方法文章

可切换的声学与光学分辨率光声显微镜 在体 内 小动物血液血管成像

DOI：

10.3791/55810

⸱

2017年6月26日

 ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种可切换的声学分辨率（AR）与光学分辨率（OR）光声显微成像系统（AR-OR-PAM），能够在同一样品上实现浅层组织的高分辨率成像和深层组织的低分辨率成像 体内 被展示。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光声显微成像（PAM）是一种快速发展的 体内 一种结合光学与超声的成像模态，能够在超越光学平均自由程（皮肤中约为1毫米）的深度实现高分辨率成像。该技术通过在单一模态中融合光学吸收对比度与超声的高空间分辨率，可实现对深层组织的穿透成像。光声显微系统可分为两类：一类具有较低的声学分辨率但探测深度较深，另一类具有较高的光学分辨率但探测深度较浅。在同一系统中同时实现高空间分辨率与大深度穿透仍具挑战性。本研究展示了一种AR-OR-PAM系统，能够对同一样本实现浅层的高分辨率成像与深层组织的低分辨率成像。 体内. 利用光学聚焦实现了4 µm的横向分辨率和1.4 mm的成像深度，利用声学聚焦实现了45 µm的横向分辨率和7.8 mm的成像深度，上述结果已通过该联合系统成功验证。此处， 体内 小动物血液血管成像用于展示其生物成像能力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高分辨率光学成像技术，如光学相干断层扫描、共聚焦显微镜和多光子显微镜，具有多种优势。然而，随着成像深度的增加，空间分辨率会显著下降，这是由于光在软组织中传输具有扩散性所致。1,2光学激发与超声检测的结合为解决深层组织中高分辨率光学成像的难题提供了一种解决方案。光声显微成像（PAM）便是其中一种能够比其他光学成像方式实现更深层成像的模式。该技术已成功应用于 体内 结构、功能、分子与细胞成像3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 通过结合强光学吸收对比度与超声的高空间分辨率进行研究。

在光声成像（PAM）中，短激光脉冲照射组织/样本。生色团对光的吸收（例如， 黑色素，血红蛋白，水 等等。）会导致温度升高，进而产生以声波形式存在的压力波（光声波）。生成的光声波可通过置于组织边界外的宽带超声换能器进行检测。通过结合弱光学聚焦与强声学聚焦，可在声学分辨率光声显微镜（AR-PAM）中实现深层组织成像。14,15,16在AR-PAM中，已实现45 µm的横向分辨率和高达3 mm的成像深度15为了在声学上分辨单个毛细血管（约5 µm），需要使用工作频率在 >需要 400 MHz 的中心频率。在如此高的频率下，穿透深度小于 100 µm。通过使用紧密的光学聚焦，可以解决因声学聚焦过紧引起的问题。光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）能够分辨单个毛细血管，甚至单个细胞。17，已实现0.5 µm的横向分辨率18,19,20,21,22,23,24使用光子纳米射流有助于实现超越衍射极限分辨率的成像分辨率25,26在光声显微镜（OR-PAM）中，由于光聚焦的限制，成像穿透深度受限，最多可在生物组织内成像至约1.2 mm的深度。23因此，AR-PAM 能够实现更深层的成像，但分辨率较低；而 OR-PAM 可实现极高的分辨率成像，但成像深度有限。AR-PAM 与 OR-PAM 系统的成像速度主要取决于激光光源的脉冲重复频率。27.

结合声学分辨光声显微成像（AR-PAM）与光学分辨光声显微成像（OR-PAM）将极大有利于需要高分辨率和深层成像的应用。目前将这两种系统整合的研究还较少。通常，两种不同的成像扫描仪分别用于成像，这要求样品在两个系统之间移动，从而难以实现活体（in vivo）成像。然而，将AR与OR-PAM结合的混合成像技术可实现分辨率和成像深度的灵活调节。其中一种方法采用光学纤维束同时为AR和OR-PAM输送光信号。该方法使用两种独立的激光器（AR部分使用570 nm的高能量激光，OR部分使用532 nm的低能量、高重复频率激光），导致系统复杂且成本较高28。此外，OR-PAM的激光波长固定，限制了该组合系统在血氧饱和度等研究中的应用。由于AR与OR所用激光波长不同，也无法开展AR-PAM与OR-PAM之间的比较研究。此外，AR-PAM采用明场照明，皮肤表层产生的强光声信号会降低成像质量，因此该系统难以广泛应用于生物成像领域。另一种实现AR与OR-PAM的方法是移动光学和超声的聚焦位置，但这会导致光聚焦与超声聚焦不一致，从而影响成像质量29。使用该技术，AR-PAM和OR-PAM的分辨率分别仅为139 µm和21 µm，属于低分辨率系统。还有一种方法通过更换光学纤维和准直光学元件来切换AR与OR-PAM模式，但使对准过程变得困难30。在上述所有方法中，AR-PAM均未采用暗场照明。而使用暗场照明可有效减少皮肤表层产生的强光声信号，因此采用环形照明可实现更深组织的成像，因为其对深层光声信号的探测灵敏度高于明场照明。

本研究报道了一种可切换的声分辨（AR）和光分辨（OR）光声显微成像系统（AR-OR-PAM），该系统利用同一激光器和扫描器，能够对同一样本实现高分辨率成像和低分辨率深部组织成像。通过体模实验测定空间分辨率和成像深度，对AR-OR-PAM系统的性能进行了表征。体内小鼠耳部血管成像实验验证了其生物成像能力。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物护理和使用委员会批准的法规和指南进行（动物实验方案编号 ARF-SBS/NIE-A0263）。

1. AR-OR-PAM 系统（图1）

  1. 系统配置：AR-PAM
    1. 使用一个纳秒可调谐激光系统，该系统由一个二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532 nm）和一个可调谐范围为559–576 nm的染料激光器组成，作为光学照射光源。通过外部控制器将激光波长设置为570 nm，并使用激光软件将激光重复频率设置为1 kHz。
    2. 在激光器前方以45°角放置一个光束取样器，通过可变中性密度滤光片（NDF1；OD = 0–4.0）将5%的激光功率引向一个光电二极管。
    3. 使用一个直角棱镜（RAP1）将光束取样器后的激光束以90°角偏转。
    4. 使用另一个直角棱镜（RAP2）使光束穿过一个可变中性密度滤光片（NDF2；OD = 0–4.0），然后进入一个多模光纤（MMF），并通过光纤耦合器（FC）——由物镜（数值孔径（NA）：0.25）和XY平移台组合而成——进行引导。
    5. 使用XY平移台将光纤固定在扫描平台上。在光纤输出端25 mm处放置一个平凸透镜（L1），以准直从光纤出射的光束。
    6. 将准直后的光束通过一个顶角为130°的锥形透镜，生成环形光束。使用一个自制的光学聚光器（OC）——其锥角分别为70°和110°，中心带孔——将环形光束轻微聚焦到样品上。
    7. 在自制聚光器中心放置一个带声学透镜（AL）的50 MHz超声换能器（UST）。
  2. 系统配置：OR-PAM
    1. 使用一个纳秒可调谐激光系统，该系统由一个二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532 nm）和一个可调谐范围为559–576 nm的染料激光器组成，作为光学照射光源。通过外部控制器将激光波长设置为570 nm，并使用激光软件将激光重复频率设置为5 kHz。
    2. 将计算机控制的旋转平台（承载RAP1）旋转90°，以将激光束引导至一个光圈（iris）进行整形。
    3. 在光路中插入一个可变中性密度滤光片（OD：0–4.0）以衰减激光束，然后使用一个聚光透镜（CL）对光束进行聚焦。在距CL 75 mm处通过一个针孔（PH）进行空间滤波。
    4. 使用一个单模光纤耦合器（FC）——包含一个数值孔径为0.1的物镜，用于将光束聚焦到单模光纤（SMF）上——将经过空间滤波的光束耦合进单模光纤。
    5. 调节光纤耦合器以实现最大耦合效率。
    6. 使用滑动板（SP）将光纤固定在扫描平台上。在SMF光纤输出端50 mm处放置一个消色差透镜（L2），以准直激光束。
    7. 使用一个可调的运动学椭圆反射镜（M）将准直光束偏转90°，使其充满另一个相同的消色差透镜（L3）的后光阑。将用于聚焦的消色差透镜通过透镜管（LT）安装在平移装置（TM2）上。
    8. 使聚焦光束穿过一个自制的光声光束合束器，该合束器由一个直角棱镜（RA）和一个菱形棱镜（RP）组成，两者之间夹有一层硅油（SO）。
      注：硅油层将起到光学透明且声学反射的作用。
    9. 在菱形棱镜底部附着一个声学透镜（AL），以实现声学聚焦（焦斑直径：约46 µm）。
    10. 将中心频率为50 MHz的超声换能器放置在菱形棱镜顶部；使用环氧树脂层实现有效耦合。

2. 系统切换与校准

  1. 将自制的可切换平台通过旋紧螺丝固定在由连接至计算机的三轴控制器控制的三轴电动平台上。
  2. 使用笼式安装支架将AR和OR笼式系统连接到自制平台，以便在AR和OR扫描头之间轻松切换。将扫描头滑动至成像区域上方。
  3. 使用Z轴平台将AR-OR-PAM扫描头的底部浸入装满水的亚克力水箱（13 cm × 30 cm × 3 cm）中，以实现声学耦合。
  4. 在水箱底板上开设一个直径为7 cm的成像窗口，并用聚乙烯膜密封，以实现光和声的透射。
  5. 使用脉冲回波放大器和示波器对超声换能器进行聚焦对准。
    1. 将脉冲回波放大器的增益在发射/接收模式下设置为24 dB。
    2. 使用脉冲回波放大器的同步输出信号作为触发信号，通过示波器检测从玻璃片（从水箱底部插入）反射回来的背向散射信号。
      注：玻璃片应贴有黑色胶带。
    3. 调节Z轴，使脉冲回波信号的幅度达到最大（在示波器上观察）。
      注：当玻璃片处于焦点位置时，回波信号幅度最大。
  6. 打开激光器，使用BNC电缆将超声换能器（UST）连接至两个增益固定为24 dB的放大器。
    注：放大器的输出端连接至数据采集卡（DAQ）。
  7. 使用放置在激光器前方的光电二极管（PD）产生的信号作为数据采集系统的触发信号。
  8. 在AR-PAM中，调节锥形透镜（con.L）与光学聚光镜（OC）之间的距离，以最大化测试样品（贴在玻璃片上的黑色胶带）产生的光声信号幅度。通过确定最大光声（PA）信号幅度，确保光学焦点与声学焦点共焦。
    1. 记录最大PA信号的延迟时间；后续可在数据采集软件中用于检查焦点位置。
  9. 松开扫描头的固定螺丝，手动将扫描头从AR-PAM切换至OR-PAM，然后重新拧紧螺丝。
  10. 在OR-PAM中，调节镜筒（LT）内的聚焦消色差双合透镜与光声组合器之间的距离，以最大化示波器上显示的PA信号幅度。
    1. 记录最大PA信号的延迟时间。
      注：需进行精细调节以确定共焦配置。

3. 实验步骤

  1. 横向分辨率与成像深度的量化
    1. 使用直径为 100 nm 的金纳米颗粒来确定 AR 和 OR 系统的横向分辨率。
    2. 将 0.1 mL 纳米颗粒溶液与等体积的水稀释。取 0.1 mL 稀释后的溶液滴加到盖玻片上，并将其置于水箱下方的聚乙烯膜接触处。
    3. 在扫描前（步骤 2.8 和 2.10），确保 AR-PAM 和 OR-PAM 在数据采集软件（见材料表）中处于聚焦状态。
      注：通过已知步骤 2.9 和 2.10 中最大光声信号的微秒级延迟，乘以采样率（250 MS/s），可在数据采集软件中实现图像聚焦。在数据采集过程中可于软件中设定需忽略的延迟时间，以便仅保存后续处理所需的必要数据点。
    4. 设置 AR-PAM 的扫描参数，并点击 "scan" 按钮以开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中设置 AR-PAM 的扫描参数：在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "4" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "1" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "0.5" mm，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "0.5" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "4" µm。
        注：y 方向的步长由载物台的扫描速度和脉冲重复频率自动确定（本例中为 4,000 µm/1,000 Hz = 4 µm）
    5. 设置 OR-PAM 的扫描参数，并点击 "scan" 按钮以开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中设置扫描参数：在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "2.5" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "5" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "0.5" mm，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "0.5" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "0.5" µm。
        注：y 方向的步长由载物台的扫描速度和脉冲重复频率自动确定（本例中为 2,500 µm/5,000 Hz = 0.5 µm）。
    6. 确保在扫描过程中，数据持续被采集并存储在计算机中
      注：数据仅在 Y 轴载物台单向运动过程中被采集。
    7. 使用计算机中存储的多个 B 扫描数据，通过图像处理软件（见材料表）重建最大振幅投影（MAP）图像。
    8. 从扫描获得的多幅图像中选取一幅单个纳米颗粒图像，通过手动在纳米颗粒图像中心区域画一条线，获得类似高斯曲线的点扩散函数，以确定横向分辨率。见图 2。
    9. 使用图像处理软件（见材料表）对单个纳米颗粒图像获得的点扩散函数进行高斯拟合，并测量其半高全宽（FWHM），将该值作为横向分辨率。见图 2。
    10. 将一段黑色胶带斜向粘贴在切开的鸡组织上，作为深度成像的目标物。将带有胶带的组织放入水箱中。
      注：黑色胶带粘附在带有尖锐末端的金属片上，有助于将其固定在组织上。
    11. 将 AR-PAM 的扫描参数输入数据采集软件，然后点击 "scan" 按钮，采集单幅 B 扫描图像以确定最大成像深度。
      1. 在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "15" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "1" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "5" cm，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "0.1" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "0.1" mm。
    12. 设置 OR-PAM 的扫描参数，并点击 "scan" 按钮，采集单幅 B 扫描图像以确定最大成像深度。
      1. 在数据采集软件中设置扫描参数：在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "15" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "5" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "2" cm，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "0.1" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "0.1" mm。
        注：由于 X 扫描范围与 dx 相同，因此仅采集一幅 B 扫描图像。将时间分辨的光声信号乘以软组织中的声速（1,540 m/s）可得到 A 线图像。在 Y 轴载物台连续运动过程中采集多条 A 线，以生成一幅 B 扫描图像。
  2. 体内小鼠耳部血管成像
    1. 使用一只体重为 25 g、年龄为 4 周的雌性小鼠。
    2. 通过腹腔注射给予氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）混合麻醉剂进行麻醉（剂量为 0.1 mL/10 g）。
    3. 使用脱毛膏去除小鼠耳部的毛发，并擦拭清洁。用无菌眼膏覆盖小鼠眼睛，以防散射激光照射到眼部。
    4. 将小鼠固定在载物台上，载物台配备有用于固定耳朵的微型夹具。
    5. 在成像期间通过吸入异氟烷（0.75%，氧气流速 1 L/min）维持麻醉状态。
    6. 将脉搏血氧仪夹在小鼠腿部或尾部，监测其生理状态。使用超声耦合剂使成像区域与聚乙烯膜保持良好接触。
    7. 设置 AR-PAM 的扫描参数，并点击 "scan" 按钮以开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中设置 AR-PAM 的扫描参数：在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "15" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "1" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "10 mm"，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "6" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "30" µm。
        注：y 方向的步长由载物台的扫描速度和脉冲重复频率自动确定（本例中为 15,000 µm/1,000 Hz = 15 µm）。
    8. 完成 AR-PAM 扫描后，将成像探头从 AR-PAM 位置切换至 OR-PAM 位置（如第 2 节所述）。
    9. 设置 OR-PAM 的扫描参数，并点击 "scan" 按钮以开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中设置 OR-PAM 的扫描参数：在 "velocity" 选项卡中设置扫描速度为 "15" mm/s，在 "pulse repetition rate" 选项卡中设置为 "5" kHz，在 "Y-scan range" 选项卡中设置为 "10" mm，在 "X-scan range" 选项卡中设置为 "6" mm。在 "dx" 选项卡中设置 x 方向的步长为 "6" µm。
        注：y 方向的步长由载物台的扫描速度和脉冲重复频率自动确定（本例中为 15,000 µm/5,000 Hz = 2 µm）。
    10. 使用计算机中存储的多个 B 扫描数据，通过图像处理软件重建 MAP 图像。
    11. 在整个成像过程中持续观察动物状态。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AR-OR-PAM 系统的示意图如图1所示。在该装置中，所有组件均集成并组装在一个光学笼式结构中。使用笼式系统可使 AR-OR-PAM 扫描头结构紧凑，并便于组装、准直，以及集成到单一扫描平台上。

图像采集过程中，对成像探头进行二维连续光栅扫描。将时间分辨的光声信号乘以声速（1,540 m/s）以获得A-line信号。在Y轴载物台连续运动过程中采集多个A-line信号，生成二维B-scan图像。对成像区域采集多个B-scan图像并存储于计算机中，用于后续处理并生成MAP光声图像。

为了确定可切换系统的分辨率，使用单个纳米颗粒的光声显微图像（MAP图像）进行分析31。将图像中心横向方向上的光声信号幅度绘制成曲线，并拟合为高斯函数...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

总之，已开发出一种可切换的光声显微成像系统（AR-PAM与OR-PAM），能够实现较浅成像深度下的高分辨率成像以及较深成像深度下的低分辨率成像。该可切换系统的横向分辨率和成像深度已被测定。该可切换PAM系统的优势包括：（1）利用紧密光学聚焦实现高分辨率成像；（2）利用声学聚焦实现深层组织成像；（3）采用暗场照明用于AR-PAM，避免皮肤表面产生强烈的光声信号；（4）可在不移动样品的情况下在同一位置完成两种模式的成像；（5）无需使用多个激光器和扫描平台；（6）极少使用自制组件。这是首次报道将OR-PAM与暗场AR-PAM相结合的技术，能够在不移动样品或目标的情况下，对同一样品获取高分辨率的浅层图像和低分辨率的深层组织图像。由于使用相同的扫描平台和激光器，该系统具有高效且成本较低的优点。该组合系统在1.4 mm成像深度下可实现4 µm的横向分辨率，在7.8 mm成像深度下可实现45 µm的横向分辨率。系统采用光学笼式结构设计，自制组件极少，便于组装、光路对准以及在AR-PAM与OR-PAM之间切换。集成化的扫描头结构紧凑，可方便地安装于单一扫描平台上。利用该组合系统， 体内 成像成功实现。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物护理和使用委员会批准的指南和规定进行（动物实验方案编号 ARF-SBS/NIE-A0263）。作者在本论文中无相关财务利益，也无其他潜在的利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢新加坡教育部资助的二类资助项目（ARC2/15：M4020238）提供的经费支持。作者还感谢周伟雄先生（Mr. Chow Wai Hoong Bobby）在机械加工车间提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Q 开关 Nd:YAG 激光器EdgewaveBX80-2-L泵浦激光器 
Credo 高重复频率染料激光器Spectra physicsCREDO-DYE-N染料激光器
精密线性位移台Physik InstrumentePLS 85 XY 光栅扫描平台
平移位移台Physik InstrumenteVT 80 共聚焦测定
带安装座的硅光电二极管ThorlabsSM05PD1A触发/脉冲变化
电动连续旋转位移台 ThorlabsCR1/M-Z7偏转激光束
带安装座的连续可变中性密度滤光片ThorlabsNDC-50C-4M强度可调
光纤跳线ThorlabsM29L01多模光纤
显微镜物镜NewportM-10X物镜 
XY 平移安装架ThorlabsCXY1平移安装架
平凸透镜ThorlabsLA1951准直透镜
锥形透镜 AltechnaAPX-2-B254环形光束
平移位移台ThorlabsCT1平移位移台
光学聚光镜自制
超声换能器Olympus-NDTV214-BB-RM50 MHz 换能器
平凹透镜ThorlabsLC4573声学透镜
脉冲发生器/接收器Olympus-NDT5073PR脉冲回波放大器 
带安装座的标准光阑ThorlabsID12/M光束整形
平凸透镜ThorlabsLA4327聚光镜
带安装座的精密针孔ThorlabsP50S空间滤波
单模光纤跳线ThorlabsP1-460B-FC-1单模光纤
光纤耦合器NewportF-91-C1单模耦合
消色差双合透镜Edmund Optics32-317消色差双合透镜
镀保护银膜的椭圆反射镜ThorlabsPFE10-P01反射镜
直角运动学反射镜安装架ThorlabsKCB1反射镜安装架
Z 轴平移安装架ThorlabsSM1Zz 向位移器
透镜套管ThorlabsSM05L10
紫外熔融石英直角棱镜ThorlabsPS615直角棱镜
菱形棱镜Edmund Optics47-214剪切波
二甲基聚硅氧烷Sigma AldrichDMPS1M硅油
放大器Mini CircuitsZFL-500LN放大器
16 位高速数字化仪SpectrumM4i.4420数据采集卡
示波器Agilent TechnologiesDS06014A
小鼠 InVivos Pte.LtdICR动物模型
超声耦合凝胶 Progress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000声学耦合
水槽自制
平移位移台自制切换 AR-OR
金纳米颗粒Sigma Aldrich742031横向分辨率
无菌眼用软膏AlconDuratears动物成像
1951 USAF 分辨率测试板Edmund Optics38257共聚焦校准
数据采集软件National InstrumentLabview基于 Labview 自制的软件
图像处理软件MathworksMatlab基于 Matlab 自制的程序

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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