从白蛉提取内分泌物的方法 Bemisia tabaci

摘要

在这里，我们提出了通过解剖和过滤从粉虱烟粉虱中分离内分泌物的方案。扩增后，DNA样品适用于后续测序和研究内共生与粉虱之间的共生关系。

摘要

细菌共生体与宿主形成亲密关系，在大多数情况下赋予宿主优势。基因组信息对于研究其宿主细菌共生体的功能和进化至关重要。由于大多数共生体不能在体外培养 ，所以分离足够量的细菌用于基因组测序的方法是非常重要的。在粉虱Bemisia tabaci中 ，已经确定了许多内生子，并且通过多种方法预测害虫的发育和繁殖是重要的。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。障碍部分来自于粉虱中的内分泌物，主要是抑制细菌，难以与宿主细胞分离。在这里我们报告一个主要通过解剖的粉虱B.烟粉虱鉴定，提取和纯化内分泌物的分步骤方案开和过滤。通过该方法制备的内含子样品虽然仍然是不同内分泌物种的混合物，但适用于随后的基因组测序和分析烟粉虱内共生菌的可能作用。这种方法也可用于从其他昆虫中分离内分泌物。

引言

与节肢动物形成密切共生关系的细菌广泛存在于节肢动物中。在几乎每个发育阶段^5中 ，内分泌已被证明影响宿主的方面，如营养代谢，繁殖，对环境胁迫^2,3,4 等的反应。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。研究细菌的潜在功能和作用时，基因组学是重中之重。一些基本信息， 即分类学状态，功能基因，代谢途径，分泌系统，可以从基因组序列推断出来，揭示了共生体在共生中的潜在作用。随着高通量测序的发展，大量的细菌基因组已被测序各种功能揭示⁶ 。

内含子在半ter子中是至关重要的，如蚜虫⁷ ，臭虫⁸ ，木虱⁹ ，褐飞虱¹⁰和蝉¹¹ 。例如，作为专性共生体的蚜虫中的Buchnera已被证明参与必需氨基酸生物合成，以及来自蚜虫基因组^12的基因。此外， Buchnera的转录调控也显示¹³ 。在木麻黄中， 卡桑奈尔被测序，并且是发现的最小的细菌基因组¹⁴ 。所有这些内含子的标志都是基于基因组序列推断的。由于这些内生子宫内膜不能在体外培养 ，因此已经采用了几种方法来分离足够的细菌uencing。在蚜虫中，通过离心和过滤提取内生子，并进行进一步的基因组和转录组学分析。在褐飞虱中，内共生连同整个昆虫基因组^10进行测序。

烟粉虱是一种含有超过35种形态不可区分物种（隐蔽物种）的物种，其中两种入侵物种已经入侵到世界各地，对农业生产造成了巨大的危害¹⁵ 。值得注意的是， 烟粉虱物种内的内生梭菌在害虫¹⁶的发育中已显示出重要性。到目前为止，在粉虱中已经鉴定出8个内含子，其中包括专性共生体， Candidatus Portiera aleyrodidarum和七个次生共生体Hamiltonella，立克次体 ， Arsenophonus ， Cardinium ，Wolbachia， Fritschea和Hemipteriphilus定义为^17,18 。

与以前描述的半扁桃不同，粉虱烟粉虱是一只极小的昆虫，长度只有1毫米。大多数内生子体被限制在细菌¹⁹ （含有共生体的特殊细胞，其进一步在烟粉虱中形成细菌）。此外，这些内生子宫内膜不能在体外培养 。从烟粉虱获得内生菌的唯一方法是将细菌分解出来。然而，解剖有困难。首先，脆弱的细菌总是与粉虱的其他组织连接，这是很难分离的。其次，粉虱的微小尺寸限制了足够细菌的分离。第三，内生菌群聚集在细菌中，使获得单一种细菌非常复杂。

这里，我们报告一个简单而便宜的方案来隔离粉虱内分泌物用于随后的宏基因组测序。通过解剖，纯化和扩增，可以获得足够的内含子DNA，并可以确认细菌种类。所描述的方案可以在其他节肢动物中类似地使用。

方案

白蛉饲养和隐蔽物种识别

1. 在27±1℃，70±10％湿度和14小时光:10小时黑暗条件的标准条件下，将棉花棉属 （Malvaceae）（马鞭草科）（cv。Zhe-Mian 1973）保存在笼中。
2. 收集单个成年粉虱，并在30μL裂解缓冲液（10mM Tris，pH 8.4,50mM KCl，0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]明胶，0.45％[vol / vol] Nonidet P 40,60g / mL蛋白酶K）。
3. 将匀浆在65℃孵育1小时，然后100℃孵育10分钟。
   注意:如有必要，可以增加65℃的孵育时间。应严格控制100℃下的孵育时间，以充分灭活蛋白酶K并避免DNA损伤。
4. 基于线粒体细胞色素氧化酶I引物，使用粉虱DNA（在1.3节获得）进行聚合酶链反应（PCR）。
   COI-F:5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
   COI-R:5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
   1. 进行PCR反应，最终体积为25μL，含有1U Taq DNA聚合酶，2.5μL10x Buffer，0.2 mM dNTP，0.2 mM各引物和2μL粉虱DNA。
   2. 使用以下PCR程序条件:初始变性95℃3分钟，然后35个循环，95℃45秒（变性），50℃45秒（退火）和72℃1分钟（延伸）35个循环;在72℃另外10分钟进一步延伸。
5. 使用推荐的方案使用DNA凝胶提取试剂盒清洗PCR扩增产物。
6. 按照制造商的说明，用DNA样品测序系统对纯化的DNA样品进行顺序。
7. 使用基本局部比对搜索工具（BLAST）分析序列，以识别粉虱的隐蔽物种，避免其他物种的污染ES。

内分泌鉴定和定位

1. 对粉虱DNA（步骤1.3获得）进行PCR，以扩增粉虱内每个内生子的特异性基因（PCR配方在1.4节中描述，PCR程序和引物列于表1 ）。
2. 根据先前发布的方案²⁰ （1％琼脂糖凝胶，Tris-乙酸盐-EDTA作为运行缓冲液，电压为5V / cm）使扩增的样品进行琼脂糖凝胶电泳，以鉴定每种细菌的特异性基因。
3. 恢复和序列每个条带以确定粉虱内的细菌种类（见第1.5-1.7节）。
4. 在粉虱上进行荧光原位杂交（FISH），以根据先前发布的方案¹⁹来识别内共生菌的位置。
   注意:如有必要，增加荧光探针的浓度。

透射电子显微镜（TEM）

1. 将含有2.5％[vol / vol]戊二醛的磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.0）中的粉虱浸泡并固定4小时。
2. 在磷酸盐缓冲液（0.1M，pH7.0）中洗涤样品三次，每次15分钟。
3. 在含有1％[wt / vol] OsO ₄的磷酸盐缓冲液（0.1M，pH7.0）中沉淀并固定样品2小时。
4. 通过一系列乙醇（30％，50％，70％，80％，90％，95％和100％），每次15分钟使样品脱水。
5. 将样品转移并浸入100％丙酮中20分钟。
6. 将样品在100％丙酮和100％Spurr树脂（1:1）的混合物中放置1小时。
7. 将样品转移到100％丙酮和100％Spurr树脂（1:3）的混合物中3小时。
8. 将样品转移并浸入100％Spurr树脂（在70℃下孵育）超过9小时。
9. 通过使用微型部分粉虱样品对我来说。
10. 通过浸渍在绝对醋酸铀酰中5-10分钟，然后浸入50％碱性柠檬酸铅另外5-10分钟，将超薄膜（在3.9节中获得）染色。
    注意:第3.1-3.10节中使用的试剂的体积取决于样品。确保样品浸入试剂中。
11. 观察透射电子显微镜（15,000X）下的样品，以确定进一步使用的细菌的定位，形状和大小（见第4.6节）。

白蛉细菌解剖和纯化

1. 在显微镜载玻片上加入100μL1x PBS溶液。从棉花叶中挑一些3或4龄的若虫，并将其浸入PBS溶液中。
2. 在立体显微镜下使用精细的昆虫针，从粉虱身上拉出细菌。
   1. 在若虫的一边轻轻切开一个洞，轻轻按一下一边让细菌出来。
3. 在0.5-10μL移液管上装入20μL微型加载器（前端切割以满足细菌大小）。将各种细菌从PBS溶液中提取到微型加载器中。
4. 洗涤细菌以通过将细菌吸移到PBS溶液中并提取细菌来消除其他粉虱组织的污染。重复三次。
5. 立即将洗涤的细菌移至含有60μL1x PBS溶液的离心管中。
6. 注射器通过5μm滤膜过滤组装的细菌（由粉虱中的细菌和细菌核的大小确定）。重复多次，彻底移动混合液通过过滤膜。
   注意:为了获得更好的扩增和测序结果，组装超过100个细菌。首先通过使用1×PBS溶液来过滤膜以减少细菌的损失结合膜。

内分泌基因组的扩增

1. 使用推荐的方案，使用DNA扩增试剂盒扩增滤液（主要含有粉虱的内共生体），并进行一些修改。
   1. 选择从血液或细胞中扩增基因组DNA的推荐方案，并制备缓冲液D2用于随后的实验。
   2. 直接向离心管中加入1.5μL滤液（见第4.6节），然后加入1.5μLBuffer D2，充分混匀。
   3. 在冰上孵育10分钟，并加入1.5μL的终止溶液。
   4. 加入15μL反应缓冲液和1μLDNA聚合酶，轻轻混匀。
   5. 将混合物在30℃下孵育16小时，然后在65℃下孵育3分钟。
2. 在扩增的滤液上直接进行PCR（如果需要，稀释扩增的样品），使用专门为bac设计的特异性引物teria来确认细菌种类（见2.1节）。
3. 根据先前发表的方法²¹ ，使用粉虱基因β-肌动蛋白和EF1引物进行PCR以确认是否存在宿主基因组的污染（PCR配方在1.4节中描述）。

Endosymbiont Metagenome测序

1. 在测序前将扩增的滤液置于分光光度计和荧光计（根据制造商的说明书），以测试样品的质量以及样品是否符合测序标准。
2. 根据制造商的说明书将其扩增至基因组测序仪。

结果

以烟草烟草复合体的中东亚洲1号（MEAM1）为例进行说明。用于饲养粉虱的棉花和几个发育阶段的粉虱显示在图1中，包括棉花植物，成年粉虱和粉虱的第1， ^第 2和^第 4龄的若虫（3龄的若虫似乎与第4龄若虫相似） ）。显然，第4龄若虫比第1龄和第2龄的若虫大（ 图1 ）。 MEAM1中Portiera和Hamiltonella的 FISH分析如图2所示 。这两个内共生体被限制在粉虱的细菌细胞中，也观察到两种细菌的​​重叠。 图3显示了传输电路白蛉的Portiera endosymbiont的tron显微镜图像，这表明Portiera可能会失去其细胞壁。

讨论

由于粉虱体内的内共生体无法在体外培养，因此解剖和组装菌细胞是获得足够内共生体遗传物质的有效途径。在解剖之前，应明确确认所涉及的粉虱和内共生体的种类。粉虱烟粉虱是一个物种复合体，拥有超过 35 个形态上无法区分的物种，不同的隐秘物种可能含有不同的内共生体。Portiera 作为专性共生体²² 均匀地被窝藏，次生共生体因物种而异，甚至粉虱个体也不同 17,21,23。此外，尽管许多内共生体已被证明被抑制在菌细胞内，但有些可能分布在粉虱的整个身体中²⁴。因此，在细菌组解剖之前，有必要通过FISH和TEM分析不同内共生体的定位。

对于细菌组解剖和任何后续作，所使用的材料必须严格无菌，以消除其他细菌的可能污染，特别是PBS溶液、过滤设备和离心管。过滤含有细菌组...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Taq DNA 聚合酶	Takara	R001A	包括 rTaq，10&次;缓冲液和 dNTP
凝胶 DNA 提取试剂盒	Qiagen	28704
DNA 样品测序系统	ABI	ABI-3730XL
切片机	Leica	EM UC7
透射电子显微镜	日立	H-7650 TEM
立体显微镜	蔡司	Stemi 2000-C
20 μL 微量进样器	Eppendorf	F2771951
过滤器支架	Millipore	SX0001300
滤膜过滤器	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA 净化试剂盒
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33216
基因组测序仪	Illumina	Hiseq 2000