从烟粉虱 Bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

摘要

本文介绍了一种通过解剖和过滤方法从烟粉虱Bemisia tabaci中分离内共生菌的实验方案。经过扩增后，所获得的DNA样本适用于后续对内共生菌与烟粉虱之间互惠关系的测序与研究。

摘要

细菌共生体与其宿主形成密切关系，在大多数情况下可为宿主带来益处。基因组信息对于研究细菌共生体在其宿主中的功能与进化至关重要。由于大多数共生体无法培养 体外，分离出足量细菌用于基因组测序的方法至关重要。在烟粉虱中 Bemisia tabaci，已通过多种方法鉴定出多种内共生菌，并预测其在害虫的发育和繁殖过程中具有重要作用。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。这一研究障碍部分源于粉虱体内的内共生菌大多局限于菌胞内，难以与宿主细胞分离。本文报道了一种从粉虱中鉴定、提取和纯化内共生菌的逐步实验方案 B. tabaci 主要通过解剖和过滤进行。采用该方法制备的内共生体样品，尽管仍为不同内共生体物种的混合物，但适用于后续基因组测序及内共生体可能功能的分析 B. tabaci该方法也可用于从其他昆虫中分离内共生菌。

引言

与相对宿主形成密切共生关系的细菌在节肢动物中广泛存在¹。内共生菌已被证实几乎在宿主的每一个发育阶段都会影响其营养代谢、繁殖以及对环境胁迫的响应等各个方面^2,3,4 等⁵。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。在研究细菌潜在功能和作用时，基因组学具有优先性和重要性。一些基本信息，例如分类地位、功能基因、代谢通路和分泌系统，均可从基因组序列中推断得出，从而揭示共生菌在共生关系中的潜在作用。随着高通量测序技术的发展，大量细菌基因组已被测序，并揭示了其多样的功能⁶。

内共生体在半翅目昆虫（如蚜虫）中具有至关重要的作用⁷，臭虫⁸，木虱⁹，褐飞虱¹⁰ 和蝉¹¹例如， Buchnera 在蚜虫中，作为专性共生菌，已证明其参与必需氨基酸的生物合成，且与蚜虫基因组中的....

方案

1. 烟粉虱的饲养与隐存种鉴定

1. 在标准条件下，将烟粉虱物种饲养于棉属植物 Gossypium hirsutum（锦葵科）（品种 Zhe-Mian 1973）上，饲养环境为网笼，温度 27 ± 1 °C，相对湿度 70 ± 10%，光周期为 14 小时光照 : 10 小时黑暗。
2. 取单只成虫烟粉虱，加入 30 µL 裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 8.4，50 mM KCl，0.45% [wt/vol] Tween-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] Nonidet P 40，60 g/mL 蛋白酶 K）进行匀浆处理。
3. 将匀浆液于 65 °C 孵育 1 小时，随后于 100 °C 孵育 10 分钟。
   注意：如有需要，可适当延长 65 °C 的孵育时间。100 °C 的孵育时间需严格控制，以充分灭活蛋白酶 K 并避免 DNA 损伤。
4. 使用烟粉虱 DNA（来自步骤 1.3）进行聚合酶链式反应（PCR），引物基于线粒体细胞色素氧化酶 I 基因设计。
   COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
   COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
   1. PCR 反应在总体积 25 µL 体系中进行，包含 1 U Taq DNA 聚合酶....

结果

中东-西亚1型（MEAM1）烟粉虱物种 B. tabaci 此处以复合体为例进行描述。图中显示了用于饲养粉虱的棉花以及粉虱的多个发育阶段。 图1 包括一株棉花植株、成虫白粉虱和第1个^st, 2^nd 和 4^th 粉虱的3龄若虫^rd 4龄若虫的形态与之相似^th 龄若虫）。显然，4^th 龄若虫比1龄若虫大^st 和 2^nd 龄若虫（图1). FISH 分析 Portiera 和 Hamiltonella 在MEAM1中显示 图2这两种内共生菌局限于粉虱的含菌细胞中，且可观察到两种细菌存在重叠分布的现象。 图3 显示透射.......

讨论

由于烟粉虱体内的内共生菌无法进行培养 体外解剖并分离含菌细胞是获取足量内共生菌遗传物质的有效方法。在解剖前，应明确确认所涉及的粉虱种类及其内共生菌种类。粉虱 B. tabaci 是一个包含35种以上形态难以区分物种的复合种，不同的隐存种可能含有不同的内共生菌。 Portiera 以专性共生体的形式普遍存在²²，且次级共生菌在不同物种间存在差异，甚至在单个烟粉虱个体中也有所不同^17,21,23此外，尽管许多内共生菌已被证实局限于细菌细胞内，但有些内共生菌可能分布于烟粉虱整个体内²⁴因此，在解剖菌体之前，有必要通过FISH和TEM分析不同内共生菌的定位。

进行菌体解剖及后续任何操作时，所用材料必须严格无菌，以避免其他细菌可能造成的污染，尤其是PBS溶液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Taq DNA 聚合酶	Takara	R001A	包含 rTaq、10×Buffer 和 dNTP
凝胶 DNA 回收试剂盒	Qiagen	28704
DNA 样本测序系统	ABI	ABI-3730XL
切片机	Leica	EM UC7
透射电子显微镜	Hitachi	H-7650 TEM
体视显微镜	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL 微量加样吸头	Eppendorf	F2771951
滤器 holder	Millipore	SX0001300
滤膜过滤器	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini 试剂盒	Qiagen	150033	DNA 扩增试剂盒
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33216
基因组测序仪	Illumina	Hiseq 2000