从烟粉虱 Bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

摘要

本文介绍了一种通过解剖和过滤方法从烟粉虱Bemisia tabaci中分离内共生菌的实验方案。经过扩增后，所获得的DNA样本适用于后续对内共生菌与烟粉虱之间互惠关系的测序与研究。

摘要

细菌共生体与其宿主形成密切关系，在大多数情况下可为宿主带来益处。基因组信息对于研究细菌共生体在其宿主中的功能与进化至关重要。由于大多数共生体无法培养 体外，分离出足量细菌用于基因组测序的方法至关重要。在烟粉虱中 Bemisia tabaci，已鉴定出多种内共生菌，并预测其可能通过多种途径在害虫的发育和繁殖过程中发挥重要作用。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。部分障碍源于粉虱体内的内共生菌大多局限于细菌细胞中，难以与宿主细胞分离。本文报道了一种从粉虱中鉴定、提取和纯化内共生菌的逐步实验方案 B. tabaci 主要通过解剖和过滤进行。采用该方法制备的内共生体样品，尽管仍为不同内共生体物种的混合物，但适用于后续基因组测序及内共生体潜在功能的分析 B. tabaci该方法也可用于从其他昆虫中分离内共生菌。

引言

与相对宿主形成密切共生关系的细菌在节肢动物中广泛存在¹。内共生菌已被证实几乎在宿主的每一个发育阶段都会影响其营养代谢、繁殖以及对环境胁迫的响应等各个方面^2,3,4 等⁵。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。在研究细菌潜在功能和作用时，基因组学具有优先性和重要性。一些基本信息，例如分类地位、功能基因、代谢通路和分泌系统，均可从基因组序列中推断得出，从而揭示共生菌在共生关系中的潜在作用。随着高通量测序技术的发展，大量细菌基因组已被测序，并揭示了其多样的功能⁶。

内共生体在半翅目昆虫（如蚜虫）中具有至关重要的作用⁷，臭虫⁸，木虱⁹，褐飞虱¹⁰ 和蝉¹¹例如， 布赫纳菌 在蚜虫中，作为专性共生菌，已证明其参与必需氨基酸的生物合成，且与蚜虫基因组中的基因共同发挥作用¹²此外，转录调控的 Buchnera 也得以揭示¹³在木虱中 Carsonella 测序并鉴定出迄今发现的最小细菌基因组¹⁴所有这些内共生体的特征均基于基因组序列分析得出。由于这些内共生体无法进行培养 体外在蚜虫中，已采用多种方法分离出适合测序的足量细菌。内共生菌通过离心和过滤提取，并进一步进行基因组学和转录组学分析⁵在褐飞虱中，内共生菌与整个昆虫基因组一同进行测序¹⁰.

烟粉虱 B. tabaci 是一个包含35种以上形态难以区分的物种（隐存种）的复合种，其中已有两种入侵性物种在全球范围内扩散，对农业生产造成了巨大危害¹⁵。值得注意的是，B. tabaci 物种体内的内共生菌在害虫的发育过程中显示出重要作用¹⁶。迄今为止，已在烟粉虱中鉴定出八种内共生菌，包括一种专性共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum，以及七种次级共生菌Hamiltonella、Rickettsia、Arsenophonus、Cardinium、Wolbachia、Fritschea 和 Hemipteriphilus^17,18。

与之前描述的半翅目昆虫不同，粉虱 B. tabaci 是一种体长仅1毫米的极小型昆虫。大多数内共生菌局限于细菌细胞内¹⁹ （含有共生体的特化细胞，这些细胞进一步形成菌体） B. tabaci。此外，这些内共生菌无法进行培养 体外获得内共生体的唯一方法是从 B. tabaci 解剖出共生菌体是目标。然而，解剖过程存在困难。首先，脆弱的共生菌体总是与烟粉虱的其他组织相连，难以分离。其次，烟粉虱体型微小，限制了足量共生菌体的分离。第三，内共生菌在共生菌体内成簇分布，使得获取单一细菌物种极为复杂。

本文报道了一种简单且低成本的方案，用于分离烟粉虱的内共生菌，以进行后续的宏基因组测序。通过解剖、纯化和扩增，可获得足够的内共生菌DNA，并确认细菌种类。所述方案也可类似地应用于其他节肢动物。

方案

1. 烟粉虱的饲养与隐存种鉴定

1. 在标准条件下，将烟粉虱物种饲养于棉属植物 Gossypium hirsutum（锦葵科）（品种 Zhe-Mian 1973）上，饲养环境为人工气候箱，温度为 27 ± 1 °C，相对湿度为 70 ± 10%，光照周期为 14 小时光照：10 小时黑暗。
2. 取单只成虫烟粉虱，加入 30 µL 裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 8.4，50 mM KCl，0.45% [wt/vol] Tween-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] Nonidet P 40，60 g/mL 蛋白酶 K）进行匀浆处理。
3. 将匀浆液于 65 °C 孵育 1 小时，随后在 100 °C 孵育 10 分钟。
   注意：如有需要，可适当延长 65 °C 的孵育时间。100 °C 的孵育时间需严格控制，以充分灭活蛋白酶 K 并避免 DNA 损伤。
4. 使用烟粉虱 DNA（来自步骤 1.3）进行聚合酶链式反应（PCR），引物基于线粒体细胞色素氧化酶 I 基因（COI）设计。
   COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
   COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
   1. PCR 反应总体积为 25 µL，包含 1 U Taq DNA 聚合酶、2.5 µL 10× Buffer、0.2 mM dNTP、每种引物各 0.2 mM 以及 2 µL 烟粉虱 DNA。
   2. PCR 程序如下：95 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 45 秒、50 °C 退火 45 秒、72 °C 延伸 1 分钟；最后在 72 °C 继续延伸 10 分钟。
5. 使用 DNA 凝胶回收试剂盒，按照推荐的操作流程对 PCR 扩增产物进行纯化。
6. 按照制造商说明书，使用 DNA 测序系统对纯化后的 DNA 样本进行测序。
7. 利用基本局部比对搜索工具（BLAST）分析测序结果，以鉴定烟粉虱的隐存种，并排除其他物种的污染。

2. 内共生体的鉴定与定位

1. 对烟粉虱DNA（步骤1.3中获得）进行PCR扩增，以扩增烟粉虱体内每种内共生菌的特异性基因（PCR反应体系见第1.4节，PCR程序及引物列于 表1).
2. 将扩增后的样品按照先前发表的方案进行琼脂糖凝胶电泳²⁰ （1% 琼脂糖凝胶，以 Tris-乙酸盐-EDTA 作为电泳缓冲液，电压 5 V/cm）以鉴定每种细菌的特异性基因。
3. 回收并测序每条条带，以确定烟粉虱体内的细菌种类（参见第1.5-1.7节）。
4. 进行荧光检测 原位 根据已发表的方案，对粉虱进行荧光原位杂交（FISH）以确定内共生菌的位置¹⁹.
   注意：如有必要，可增加荧光探针的浓度。

3. 透射电子显微镜（TEM）

1. 将粉虱浸入含有2.5%（体积比）戊二醛的磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.0）中，固定4小时。
2. 用磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.0）洗涤样品三次，每次15分钟。
3. 再次将样品浸入含有1%（重量比）OsO₄的磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.0）中，固定2小时。
4. 通过梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95% 和 100%）进行脱水，每次15分钟。
5. 将样品转移并浸入100%丙酮中20分钟。
6. 将样品置于100%丙酮与100% Spurr树脂（1:1）的混合液中，室温下处理1小时。
7. 将样品转移至100%丙酮与100% Spurr树脂（1:3）的混合液中，室温下处理3小时。
8. 将样品转移并浸入100% Spurr树脂中（在70 °C下孵育）超过9小时。
9. 使用切片机对粉虱样品进行切片。
10. 将超薄切片（第3.9步中获得）浸入醋酸铀酰溶液中染色5-10分钟，随后再浸入50%碱性柠檬酸铅溶液中染色5-10分钟。
    注：第3.1–3.10步中所用试剂的体积取决于样品量。确保样品完全浸没在试剂中。
11. 在透射电子显微镜（15,000X）下观察样品，以确定细菌的定位、形态和大小，供后续使用（见第4.6节）。

4. 粉虱共生体组织的解剖与纯化

1. 在载玻片上加入 100 µL 的 1x PBS 溶液。从棉叶上挑选一些 3^rd 或 4^th 龄若虫，浸入 PBS 溶液中。
2. 在体视显微镜下使用精细的昆虫学针，将共生菌体从烟粉虱体内拉出。
   1. 在若虫一侧轻轻切开一个小孔，轻压另一侧，使共生菌体排出。
3. 将 20 µL 微量移液吸头（前端剪裁至与共生菌体大小匹配）安装到 0.5–10 µL 移液器上。将单个共生菌体从 PBS 溶液中吸入微量移液吸头内。
4. 通过将共生菌体反复吹入 PBS 溶液并重新吸出，清洗共生菌体，以去除其他烟粉虱组织的污染。重复三次。
5. 立即将清洗后的共生菌体移入含有 60 µL 1x PBS 溶液的离心管中。
6. 使用注射器将收集的共生菌体通过 5 µm 滤膜过滤（滤膜孔径根据烟粉虱共生细胞中细菌和细胞核的大小确定）。重复多次，确保混合液充分通过滤膜。
   注意：为获得更佳的扩增和测序结果，应收集超过 100 个共生菌体。为减少细菌在膜上的黏附损失，过滤前应先用 1x PBS 溶液润湿滤膜。

5. 内共生体基因组的扩增

1. 使用DNA扩增试剂盒，按照推荐方案并稍作修改，对滤液（主要含有烟粉虱的内共生菌）进行扩增。
   1. 选择从血液或细胞中扩增基因组DNA的推荐方案，并配制缓冲液D2用于后续实验。
   2. 直接将1.5 µL滤液（见第4.6节）加入离心管中，随后加入1.5 µL缓冲液D2，并充分混匀。
   3. 冰上孵育10分钟，然后加入1.5 µL终止液。
   4. 加入15 µL反应缓冲液和1 µL DNA聚合酶，轻轻混匀。
   5. 将混合物在30 °C孵育16小时，随后在65 °C孵育3分钟。
2. 使用针对细菌设计的特异性引物，直接对扩增后的滤液进行PCR（如有必要可稀释扩增产物），以确认细菌种类（见第2.1节）。
3. 根据已发表的方法²¹，使用烟粉虱基因beta-Actin和EF1引物进行PCR，以检测是否存在宿主基因组污染（PCR配方见第1.4节）。

6. 内共生菌宏基因组测序

1. 在测序前，按照制造商说明书，将扩增后的滤液进行分光光度计和荧光计检测，以评估样品质量及是否符合测序标准。
2. 按照制造商说明书，将扩增产物送入基因组测序仪进行测序。

结果

中东-小亚细亚1型（MEAM1）物种的 B. tabaci 此处以复合体为例进行描述。图中展示了用于饲养烟粉虱的棉花以及烟粉虱的多个发育阶段。 图1 包括一株棉花植株、成年烟粉虱和1^st, 2^nd 和 4^th 粉虱的3龄若虫^rd 4龄若虫的形态与之相似^th 龄若虫）。显然，4^th 龄若虫比1龄若虫大^st 和 2^nd 龄期若虫（图1）。FISH 分析 Portiera 和 Hamiltonella 在MEAM1中的情况如图所示 图2这两种内共生菌局限于粉虱的含菌细胞中，且可观察到两种细菌存在重叠分布的现象。 图3...

讨论

由于烟粉虱体内的内共生菌无法进行体外培养 体外解剖并分离含菌细胞是获取足量内共生菌遗传物质的有效方法。在解剖前，应明确确认所涉及的粉虱种类及其内共生菌种类。粉虱 B. tabaci 是一个包含35种以上形态无法区分的物种的复合种，不同的隐存种可能含有不同的内共生菌。 Portiera 作为专性共生体均匀地寄居²²，且次级共生菌在不同物种间存在差异，甚至在个体粉虱中也各不相同^17,21,23此外，尽管许多内共生菌已被证实局限于细菌细胞内，但有些内共生菌可能分布于粉虱全身²⁴因此，在解剖菌体之前，通过FISH和TEM分析不同内共生菌的定位是必要的。

进行细菌组解剖及后续任何操作时，所用材料必须严格无菌，以避免其他细菌可能造成的污染，尤其是 PBS 溶液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Taq DNA 聚合酶	Takara	R001A	包含 rTaq、10×Buffer 和 dNTP
凝胶 DNA 回收试剂盒	Qiagen	28704
DNA 样本测序系统	ABI	ABI-3730XL
切片机	Leica	EM UC7
透射电子显微镜	Hitachi	H-7650 TEM
体视显微镜	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL 微量移液器吸头	Eppendorf	F2771951
滤器支架	Millipore	SX0001300
滤膜过滤器	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini 试剂盒	Qiagen	150033	DNA 扩增试剂盒
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33216
基因组测序仪	Illumina	Hiseq 2000