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方法文章

用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

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DOI：

10.3791/55813

⸱

2017年8月4日

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

本文内容

摘要

本文针对基于蛋白质的水凝胶中调控三维结构的不同方法，从材料特性角度进行了评估。将大孔网络功能化修饰以细胞黏附肽，并利用两种不同的模式细胞系评估其在细胞培养中的可行性。

摘要

水凝胶因其能够提供高度水合的细胞环境，被公认为是细胞培养应用中有前景的材料。由于这类材料有可能模拟天然细胞外基质，三维模板领域正迅速发展。基于蛋白质的水凝胶尤其具有潜力，因为它们易于功能化，并可形成具有可调物理化学性质的特定结构。然而，使用天然材料制备用于细胞培养的宏观多孔三维模板，常受限于其机械性能较合成材料更弱。本研究评估了多种方法，以制备基于牛血清白蛋白（BSA）的多孔水凝胶体系，其孔径半径可在10至70 µm范围内调节。此外，建立了一种在该蛋白质材料中生成长达数百微米通道的方法。研究分析了不同成孔方法以及孔径大小对材料性能（如溶胀比、pH值、温度稳定性及酶降解行为）的影响。采用共聚焦激光扫描显微镜对水凝胶在天然溶胀状态下的孔径进行了表征。通过在蛋白质体系中引入细胞黏附性RGD肽修饰，并结合两种模型细胞系——人肺癌细胞（A549）和人腺癌肺泡基底上皮细胞（MCF7），评估了该材料在细胞培养应用中的可行性。

引言

水凝胶是一类能够形成不溶性三维网络结构并结合大量水分的材料。这类材料可为活细胞提供优良的环境条件。目前，人们对构建三维水凝胶结构以及开发调控其化学和物理特性的方法日益关注。一旦实现这些目标，便可为细胞生长及细胞行为的调控提供理想的模板1,2,3,4。这些三维结构不仅比传统的二维培养方法更接近自然、更真实，还为干细胞或肿瘤模型的培养开辟了新的可能性5。不同材料具有多种特性，主要取决于凝胶的孔径大小6。孔隙在细胞培养应用、组织工程以及干细胞定向生长中起着关键作用。例如，氧气和营养物质需通过基质扩散，并确保足够量能够到达细胞7；另一方面，有害代谢产物必须尽快被清除，同时需提供充足的细胞生长空间7。因此，材料的特性，尤其是孔径大小，显著影响基质的潜在效益及其可能的应用范围。根据材料特性的不同，三维细胞培养中可能发生多种细胞生长过程，包括神经结构的形成、皮肤或骨细胞的生长与分化，以及肝细胞或成纤维细胞等特定干细胞系的定向生长2,3,8,9,10,11。另一个影响材料应用潜力的关键因素是其对外界刺激的稳定性12。例如，水凝胶必须在细胞培养基或人体环境中保持其机械完整性。

近年来，针对三维细胞培养水凝胶的研究日益深入，许多研究致力于解析这些系统的三维结构13。由化学合成组分构成的水凝胶是目前研究最为广泛的类型，因其易于合成和化学修饰，并具有较高的稳定性（参见Zhu et al., 2011年的综述）5。然而，蛋白质具备多种有益特性：作为所谓的"精密聚合物"，它们具有良好的生物相容性；具有确定的长度；相对易于修饰；并且拥有大量的可靶向位点14,15。因此，可设计出高度特异性的创新结构，应用于多个领域。本研究采用一种基于蛋白质的水凝胶16，以验证成熟方法调控材料三维结构的能力。此外，还进一步探讨了其在孔隙生成方面的潜力与适用性。

目前已有多种技术可用于修饰三维结构，包括一些简单方法以及来自材料科学不同领域的复杂且高度专业化的技术。其中一种广泛应用的技术是利用静电纺丝来制备结构明确的纤维17。在电场作用下，带电纤维从溶液中被拉出，并在接触氧气后固化，从而可制得直径从数纳米到数微米不等的纤维。其他用于调控基质内孔隙尺寸、结构和分布的技术还包括软光刻、光刻、流体动力聚焦、电喷雾和生物打印18,19,20。这些技术的一个显著缺点是依赖特定且昂贵的设备以及特殊的化学品或材料。此外，这些技术的经验通常难以直接应用于基于蛋白质的材料，而且许多化学品和方法不具备细胞相容性。

另一方面，许多技术不依赖特殊设备，因此更易于应用和复制，且成本较低。一种广泛应用的结构调控方法是溶剂浇铸法21,22,23。在聚合反应之前加入颗粒，并使其均匀分布以饱和溶液。聚合完成后，通过改变条件（如稀释或pH值变化），颗粒被溶解，而孔隙则保留在材料中。这些技术所使用的化学物质（如盐、糖、石蜡、明胶和白垩）价格低廉且易于获得。在冷冻干燥法中，溶胀的水凝胶被冷冻，随后在真空条件下使液相发生升华23,24,25。网络中的水升华过程足够温和，能够维持材料特定的三维结构。在气体发泡法中，聚合过程同时通入气体，从而在凝胶中形成孔隙21。孔隙的大小和分布可根据气体流速进行调节。

为了形成蛋白质水凝胶，牛血清白蛋白（BSA）与四（羟甲基）磷氯化物（THPC）通过曼尼希型反应进行反应，从而使伯胺基团与四臂连接分子的羟基之间形成共价键26。反应完成后，通过大量洗涤材料以去除可能有害的中间产物。

本研究展示了利用不同技术处理基于牛血清白蛋白（BSA）的材料，以调控和定制其孔径大小的可能性。这些技术均可在全球任何实验室中使用，无需特殊设备。此外，还对溶胀比、酶降解性、pH 稳定性和温度敏感性等不同参数进行了检测和相互比较，尤其关注不同技术对三维结构形成的影響。最后，通过将材料与细胞黏附肽功能化，以探究其在细胞培养中的潜在应用。实验中使用了两种不同的模型细胞系：A549 和 MCF7。

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方案

1. 水凝胶制备

  1. 将 200 mg BSA 与 1 mL 去离子 H2O 混合，配制 20% (w/v) BSA 储液（储液 A）。
  2. 将 165 µL THPC 溶液（134 mg/mL）与 4.835 mL 去离子水混合，配制 THPC 储液（储液 B）。
  3. 称取 1 mg KCSSGKSRGDS（1,111.1 g/mol）多肽（或等效的细胞黏附多肽），溶于 100 µL 无菌 H2O 中，得到 10 mg/mL 溶液（储液 C）。
    注意：此步骤为可选步骤，仅当水凝胶用于细胞培养应用时才需进行。
  4. 取一个 96 孔板，移除其底部，并用可剥离的塑料膜替代。
    注意：对于本实验所用的 96 孔板，可通过向每个孔的底部施加压力轻松移除底部；薄塑料底部会自行脱落。
  5. 在 96 孔板中加入 100 µL BSA 储液（A）和 100 µL THPC 储液（B）（如需制备功能化、具有细胞黏附性的水凝胶，可额外加入 4 µL 储液 C），总体积为 200 µL 水凝胶。通过移液器上下吹打至少 5 次，确保各组分充分混合，以保证聚合后形成均匀的水凝胶。
  6. 将 96 孔板置于室温（RT）约 10 分钟，直至所有水凝胶完全聚合。
  7. 小心缓慢地从孔板底部剥离塑料膜。
  8. 使用小型冲压工具将水凝胶从 96 孔板中推出，并转移至含有无菌 PBS（pH 7.4）的 1.5 mL 离心管中。
    注意：水凝胶呈圆柱形，直径约为 4 mm，高度约为 8 mm。
  9. 将水凝胶置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C 保存，可稳定存放数月。

2. 水凝胶的冷冻干燥

  1. 用移液器将 500 µL 无菌去离子 H2O 加入 1.5 mL 离心管中，并取下管盖。使用刮勺将水凝胶转移至 1.5 mL 反应管中。
  2. 用 Parafilm 封口膜紧密包裹 1.5 mL 离心管，每管至少包裹三层。用针头在膜上刺若干小孔，以允许管内气体释放。
  3. 进行以下任一步骤：
    1. 将离心管置于液氮中 5 分钟，确保水和水凝胶完全冻结。从液氮中取出后，立即转移至冷冻干燥机中，防止材料解冻。
      注意：此步骤所得孔径半径约为 10–15 µm。
    2. 将离心管于 -20 °C 下静置过夜，缓慢冻结水凝胶。从 -20 °C 环境中取出后，立即转移至冷冻干燥机中，防止材料解冻。
      注意：此步骤所得孔径半径约为 50–60 µm。
  4. 24 小时后（水凝胶内部及周围水分已完全蒸发），将材料从冷冻干燥机中取出，使其解冻。
    注意：孔径大小可通过共聚焦激光扫描显微镜分析（步骤 5，“水凝胶可视化”）。

3. 颗粒浸出

  1. 按照步骤 1.1–1.5 所述方法制备水凝胶。
  2. 在混合组分后立即加入 NaCl，直至达到饱和（36 mg/mL）。持续加盐直至溶液中可见作为白色沉淀的盐晶体。
  3. 将 96 孔板转移至摇床中，振荡直至发生聚合（约 10 分钟）。按照步骤 1.7–1.8 所述方法从孔板中取出水凝胶。
  4. 将水凝胶置于摇床上，于室温下在无菌水中孵育至少 24 小时（20 rpm），以充分洗脱水凝胶模板中的盐分。将水凝胶储存在 4 °C 的 PBS 中，可保存数月。

4. 通道形成

  1. 按照步骤1所述制备水凝胶。使用镊子将水凝胶从溶液中取出，用高吸水性纸巾吸去多余水分，然后将其置于干冰块上。
  2. 将水凝胶冷冻30秒，然后小心地从干冰块上取下。注意不要损坏水凝胶；可使用刮刀小心地将其从干冰块上刮下。将水凝胶转移至1.5 mL离心管中，并在37 °C下干燥过夜。

5. 水凝胶可视化

  1. 配制罗丹明B储备液：将1 mg罗丹明B溶于10 mL PBS中。通过将罗丹明B储备液用PBS逐级稀释，制备系列稀释液，直至获得浓度为0.001 mg/mL的溶液（稀释倍数：100）
  2. 将水凝胶从保存溶液中取出（例如， 从步骤2.4开始，将其转移至含有1 mL浓度为0.01 mg/mL罗丹明B溶液的1.5 mL离心管中，在室温下用罗丹明B溶液避光染色过夜。
  3. 次日，将需进行可视化的水凝胶转移至10 mL PBS（pH 7.4）中，洗涤至少3 h。
  4. 将水凝胶转移至 µ- 滑动8孔板并用PBS覆盖。
  5. 使用刀片从水凝胶上切割出小片（高度约0.5 mm）。
  6. 使用共聚焦激光扫描显微镜，在514 nm波长下观察水凝胶（物镜：EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27，扫描模式：514 nm平面扫描，缩放倍数：1X）。

6. 细胞培养可行性

  1. 使用 0.45 µm 滤膜对所有储备液（A、B 和 C）进行无菌过滤。
  2. 按照步骤 1.1–1.4 所述方法制备水凝胶，并在水凝胶聚合前加入细胞黏附肽。
  3. 混合组分后，立即用移液器将混合物加入 µ-slide 8 孔板中，直至完全覆盖底部。
    注意：此步骤必须在混合后迅速完成，因为混合物在载玻片中数分钟内即开始聚合。
  4. 采用标准细胞培养技术培养黏附细胞并传代，获得单细胞悬液。将细胞转移至预热的无菌 DMEM 细胞培养基中，培养基中添加胎牛血清（FBS，10% (w/v)）、青霉素-链霉素（1% (w/v)）和非必需氨基酸溶液（MEM，1% (w/v)）。
  5. 使用 Neubauer 计数板对细胞进行计数，并小心地将所需数量的细胞（2 × 105 个细胞/cm2）悬液 200 µL 加至水凝胶表面。
  6. 用盖子盖好 µ-slide 8 孔板，并将其转移至培养箱（37 °C，5% CO2）中，在 37 °C 下孵育至少 4 小时。
  7. 细胞贴壁至少 4 小时后，用 200 µL 无菌细胞培养用 PBS 洗涤细胞两次。
  8. 在室温下用 200 µL 3.7% (v/v) 甲醛固定细胞 10 分钟，随后用 PBS（约 200 µL）洗涤两次。
    注意：操作甲醛时应佩戴适当的个人防护装备。
  9. 用 200 µL 0.1% Triton X 处理细胞 5 分钟以进行透化，随后用 PBS 洗涤两次。
  10. 将 5 µL 甲醇储备液与 195 µL PBS 混合，加入细胞中，在室温下避光染色 20 分钟。染色后用 PBS 洗涤两次。
  11. 使用共聚焦显微镜在 514 nm 激发波长下观察细胞黏附特性（物镜：EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27，扫描模式：514 nm，缩放倍数：1X）。使用相应软件分析图像（参见材料表）。

7. 水凝胶特性

  1. 溶胀比。
    1. 完全干燥水凝胶 37 °C 至少一天。
    2. 称量每块水凝胶并记录精确重量。
    3. 向一个2 mL离心管中加入1.5 mL PBS。
    4. 将水凝胶转移至该2 mL反应管中，并完全浸入PBS中。
    5. 将水凝胶在 PBS 中室温放置至少两天，以达到与 PBS 的平衡。
    6. 三天后，将水凝胶从溶液中取出，用纸巾轻轻擦干以去除水凝胶表面的多余水分。
    7. 称量水凝胶。
    8. 使用以下公式计算溶胀比：
      溶胀比计算公式，(Ws - Wd) / Wd，用于材料膨胀分析的方程。
      其中 Wd 是干燥凝胶的重量（步骤 7.1.2），Ws 是湿凝胶的重量（步骤 7.1.7）。乘以 100 得到溶胀率百分比。
  2. pH 和温度稳定性
    1. 将5 mL PBS转移至15 mL离心管中。
    2. 调节溶液至适当的pH值（例如， pH 2、7 或 10）用 NaOH 和 HCl 调节。将溶液升至适当温度（例如， 室温 37 °C，或 80 °C).
    3. 将待研究其稳定性的水凝胶转移至适当的溶液中。必要时重新调节pH值。
      注意：所有水凝胶在此时应完全溶胀（参见溶胀率），以防止因材料溶胀而导致的重量误读。
    4. 在特定时间间隔后，将水凝胶从溶液中取出（例如， 每小时一次，持续长达2天，用高吸水性纸巾擦干以去除多余水分，然后称重。
  3. 酶解反应
    1. 根据制造商说明书，配制含有300 U胰蛋白酶和胃蛋白酶的储备酶溶液。
    2. 转移水凝胶（例如， 从步骤1.8）开始加入相应的溶液。
      注意：所有水凝胶在此时应完全溶胀，以防止对重量产生错误解读。
    3. 在特定时间间隔后，将水凝胶从溶液中取出（例如， 每小时用高吸水性纸巾擦干以去除多余水分，然后称重。

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结果

水凝胶的开发已成为材料科学研究相关生物学领域中最突出的研究方向之一，科学文献数据库中已有数千条相关记录。尽管许多体系的行为已被深入研究，但在材料科学中，三维网络的操控——尤其是对敏感的蛋白质基材料的操控——常常是一个主要难题。另一个常被低估的挑战是使用冷冻电子显微镜准确测量材料的天然结构。这是因为样品制备（即干燥）过程往往会改变水凝胶的性质。为克服这一问题，本研究采用共聚焦显微镜对材料样品进行分析，该方法能够在材料处于天然、吸水溶胀的状态下对其进行表征。罗丹明B可通过静电相互作用结合到水凝胶骨架上，从而有助于材料的可视化。为了探究采用冷冻干燥方法调控该蛋白质基体系的可行性，将水凝胶分别在液氮中-196 °C和-20 °C条件下聚合并冷冻。结果显示，冷冻温度对最终孔径大小具有明显影响。在-196 °C条件下，形成的孔径较小，半径约为10 µm，且尺寸分布较窄。相反，在较高温度下冷冻则会产生孔径更大的材料，其半径介于50至70 µm之间，如图1所示。缓慢冷冻过程会形成较大的冰晶，冰升华后便在材料内部...

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讨论

制备大孔基质对许多不同领域具有重要意义。由于水凝胶具有明确的结构，并且能够控制和调节特定的材料性能，因此其在技术和经济上均具有巨大潜力。然而，在三维模板中引入超分子结构单元（如孔隙或通道）可能会影响材料的整体性能，例如溶胀比或刚度。这可能导致网络结构发生不希望的分解、降解或破坏，从而使材料无法使用或不适用于预期的应用12。蛋白质因其结构明确、固有的生物相容性（因其来源于天然物质）以及存在大量可修饰位点（例如，活性氨基、羟基或羧基）而在水凝胶应用中展现出已知的潜力。然而，与合成水凝胶相比，许多基于蛋白质的水凝胶缺乏足够的机械稳定性16。由于引入大的三维结构可能导致水凝胶完全结构解体，因此必须严格评估调控三维结构方法的可行性，以获得理想的材料性能，并充分发挥蛋白质材料的潜力。这正是本研究评估冷冻干燥和粒子沥滤工艺及其对蛋白质水凝胶最终性能影响的原因之一。

在使用水凝胶时，一个关键问题是材料在宏观尺度上的可视化。通常采用基于电子显微镜的方法来观察水凝胶的三维结构。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢巴登-符腾堡州基金会（Baden-Württemberg Stiftung）在“仿生材料合成”项目（BioMatS-14）框架下提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific10010023
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（高糖）Life Technologies / Thermo Fisher 11140-050
胎牛血清（FBS）Life Technologies / Thermo Fisher 10270-106
青霉素-链霉素Life Technologies / Thermo Fisher 15140122
MEM 非必需氨基酸溶液Sigma AldrichM7145-100ML
0.05% 胰蛋白酶 EDTA 酚红溶液Thermo Fisher Scientific25300062
99.8% 乙醇，vergälltÖlfabrik Schmidt2133
NaCl Carl Roth 9265.1
白蛋白 V 组分Carl Roth 3854.2
THPCSigma Aldrich404861-100ML有毒
0.1% Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML轻度毒性
鬼笔环肽-罗丹明 Life Technologies / Thermo Fisher R415
3.7% 甲醛 Life Technologies / Thermo Fisher F8775-25ML有毒
罗丹明 BSigma Aldrich81-88-9
Filtropur S 0.2 Sarsted Ag und Co.2 83.1826.001   
µ slide 8 孔板Ibidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS 肽UPEP Ulm定制合成
99.8% 乙醇，vergälltCarl Roth K928.5
Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管 Sarsted Ag und Co.62.547.254    
50 ml 离心管 Sarsted Ag und Co.62.547.254    
1.5 ml 离心管  Sarsted Ag und Co.72,690,001
2 ml 离心管  Sarsted Ag und Co.72,691
细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，平底Greiner655073
冷冻干燥机 Epsilon 1-6D Christ, Osterode am Harz, Germany
共聚焦激光扫描显微镜 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen 软件版本 2012 Sp1，黑色版，407 版本 8.1.0.484Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA 图像分析软件，GSA Image Analyzer，GSA，版本 419 3.8.7GSA GmbH

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