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方法文章

一种高性能紧凑型光声断层成像系统 体内 小动物脑成像

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DOI：

10.3791/55811

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2017年6月21日

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

基于紧凑型脉冲激光二极管的光声断层成像（PLD-PAT）系统用于高速成像 体内 在小型动物中进行脑成像的演示。

摘要

体内小动物成像在临床前研究中具有重要作用。光声断层成像（PAT）是一种新兴的混合成像模式，在临床前和临床应用中均展现出巨大潜力。传统的基于光学参量振荡器的PAT（OPO-PAT）系统体积庞大、成本高昂，且无法实现高速成像。近年来，脉冲激光二极管（PLD）已被成功验证为PAT的一种替代激发光源。脉冲激光二极管光声断层成像（PLD-PAT）已在光声仿体和生物组织的高速成像中得到成功应用。本研究提供了一套利用PLD-PAT进行体内脑部成像的可视化实验方案。该方案包括紧凑型PLD-PAT系统的配置及其说明、用于脑成像的动物准备，以及大鼠脑部二维横截面成像的典型实验流程。PLD-PAT系统结构紧凑、成本低廉，能够实现高速、高质量的成像。文中展示了在不同扫描速度下采集的体内脑部图像。

引言

光声断层成像（PAT）是一种混合成像技术，在临床和临床前研究中具有广泛应用1,2,3,4,5。在PAT中，纳秒激光脉冲照射生物组织。组织中的生色团吸收入射光后引起局部温度升高，进而产生以声波形式发射的压力波。超声探测器在样品周围不同位置采集光声信号。利用多种算法（如延时叠加算法）6对光声（PA）信号进行重建，以生成光声图像。

这种混合成像模式可实现高分辨率、深组织成像，并具有高光学吸收对比度7,8最近，约12厘米的成像深度9 借助更长的波长（约1 064 nm）和一种名为磷酞菁（phosphorus phthalocyanine）的外源性对比剂，实现了对鸡胸组织的成像。该方法的成像深度灵敏度远高于其他光学方法，如共聚焦荧光显微镜、双光子荧光显微镜的深度灵敏度。10 光学相干断层扫描, 11等等。 利用多个波长，光声断层成像技术可展示器官的结构与功能变化。对于许多人类疾病而言，小动物模型已被广泛建立。12,13,14,15对于小动物成像，已有多种成像方式被证实可行。在所有这些方法中，光声（PA）成像由于上述优势而迅速受到关注。光声断层成像（PAT）已展现出在组织和器官中对血管进行成像的潜力（即， 心脏、肺、肝脏、眼睛、脾脏、脑、皮肤、脊髓、肾脏 等等。小型动物的4,16,17,18光声断层成像（PAT）是一种成熟的小动物脑部成像技术。由于生色团吸收光能而产生光声波，因此多波长PAT可用于绘制总血红蛋白浓度（HbT）和氧饱和度（SO）的分布图。2)19,20,21,22借助外源性对比剂实现了脑神经血管成像12,23,24光声成像技术可通过提供分子和遗传水平的信息，有助于更深入地理解脑健康状况。

在小动物成像中，Nd : YAG/OPO 激光器被广泛用作光声成像（PAT）的激发光源。这类激光器可输出能量约为 100 mJ（在 OPO 输出窗口处）、脉宽约为 5 ns 的近红外脉冲，重复频率约为 10 Hz25。配备此类激光器的光声系统成本高、体积庞大，且由于激光源的低重复频率，只能使用单阵元超声换能器（UST）实现低速成像。此类光声系统中，每个横截面的典型 A 线采集时间约为 5 分钟25。对于小动物成像而言，如此长的测量时间并不理想，因为在进行全身成像、时间分辨功能成像等实验时，难以有效控制生理参数。etc. 通过采用多个单阵元 UST、基于阵列的 UST 或高重复频率激光器，可以提高光声系统的成像速度。若仅使用一个单阵元 UST 采集样品周围的所有光声信号，则会限制系统的成像速度。已有研究展示了采用环形或半环形几何排列的多个单阵元 UST，用于实现高速、高灵敏度的成像技术。基于阵列的 UST26，例如线性阵列、半环形阵列、环形阵列和三维阵列，已成功应用于实时成像1。这些基于阵列的 UST 可提高成像速度并降低测量灵敏度，但其成本较高。然而，使用基于阵列的 UST 的光声系统，其成像速度仍受限于激光器的重复频率。

脉冲激光技术的进步推动了高重复频率脉冲激光二极管（PLDs）的发展。利用临床超声平台，结合脉冲激光二极管已实现每秒7,000帧的B扫描光声成像。27此类PLD即使在单元素超声换能器（UST）环形扫描构型下，也能提高光声断层成像（PAT）系统的成像速度。单元素UST相比基于阵列的UST成本更低且灵敏度更高。在过去十年中，关于将高重复频率PLD用作光声成像激发光源的研究报道较少。已有研究展示了基于光纤的近红外PLD用于仿体的光声成像。28。该 体内 在人类皮肤下约1毫米深度处实现了血管成像，该技术采用低能量光声探测器（PLDs）完成29基于PLD的光学分辨率光声显微镜（ORPAM）已被报道。利用PLD，实现了在0.43 Hz帧率下深度约1.5 cm的成像30最近，有研究报道了一种PLD-PAT系统，可在生物组织中以约2 cm的成像深度在短至约3 s的时间内提供图像25,31本研究证明，这种低成本、紧凑型系统即使在高速下也能提供高质量的图像。PLD-PAT系统可用于高帧率（7,000 fps）光声成像、浅表血管成像、手指关节成像、2 cm深度组织成像、小动物脑部成像， 等等。 来自PLD的单波长、低脉冲能量脉冲限制了其在多光谱和深层组织成像中的应用。已采用相同的PLD-PAT系统在小型动物上开展了实验，该系统用于临床前应用。本研究旨在为PLD-PAT系统提供可视化的实验演示 体内 小型动物脑部二维横断面成像

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方案

所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物护理和使用委员会批准的指南和规定进行（动物实验方案编号 ARF-SBS/NIE-A0263）。

1. 系统描述

  1. 将PLD安装在圆形扫描仪内部，如图所示 图1a将PLD连接至激光驱动单元（LDU）。
    注意：脉冲激光沉积系统（PLD）在波长约为803 nm处提供约136纳秒的脉冲，最大脉冲能量约为1.42 mJ，重复频率最高可达7 kHz。激光驱动单元（LDU）包括：温度控制器、可调电源、电源（12 V）和函数发生器；参见材料表。可调电源用于控制激光功率，函数发生器用于调节PLD的重复频率。
  2. 打开PLD激光器。使用LDU中的函数发生器将PLD重复频率设置为“7,000” Hz。通过将可调电源电压设置为“3.1” V，将脉冲能量提高至1.42 mJ。
  3. 将光学扩散器（OD）安装在PLD出射窗口前方，以使输出光束均匀，如图所示 图1a.
    注意：使用细砂磨砂器（即， 1,500目抛光
  4. 将聚焦的UST安装到UST支架上，使其朝向扫描区域的中心，如图所示 图1a.
    注意：超声换能器（UST）的中心频率为2.25 MHz，焦距为1.9 in。
  5. 将超声探测器放入亚克力水箱内，如图所示 图1a将水注入水箱，直至超声换能器完全浸没。
    注意：使用水作为介质将光声信号从脑组织（样品）耦合至超声换能器（UST）。为小动物成像专门设计了一种丙烯酸材质的水箱（WT；参见材料表）。水箱设计的示意图如下所示 图1b.
  6. 使用脉冲/接收单元（PRU；参见）检查样品的光声信号 材料表).
    注意：这些信号由一块12位DAQ卡进行数字化（参见 材料表以100 MS/s的采样率采集信号，并保存至计算机。

2. 大鼠脑成像的动物准备

注意：上述 PLD-PAT 系统已用于小动物脑部成像实验。本实验采用健康雌性大鼠（见材料表）。

  1. 通过腹腔注射混合溶液麻醉动物，混合溶液包含 2 mL 氯胺酮、1 mL 赛拉嗪和 1 mL 生理盐水（剂量为 0.2 mL/100 g）。
  2. 使用毛发修剪器去除动物头皮上的毛发。在剃毛区域轻轻涂抹脱毛膏，以进一步清除残留毛发。
    1. 使用棉签在 4–5 分钟后清除已涂抹的脱毛膏。
    2. 向动物眼睛涂抹人工泪膏，以防止因麻醉和激光照射导致的眼睛干涩。
  3. 将自制的动物固定装置（参见材料表）安装在实验升降台上，该装置配备呼吸面罩（参见材料表）。
  4. 将动物以俯卧位放置于固定装置上，并使用手术胶带将其固定，以避免成像过程中动物移动。
  5. 确保呼吸面罩覆盖大鼠的鼻部和口腔，以输送吸入性麻醉剂。

3. 在体实验 大鼠脑成像

  1. 将呼吸面罩连接至麻醉机。打开麻醉机，设置为输送1.0 L/min的氧气，并含0.75%异氟烷。
    1. 将脉搏血氧仪夹在动物尾部以监测其生理状况。
  2. 在大鼠头皮上涂抹一层无色超声耦合剂。调整实验升降台位置至扫描仪中心。呼吸面罩经过定制以适配成像窗口。将市售鼻罩的10%部分剪下，然后连接至一段手套材料。
    1. 手动调节实验室升降台的高度，使成像平面位于超声换能器（UST）的焦点处。
  3. 根据需要在数据采集软件（见材料表）中设置参数。运行数据采集软件程序以开始采集即， 成像
    注意：该程序用于旋转超声换能器（UST）并采集A-line光声信号。采集到的A-line信号将保存在计算机中。
  4. 在整个成像期间观察动物，成像完成后进行光声断层成像重建。
  5. 数据采集结束后，使用重建软件程序根据A线重建脑部横断面图像。
  6. 关闭麻醉系统，将动物从实验台上取出，放回笼中，并监测直至其恢复意识。
    注意：例如，如果UST旋转5秒，PLD将发射35,000（= 5 × 7,000）个脉冲，UST采集35,000条A线。通过对70个信号进行平均，将35,000条A线减少为500条（平均后的A线数 = 35,000 / 70 = 500）。 图1c 展示了激光脉冲的照射与A线信号的采集。应使用基于延时叠加反向投影算法的重建程序。

超声设置示意图，包含光声吸收、CSP、PLD、动物模型及吸收波分析
图1： PLD-PAT 系统示意图 (aPLD-PAT 示意图。PLD：脉冲激光二极管，CSP：圆形扫描板，AM：麻醉机，M：电机，MPU：电机滑轮单元，LDU：激光驱动单元，PRU：脉冲发生/接收单元，UST：超声换能器，WT：水槽，PF：聚合物薄膜，DAQ：数据采集卡。b) 水箱示意图，俯视图（1）和横截面视图（2） 体内 小动物脑成像。A：螺钉，B：丙烯酸环形板，C：硅胶“O”型圈，D： 100 µm- 厚实透明的聚乙烯覆盖层。罐体底部有一个直径为9 cm的孔，并用一种超声和光学透明的材料密封， 100 µm-厚聚乙烯膜。 (c) PLD 激光脉冲与 A 线的照射示意图，以及在 5 s 连续扫描时间内进行信号采集。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

的 体内 本节展示了脑成像结果，以体现所描述的PLD-PAT系统的性能。为展示PLD-PAT系统的高速成像能力， 体内 对两只不同健康大鼠进行了脑成像。 图2 显示了一只雌性大鼠（93 g）在不同扫描速度下的脑部图像。 图 2a 图a和图b显示了在移除脑区头皮前后的大鼠脑部照片。PAT成像以非侵入性方式完成（即， 保持皮肤和颅骨完整。通过将超声换能器（UST）分别旋转5秒、10秒、20秒和30秒，采集脑部横截面的光声（PA）信号。 图 2c-f 显示了在 5 秒、10 秒、20 秒和 30 秒扫描时间内获得的大鼠脑部 PAT 重建横截面图像。在所有这些脑图像中，横窦（TS）、上矢状窦（SS）以及包括分支在内的脑静脉（CV）均清晰可见。这些结构在所示图像中已标出。 图 2f这些结果表明...

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讨论

本研究提供了一种用于执行的实验方案 体内 使用PLD-PAT系统对大鼠进行脑部成像。该方案详细描述了成像系统的构成及其校准方法，并展示了大鼠脑部成像的实验过程。现有的基于OPO的光声断层成像（PAT）系统成本高、体积庞大，且每5–10分钟才能获得一幅横截面图像。而PLD-PAT系统结构紧凑、便于携带、成本低廉，可在3秒内获得高质量图像。该系统的性能此前已在仿体模型中进行评估，并与传统PAT系统进行了比较。25. 此处展示了相同的PLD-PAT，用于快速 体内 脑成像。结果表明，该系统能够提供高质量 体内 图像，即使在5秒内。

尽管PLD-PAT系统具有若干优势，但也存在一些缺点。本研究中使用的PLD仅能提供单一波长的脉冲，因此无法实现需要多波长照明的功能成像。要实现功能成像，需要具备多波长照明能力的PLD。低能量的PLD脉冲限制了成像深度。然而，通过使用外源性对比剂，有可能增强PLD-PAT系统的成像深度。

通常，PLD 激光...

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披露

作者在本论文中无相关财务利益，也无其他潜在利益冲突需要披露。

致谢

本研究由新加坡教育部资助的第二级基金（ARC2/15：M4020238）以及新加坡卫生部国家医学研究理事会（NMRC/OFIRG/0005/2016：M4062012）资助。作者谨此感谢周伟雄（Bobby Chow Wai Hoong）先生在机械加工车间提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脉冲激光二极管Quantel，法国QD-Q1910-SA-TEC作为激发光源，参数为：803 nm，每脉冲1.4 mJ，脉冲宽度136 ns，最高重复频率7 kHz，尺寸：11.0 × 6.0 × 3.6 cm，重量：约150 g
带齿轮箱的步进电机LIN Engineering（Servo Dynamics）电机：CO-5718-01P，齿轮箱：DPL64/1，减速比 I = 10（适用于NEMA 23）；电源：PW100-48用于在圆形几何路径上移动探测器支架。扭矩：2.08 N·m，转子惯量：2.6 kg·cm²
超声脉冲发射/接收器Olympus5072PR用于接收、滤波并放大来自超声换能器的光声信号。带宽为35 MHz，增益为±59 dB。
超声换能器OlympusV306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069用于光声检测的超声传感器。中心频率2.25 MHz，直径0.5英寸，柱面聚焦距离1.9英寸
PCIe数据采集卡（DAQ）GaGeCSE4227/ A6000610/B0E0061012位，100 Ms/s，2通道，板载内存1 Gs，PCIe x16接口
大鼠In Vivos Pte Ltd，新加坡NTac:SD，Sprague Dawley / SD雌性，体重100 ±10 g
亚克力水箱 NTU车间定制用于盛装水，作为脑组织与探测器之间的声学耦合介质
圆形扫描仪 NTU车间定制扫描仪由铝材制成 
麻醉机medical plus pte ltd带氧气浓缩器的非重复呼吸麻醉机为动物提供氧气和异氟烷
便携式脉搏血氧仪MedtronicPM10N 配备兽用传感器用于监测动物的脉搏血氧饱和度
超声耦合凝胶Progress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000透明超声凝胶
数据采集软件美国国家仪器公司（National Instruments Corporation, Austin, TX, USA）NI LabVIEW 2015 SP1本实验室开发的基于LabVIEW的程序，用于控制步进电机并从探测器采集光声信号
数据处理软件Matlab（Mathworks, Natick, MA, USA）Matlab R2012b本实验室开发的用于重建光声图像的Matlab代码
温度控制器 LaridTech, MO, USAMTTC1410用于持续控制脉冲激光二极管（PLD）的温度 
12 V电源 Voltcraft PPS-11810为脉冲激光二极管（PLD）提供工作电压
可调电源 BASETechBT-153用于调节激光输出功率
函数发生器 FunktionsgeneratorFG250D用于调节脉冲激光二极管（PLD）的重复频率。可提供TTL信号，以实现数据采集系统与激光激发的同步
实验动物供应商In Vivos Pte Ltd，新加坡为科研用途提供小型实验动物的供应商
动物固定装置NTU车间定制用于将动物腹部朝上固定
呼吸面罩NTU车间定制与动物固定装置配合使用，向动物输送麻醉混合气体
戊巴比妥钠Valabarb实验结束后用于安乐死动物
光学扩散器ThorlabsDG10-1500用于使激光光束均匀化

参考文献

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