB0875714材料：聚苯乙烯。与5升笼子配合使用。
Fisherbrand 透明盖培养皿，60 × 15 mmFisher ScientificFB0875713A材料：聚苯乙烯。用于胚胎去壳过程。
Sefar NITEX 尼龙网眼织物Sefar03-180/44180 微米，44% 开放面积，用于果蝇饲养笼。
Milwaukee 3 英寸 Hole Dozer 孔锯（带刀柄）家得宝49-56-9670用于制作1升培养笼的3英寸切割工具。
Nalgene 宽口直边 PMP 瓶，带白色聚丙烯螺旋盖Fisher Scientific11-823-33用于制作1-L笼子。Thermo Scientific 货号 # 21171000。可使用其他1-L容器替代。
红星牌活性干酵母，2磅装 pouch红星 可从 Amazon.com 或其他供应商处购买。
冷冻100%苹果汁浓缩液 可从杂货店购买。必须说明 "100% 苹果汁" 在罐子上。
对羟基苯甲酸甲酯Acros OrganicsAC126965000又称对羟基苯甲酸甲酯或Tegosept，用于AJ培养基中作为防腐剂。
分子生物学用 IGEPAL CA-630，100 mlSigmaI8896用于配制裂解缓冲液。
带CN膜的Nalgene快速流速无菌一次性滤器单元 Fisher Scientific09-740-2A0.2 μm孔径。用于过滤5倍裂解缓冲液。Thermo Scientific 货号 # 1260020。
CO-RO ROCHE cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物Sigma1169749800120片装小瓶。用于裂解缓冲液中蛋白酶抑制。
Corning SFCA 注射器滤器 Fisher Scientific09-754-21SFCA 膜，直径 26 mm，孔径 0.45 μm. 用于过滤最终提取物样品。
BD 无针鲁尔锁一次性注射器Fisher Scientific14-823-2A用于过滤最终提取样品。BD 货号 # 309604。
漂白剂Clorox用于胚胎去壳，按50%（体积/体积）比例溶于水，可在任意超市购买。必须使用Clorox品牌，因为其他品牌可能导致去壳不完全或对胚胎产生毒性。
康宁Costar网状培养板Fisher Scientific07-200-213用于胚胎收集的网状容器。74 μm 孔径，6 孔板
Wheaton Dounce 组织研磨器，容量 15 mlFisher Scientific06-435B用于胚胎的匀浆器，配松紧两种研杵。Wheaton 货号 # 357544。

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