本文介绍了两种用于“时钟扫描”图像分析的新型 ImageJ 插件。这些插件扩展了原始 Visual Basic 6 程序的功能，更重要的是，通过将其集成到免费的图像分析软件包 ImageJ 中，使该程序能够被广大的科研群体所使用。
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本文内容
摘要
摘要
用于图像分析的时钟扫描协议是一种高效工具，可量化封闭或分割的凸形感兴趣区域内部、边界处以及外部（背景）的平均像素强度，从而生成平均积分径向像素强度分布曲线。该协议最初于2006年以Visual Basic 6脚本形式开发，但由于其形式所限，传播范围较小。为解决此问题，并响应其他研究者近年来的类似努力，我们将原始的时钟扫描协议代码转换为两个基于Java的插件，可兼容由NIH支持且免费提供的图像分析软件，如ImageJ或Fiji ImageJ。此外，这些插件还新增了多项功能，进一步扩展了原始协议的功能范围，例如可对多个感兴趣区域和图像堆栈进行分析。程序的后一特性在需要确定与时间和空间相关变化的应用中尤为有用。因此，对生物图像堆栈进行时钟扫描分析，可能适用于研究单个细胞内Na+或Ca++的扩散过程，也可用于分析突触连接或间隙连接细胞群体中的扩散性活动（例如，Ca++波）。本文中，我们描述了这些新的时钟扫描插件，并展示了其在图像分析中的一些应用实例。
引言
本研究的目的是提供一种无平台依赖且可自由获取的钟形扫描（Clock Scan）方案，供所有对此类图像分析感兴趣的科研人员使用。钟形扫描方案最初于2006年开发1，旨在改进在凸形感兴趣区域（ROI）内进行像素强度定量的现有方法，该方法具有更强的整合能力以及更高的空间分辨率。在采集过程中，该方案依次收集多条从ROI中心至其边界，或至ROI外预设距离处的径向像素强度分布，以测量位于感兴趣区域外的"背景"像素强度。该方案根据扫描方向上测得的细胞半径对这些分布进行缩放，因此每条径向扫描从中心到ROI边界的距离在X轴上始终为100%。最后，程序将这些单独的分布平均为一条综合的径向像素强度分布曲线。由于进行了缩放处理，由"Clock Scan"方案生成的平均像素强度分布曲线既不受ROI尺寸影响，也在合理范围内不受ROI形状的影响。该方法允许直接比较不同ROI的分布曲线，或在需要时进行平均或相减操作。此外，该方案还允许通过简单减去位于对象外部像素的平均强度，对任意对象的综合像素强度分布进行背景噪声校正。尽管目前仅在生物样本中进行了测试，但本方案为研究围绕某一起始点组织的物理或化学过程图像（例如物质从点源扩散）所使用的其他现有图像分析工具提供了有价值的补充1。
然而，原始图像分析方法的主要局限性在于该方案是基于 Visual Basic 6 (VB6) 编写的（代码）....
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方案
1. 软件安装
- 根据各自网站上的建议，安装最新版本的捆绑 Java 以及 ImageJ 或 Fiji ImageJ（参见材料表中的相应网站链接）。在下文中，这两个程序均称为 "ImageJ"。
- 使用材料表中提供的链接复制 "Clock_Scan-1.0.1. jar" 和 "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" 插件文件，并将其粘贴到 ImageJ 插件目录中。或者，在计算机硬盘上保存这些文件后，使用 "Plugins | Install plugin" 菜单选项安装这些文件。
2. 时钟扫描分析
- 标准时钟扫描插件 (图1):
- 使用 ImageJ "文件 | 打开" 菜单命令以打开感兴趣的图像。
- 单击“多边形”工具或“折线选择”工具，然后在图像上绘制，以勾勒出整个感兴趣区域（ROI）或该区域的一部分。参见 图1A 以多边形选择为例（内侧虚线轮廓）。
注意：软件中提供的其他选择工具（矩形、椭圆和手绘线条选择）也可使用。
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结果
本文用于说明目的的图像来自我们先前的细胞和组织生物学研究中创建的数据库5,6,7，以及来自艾伦小鼠脑图谱数据库8。这两个插件已在 ImageJ 1.50i/Java 1.8.0_77、ImageJ 2.0.0-rc-44/1.50e/Java 1.8.9_66 和 Fiji ImageJ 2.0.0-rc54/1.51g/Java 1.8.0_66 程序环境中成功测试。
图1展示了使用标准 Clock Scan 插件进行图像分析的代表性结果。对于这两个插件，时钟扫描程序的基本代码和主要步骤与原始方案中描述的基本相同1
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讨论
时钟扫描方案： 时钟扫描法是一种快速且简单的图像分析工具。与现有的常见图像分析方法（如线性像素强度扫描或感兴趣区域（ROI）的平均像素强度计算）相比，该方法的优势已在先前的出版物中得到详细描述。1,9简而言之，该方案通过量化位于感兴趣区域（ROI）中心不同距离处的像素强度（例如物体边界，或物体外预设位置（背景））来生成完整的径向像素强度分布曲线。由于可对每个ROI的“时钟扫描”（clock scan）曲线进行即时背景校正，因此在生物学应用中，该方法对样本内或样本间标记/染色的不均匀性，以及显微镜光源强度或荧光曝光时间的不稳定性具有较低的依赖性。时钟扫描曲线对物体大小和形状的独立性进一步拓展了该方案的应用范围，使其能够用于不同物体之间的比较，并可通过逐点减去背景曲线的方式进行校正。 "阳性" 和 "阴性" 对照物体
时钟扫描插件： 分发和共享原始方案的主要限制在于其代码.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
我们感谢德国柏林分子药理学莱布尼茨研究所的Tanja Maritzen博士和Fabian Feutlinske博士与我们分享他们版本的Fuji ImageJ Clock Scan插件，并激励我们开发本版本程序。我们还感谢马克斯·普朗克感染生物学研究所淋巴细胞发育系的Fritz Melchers博士慷慨允许我们使用其部门数据库中的图像，用于测试和改进该插件。资助：转化神经科学中心；美国国立卫生研究院基金：P30-GM110702-03。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机 | 任意 | 与下文所列软件兼容 | |
| ImageJ 或 Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ 或 https://fiji.sc/ | 需捆绑 Java 1.8 或更高版本 |
| Clock-scan 插件 | 免费软件 | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar 和 Multi_Clock_Scan-1.0.1/jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | 本程序用于生成原始 Clock Scan 数据的部分图表。其他任意图形软件也可用于实现此功能 |
参考文献
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W.
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重印与许可
