方法文章

从白蛉提取内分泌物的方法 Bemisia tabaci

DOI：

10.3791/55809

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2017年6月19日

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1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

本文内容

摘要

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在这里，我们提出了通过解剖和过滤从粉虱烟粉虱中分离内分泌物的方案。扩增后，DNA样品适用于后续测序和研究内共生与粉虱之间的共生关系。

摘要

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细菌共生体与宿主形成亲密关系，在大多数情况下赋予宿主优势。基因组信息对于研究其宿主细菌共生体的功能和进化至关重要。由于大多数共生体不能在体外培养 ，所以分离足够量的细菌用于基因组测序的方法是非常重要的。在粉虱Bemisia tabaci中 ，已经确定了许多内生子，并且通过多种方法预测害虫的发育和繁殖是重要的。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。障碍部分来自于粉虱中的内分泌物，主要是抑制细菌，难以与宿主细胞分离。在这里我们报告一个主要通过解剖的粉虱B.烟粉虱鉴定，提取和纯化内分泌物的分步骤方案开和过滤。通过该方法制备的内含子样品虽然仍然是不同内分泌物种的混合物，但适用于随后的基因组测序和分析烟粉虱内共生菌的可能作用。这种方法也可用于从其他昆虫中分离内分泌物。

引言

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与节肢动物形成密切共生关系的细菌广泛存在于节肢动物中。在几乎每个发育阶段5中 ，内分泌已被证明影响宿主的方面，如营养代谢，繁殖，对环境胁迫2,3,4 等的反应。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。研究细菌的潜在功能和作用时，基因组学是重中之重。一些基本信息， 即分类学状态，功能基因，代谢途径，分泌系统，可以从基因组序列推断出来，揭示了共生体在共生中的潜在作用。随着高通量测序的发展，大量的细菌基因组已被测序各种功能揭示6 。

内含子在半ter子中是至关重要的，如蚜虫7 ，臭虫8 ，木虱9 ，褐飞虱10和蝉11 。例如，作为专性共生体的蚜虫中的Buchnera已被证明参与必需氨基酸生物合成，以及来自蚜虫基因组12的基因。此外， Buchnera的转录调控也显示13 。在木麻黄中， 卡桑奈尔被测序....

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方案

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白蛉饲养和隐蔽物种识别

  1. 在27±1℃，70±10％湿度和14小时光:10小时黑暗条件的标准条件下，将棉花棉属 （Malvaceae）（马鞭草科）（cv。Zhe-Mian 1973）保存在笼中。
  2. 收集单个成年粉虱，并在30μL裂解缓冲液（10mM Tris，pH 8.4,50mM KCl，0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]明胶，0.45％[vol / vol] Nonidet P 40,60g / mL蛋白酶K）。
  3. 将匀浆在65℃孵育1小时，然后100℃孵育10分钟。
    注意:如有必要，可以增加65℃的孵育时间。应严格控制100℃下的孵育时间，以充分灭活蛋白酶K并避免DNA损伤。
  4. 基于线粒体细胞色素氧化酶I引物，使用粉虱DNA（在1.3节获得）进行聚合酶链反应（PCR）。
    COI-F:5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
    COI-R:5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
    1. 进行PCR反应，最终体积为25μL，含有1U Taq DNA聚合酶，2.5μL10x Buffer，0.2 mM dNTP，0.2 mM各引物和2μL粉虱DNA。
    2. 使用以下PCR程序条件:初始变性95℃3分钟，然后35个循环，95℃....

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结果

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以烟草烟草复合体的中东亚洲1号（MEAM1）为例进行说明。用于饲养粉虱的棉花和几个发育阶段的粉虱显示在图1中，包括棉花植物，成年粉虱和粉虱的第1， 第 2和第 4龄的若虫（3龄的若虫似乎与第4龄若虫相似） ）。显然，第4龄若虫比第1龄和第2龄的若虫大（ 图1 ）。 MEAM1中Portiera和Hamiltonella的 FISH分析如图2所示 。这两个内共生体被限制在粉虱的细菌细胞中，也观察到两种细菌的​​重叠。 图3显示了传输电路白蛉的Portiera endosymbiont的tron显微镜图像，这表明Portiera可能会失去其细胞壁。

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讨论

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由于粉虱体内的内共生体无法在体外培养，因此解剖和组装菌细胞是获得足够内共生体遗传物质的有效途径。在解剖之前，应明确确认所涉及的粉虱和内共生体的种类。粉虱烟粉虱是一个物种复合体，拥有超过 35 个形态上无法区分的物种，不同的隐秘物种可能含有不同的内共生体。Portiera 作为专性共生体22 均匀地被窝藏，次生共生体因物种而异，甚至粉虱个体也不同 17,21,23。此外，尽管许多内共生体已被证明被抑制在菌细胞内，但有些可能分布在粉虱的整个身体中24。因此，在细菌组解剖之前，有必要通过FISH和TEM分析不同内共生体的定位。

对于细菌组解剖和任何后续作，所使用的材料必须严格无菌，以消除其他细菌的可能污染，特别是PBS溶液、过滤设备和离心管。过滤含有细菌组.......

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披露

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作者没有什么可以披露的。

致谢

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本研究的财政支持由国家重点研究发展计划（2016YFC1200601）和国家自然科学基金（31390421）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Taq DNA 聚合酶TakaraR001A包括 rTaq，10&次;缓冲液和 dNTP
凝胶 DNA 提取试剂盒Qiagen28704
DNA 样品测序系统ABIABI-3730XL
切片机LeicaEM UC7
透射电子显微镜日立H-7650 TEM
立体显微镜蔡司Stemi 2000-C
20 μL 微量进样器EppendorfF2771951
过滤器支架MilliporeSX0001300
滤膜过滤器MilliporeSMWP0013005.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini KitQiagen150033DNA 净化试剂盒
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000
Qubit 荧光计Thermo Fisher ScientificQ33216
基因组测序仪IlluminaHiseq 2000

参考文献

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  1. Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
  2. Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
  3. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D.

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标签

DNA PCR FISH

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