方法文章

利用肿瘤治疗电场（TTFields）确定癌细胞的最佳抑制频率

DOI：

10.3791/55820

⸱

2017年5月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Preclinical Research Department, Novocure Ltd., Haifa, Israel, 2Novocure Ltd., Haifa, Israel, 3Novocure GmbH, Lucerne, Switzerland

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤治疗电场（TTFields）是一种有效的抗肿瘤治疗方法，通过持续、无创地施加低强度、中频交变电场来实现。使用 TTFields 体外 应用系统将 TTFields 施加于细胞系，可确定使细胞数量减少最显著的最佳频率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤治疗电场（Tumor Treating Fields, TTFields）是一种通过持续、无创施加低强度（1–3 V/cm）、频率在数百千赫兹范围内的交变电场来实现的有效治疗方式。在组织培养中对TTFields的研究采用TTFields体外应用系统，该系统可将不同频率和强度的电场施加于具有高介电常数（Ɛ > 5,000）的陶瓷培养皿上。将癌细胞系接种于陶瓷培养皿底部的盖玻片上后，可在两个正交方向上施加不同频率的TTFields，以开展细胞计数和克隆形成实验等疗效检测。本报告展示的结果表明，对于卵巢癌细胞和胶质瘤细胞，在细胞计数和克隆形成实验中TTFields的最佳频率均为200 kHz。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤治疗电场（Tumor Treating Fields, TTFields）是一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤及潜在其他癌症类型的抗有丝分裂治疗手段。该电场通过在肿瘤区域持续施加低强度（1-3 V/cm）、中频（100-500 kHz）的交变电场来实现1,2。体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，TTFields 能够抑制多种癌细胞系的生长，并延缓多种动物肿瘤模型中肿瘤的进展1,2,3,4,5,6,7。针对包括胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌在内的实体瘤患者的初步临床试验以及更大规模的随机研究，已证实持续应用 TTFields 具有良好的安全性和疗效8,9,10。TTFields 的疗效具有以下特征：（1）频率依赖性，特定的最佳频率可最大程度地减少不同来源癌细胞系的细胞数量1,2,4,5,6,7；（2）电场强度依赖性，其活性存在约 1 V/cm 的最低阈值，更高强度则效果更强1,2,7,11；（3）治疗时间越长，疗效越显著5；（4）当两个方向的 TTFields 相互垂直施加时，其效果优于单方向电场的应用1。基于上述发现，可通过在患者皮肤上局部放置两组换能器阵列，长期对患者施加 TTFields，以在肿瘤区域最大化电场强度12,13。

目前，研究交变电场（TTFields）对癌细胞作用的唯一方法是在体外（in vitro）进行实验，以确定适用于特定肿瘤类型的最优频率。寻找最优频率需要一种能够在100-500 kHz范围内施加不同频率、且场强最高可达3 V/cm均方根（RMS）的设备，作用于细胞培养物。由于施加TTFields会产生热量，该系统必须具备有效散热的能力，同时精确控制温度。

多年来，已开发出多种设备用于在细胞培养中施加TTFields1,2,5,14,15,16。在所有这些设备中，所使用的电极均为绝缘电极，以避免使用导电电极时可能出现的问题，例如电极表面的电子交换以及有毒金属离子释放到培养基中1。所测试的各种TTFields施加系统之间的主要区别在于所采用的电极绝缘类型，包括使用由薄层绝缘材料包裹的金属导线制成的电极2,14,15,16，或使用高介电常数材料（例如，铌镁酸铅-钛酸铅（PMN-PT））作为绝缘层的电极6。尽管绝缘导线电极为TTFields的施加提供了一种相对简单且成本较低的解决方案，但其通常受限于实现有效电场强度（高于1 V/cm阈值）所需的高电压，以及可用于细胞接种的表面积，因为电极之间的距离相对较小。基于高介电常数材料绝缘电极的系统虽然需要特殊的设计和制造能力，但无需高电压，并可在电极之间提供更大的细胞生长区域。

TTFields 体外 本研究中所采用的应用系统属于后一类系统，其核心单元为培养皿（TTFields 培养皿，参见 图1由高介电常数陶瓷组成的（即， PMN-PT)。在TTFields培养皿的外壁上垂直印刷两对电极，以便从两个方向施加电场。电极连接至正弦波信号发生器和放大器，使TTFields可在50–500 kHz频率范围内施加。为消散过多热量，TTFields培养皿置于制冷培养箱内，通过持续监测培养皿温度并调节系统施加的电压来实现培养基的温度控制。实际操作中，将培养箱设定在较低温度会导致更高的电场强度，因为系统会持续增加电压直至培养皿内达到目标温度。培养皿内部温度与培养箱设定温度之间的差异可能因温度梯度导致一定程度的蒸发；因此，需每24小时更换一次培养基，以维持适宜的细胞生长条件。

以下方案描述了优化肿瘤细胞中TTFields频率应用的实验步骤，旨在最大程度地减少细胞数量，并降低存活细胞形成集落的能力。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 电场治疗 体外 应用系统——基板与培养皿维护

  1. 用流动的自来水冲洗培养皿及其盖子，然后用去离子水冲洗，并倒置晾干。
  2. 若先前实验中在培养皿中添加过化疗药物/药物，需向每个培养皿中加入5%的稀释洗涤剂溶液，并静置过夜。
    1. 用流动的自来水彻底冲洗培养皿，确保皿内无任何洗涤剂残留。再用去离子水冲洗培养皿及其盖子，并倒置晾干。
  3. 将洁净且干燥的培养皿连同其盖子放入灭菌袋中，密封后将灭菌袋放入高压灭菌锅，培养皿应倒置放置。在不超过121 °C的条件下高压灭菌30分钟。
  4. 将高压灭菌锅设置为干燥程序，略微打开灭菌锅门，干燥培养皿30分钟。
  5. 用经70%乙醇轻微润湿的布擦拭底板。

2. 实验设置

注意：本方案中使用的所有仪器和材料均在材料清单中列出。以下所有步骤均应在超净工作台内进行，并保持无菌条件。

  1. 按照第1节所述准备清洁且无菌的TTFields培养皿和盖子。用蘸有70%乙醇的布轻轻擦拭底板。
  2. 将TTFields培养皿连同盖子安装到底板上，轻轻按压培养皿并顺时针旋转约5 mm，直至培养皿边缘卡入底板上的三个固定针中。在每个培养皿底部放置一片无菌的22 mm盖玻片（经处理的塑料或玻璃材质）。
  3. 使用完全培养基制备细胞悬液（U-87 MG和F98细胞使用DMEM培养基，A2780和OVCAR-3细胞使用RPMI培养基；补充成分详见 材料清单）。
    注意：细胞接种浓度取决于细胞类型和实验持续时间，实验结束时细胞融合度不应超过80%–90%。
    警告：人源细胞系可能具有生物危害性，应采取适当的安全防护措施进行操作。
  4. 将200 µL细胞悬液（通常为5,000–20,000个细胞/200 µL，具体数量根据倍增时间而定，适用于72小时实验）以液滴形式加至每片盖玻片中央，并用培养皿盖盖好。
  5. 将培养皿置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育，直至细胞贴壁；此阶段可进行过夜孵育。
  6. 使用200 µL或1,000 µL移液器吸除液滴中的培养液。
  7. 轻轻加入2 mL完全培养基以充满每个培养皿。使用无菌枪头进行加样，并轻敲盖玻片边缘，以释放偶尔被困在玻片下方的气泡。
  8. 盖上培养皿盖，将其置于37 °C、含CO2的培养箱中，直至开始TTFields处理。

3. TTFields 应用

  1. 将带有连接的 TTFields 培养皿的底板转移至制冷型 CO2 培养箱中。
    注意：体外 应用 TTFields 会产生热量；因此，需要使用制冷培养箱以补偿培养皿的升温。TTFields 强度越高，产生的热量越多，所需培养箱环境温度越低（见表1）。当 TTFields 应用时培养箱温度处于 18–30 °C 范围内时，可达到临床相关强度。
  2. 将扁平电缆的母接头连接到底板上。打开 TTFields 发生器。
  3. 启动 TTFields 体外 应用系统软件，并选择实验设置。
    1. 定义一项新实验。在计算机屏幕上的软件用户界面中输入实验名称和实验负责人。调节每个培养皿或底板的频率和目标温度。
  4. 通过软件启动 TTFields 应用。
  5. 确认所有培养皿均已正确连接，并在显示器上显示为浅蓝色。若某个培养皿被红色边框圈出（表示连接不良），请轻轻按压并缓慢来回旋转，直至接触恢复，培养皿重新显示为浅蓝色。
  6. 让 TTFields 体外 应用系统持续运行最多 24 小时。
  7. 若实验已达到终点，通过点击软件中的“结束实验”按钮停止实验，并进入第 5 步。否则，点击“暂停实验”。
  8. 从底板上断开扁平电缆连接器。将带有培养皿的底板从培养箱中取出，移至超净工作台。
  9. 每 24 小时更换所有培养皿中的培养基，并将底板放回制冷培养箱。使用扁平电缆将底板连接至发生器。点击“继续”按钮以继续实验。

4. 对照样品

注意：对照细胞的培养条件应与接受 TTFields 处理的细胞相似，但不施加 TTFields。

  1. 使用与TTFields处理样本相同的悬浮液和类似的表面接种对照样本。
  2. 将对照培养皿置于37 °C的CO2培养箱中。
  3. 每24小时更换一次培养皿中的培养基，以保持与TTFields处理组培养皿相同的培养条件。

5. 实验结束

  1. 单击“结束实验”后，等待软件从系统中检索所有记录，并将记录保存到计算机中。
  2. 使用“报告”按钮查看每块基板的温度、电流和电阻日志文件，以确认所有培养皿均按照实验计划进行了处理。
    注意：所有报告和日志均在实验结束后保存至计算机，可随时查阅。
  3. 关闭TTFields发生器。
  4. 从基板上断开扁平电缆，并将其从培养箱中取出。
  5. 要取下陶瓷培养皿，请向下按压并逆时针旋转，以将其从基板上解锁。
  6. 将培养皿移至超净工作台中，无菌操作取下盖玻片，并转移至含有新鲜培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌培养皿中，用于后续观察和评估。

6. 评估TTFields的效果

注意：TTFields 的效应可通过多种方式确定。请使用以下一种或多种方法将处理过的细胞与未经处理的对照细胞进行比较：

  1. 细胞计数
    1. 移除每个含盖玻片的培养皿中的培养基/PBS。
    2. 向每皿中加入 0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，孵育时间最长不超过 10 min（即， 直到细胞开始从盖玻片表面脱落）在37 °C的CO₂培养箱中孵育2 培养箱
    3. 加入0.5 mL完全培养基以中和胰蛋白酶，并通过轻柔吹打重悬细胞。
    4. 使用任何适用于低细胞浓度计数的标准细胞计数技术对细胞进行计数（即， 约 20,000 个细胞/mL。
  2. 克隆形成实验
    1. 将每个培养皿中的相似数量的细胞（每皿100-500个细胞）接种到新的无菌培养皿或6孔板中，每孔加入2 mL新鲜的完全培养基。
    2. 在 CO₂ 培养箱中孵育2 在37 °C培养箱中培养1至3周（根据各细胞系的特性而定），直至形成约含50个细胞的克隆。通过光学显微镜评估每个克隆的细胞数量。
    3. 吸去培养基，用 PBS 洗涤。
    4. 移除 PBS，加入冰预冷的甲醇（1 mL），在 -20 °C 下孵育 10 分钟或更长时间。
    5. 除去甲醇。
    6. 加入结晶紫溶液（0.1% w/v，溶于25% v/v 甲醇水溶液），孵育20分钟。
      警告： 结晶紫是一种潜在致癌物；操作时应佩戴手套。
    7. 去除结晶紫，用去离子水洗涤3次，然后自然晾干。
    8. 统计每个培养皿中形成的菌落数量。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过扫描不同频率的TTFields作用后，可根据多种检测方法量化其效果，例如细胞计数、比色法检测、克隆形成实验，以及利用置于特殊高壁TTFields细胞培养皿内的Boyden小室检测侵袭细胞数量的变化。基于预先确定的细胞倍增时间进行周密的实验设计，可使细胞在处理期间达到最大数量的有丝分裂事件，从而最大化治疗效果。

图2展示了在双方向TTFields处理下（频率范围：100–500 kHz，RMS：1.7 V/cm，培养箱温度：18 °C），A2780（即 人卵巢癌细胞；图2A）7和F-98（即 大鼠胶质瘤细胞；图2B）1的典型频率扫描结果，包括平均细胞数量（即 细胞数目）和克隆形成实验结果。结果显示，在所有施加的频率下，细胞数量均显著减少，且在所有测试的细胞系中，200 kHz时减少程度最大（经单因素方差分析与多重比较检验）。A2780和F98细胞克隆形成能力下降最显著的最优频率相同（图2B和图2C）。A2780和F98细胞在各频率下细胞数量与克隆形成效应之间的皮尔逊相关系数分别为0.967（p = 0.002）和0.755（p = 0.083）。

图3展示了OVCAR-3（即人卵巢癌细胞；图3A）和U-87 MG（即人胶质瘤细胞；图3B）细胞在不同强度（均方根值：1.7、1.3 和 1.0 V/cm，分别对应培养箱温度：18 °C、24 °C 和 28 °C）的双向TTFields处理下，平均细胞数的频率扫描结果。结果表明，尽管在1.3 V/cm TTFields（培养箱温度：24 °C）处理后，OVCAR-3细胞数量仍显著减少，但与1.7 V/cm（培养箱温度：18 °C）处理组相比，效应相对较小。U-87 MG细胞在1.0 V/cm TTFields（培养箱温度：28 °C）处理下也表现出与1.7 V/cm处理相似的细胞数量减少趋势，但在较低强度下该效应不显著。

锂离子电池组，8节电池配置，储能系统，用于功率分析的研究装置。
图1。TTFields培养皿安装在基板单元上，并连接至扁平TTFields控制电缆。 请点击此处查看此图的放大版本。

A2780 和 F98 的频率扫描图与克隆形成实验结果；细胞计数与频率的关系。
图 2．通过频率扫描确定 (A) A2780 和 (B) F98 细胞的最佳 TTFields 抑制频率。细胞经不同频率的 TTFields（1.7 V/cm，100–500 kHz）处理 72 小时。通过细胞计数和克隆形成实验评估 TTFields 处理的效果。箭头所示为最佳频率。结果表示每种测试频率至少 6 次重复的平均值 ± 标准差。（C）A2780 细胞在不同频率 TTFields 处理后克隆形成存活的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡图，细胞计数与频率关系，显示 OVCAR-3 和 U87-MG 细胞数据趋势。
图 3。确定 (A) OVCAR-3 和 (B) U-87 MG 细胞的最佳 TTFields 抑制频率的频率扫描。 细胞经不同频率（100–500 kHz）和强度（OVCAR-3：1.3 和 1.7 V/cm；U-87 MG：1.0 和 1.7 V/cm）的 TTFields 处理 72 小时。通过细胞计数评估 TTFields 处理的效果。箭头指示最佳频率。结果表示为每次测试频率下至少 6 次重复的平均值 ± 标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

培养箱环境温度预期的TTFields强度
(°C)(V/cm RMS)
181.62
191.55
201.48
211.41
221.33
231.26
241.19
251.12
261.04
270.97
280.9
290.83
300.76

表1. 孵育箱环境温度及TTFields培养皿内预期的TTFields强度。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TTFields 是一种新兴的抗肿瘤治疗方式，其原理是持续施加经过适当调谐的交变电场1,2,8,9,10,17最大化抗肿瘤疗效是所有治疗方式的理想目标。因此， "战斗" 每增加百分之一的癌细胞生长抑制率，都可能对患者的长期临床预后产生显著影响。这是由于肿瘤电场治疗（TTFields）需要持续应用，从而产生累积效应。提高TTFields的应用效果可通过多种方式实现：（1）增加电场强度1,7，（2）延长治疗时间5，（3）寻找与其他治疗方式最有效的联合方案18,19，以及（4）确定最佳频率1,2,4,6,7通过优化电极阵列在患者皮肤上的位置，可使肿瘤部位的电场强度达到最大，从而根据患者的个体解剖结构将最强电场精准递送至肿瘤区域20延长治疗时间主要依赖于患者的治疗依从性（每天至少18小时）。17与其他疗法找到合适的组合并确定最佳频率在很大程度上依赖于 体外 结果，因为目前尚无经过验证的TTFields治疗效果标志物。在本研究中，我们概述了利用TTFields确定癌细胞系最佳频率所需的实验步骤 体外 应用系统。此处描述的方法可能可用于筛选其他癌症治疗方式的组合（例如， 化疗药物或放疗）与TTFields联合使用，并确定每种特定联合治疗方案中TTFields应用的最佳频率。

与先前发表的研究一致，本文所示结果表明，治疗胶质瘤细胞和卵巢癌细胞的最佳频率为 200 kHz1,7在本研究中，我们首次证明了降低克隆形成潜能的最佳TTFields频率与产生最大细胞毒性效应的频率相关。本研究中用于量化TTFields效应的方法（即， 细胞毒性和克隆形成能力检测只是评估治疗效果的众多标准终点检测方法中的两种。其他治疗效果检测方法包括：（1）对细胞接种后的盖玻片进行固定、染色并封片，以便在显微镜下观察细胞内结构；（2）从施加肿瘤电场治疗（TTFields）的培养皿中直接提取蛋白质和RNA进行检测，或在将盖玻片转移至新的一次性培养皿后进行提取检测；（3）用胰蛋白酶消化已染色的细胞，用于流式细胞术分析。

仔细的实验设计将影响肿瘤电场治疗（TTFields）给药后的治疗效果。关键步骤包括确保整个实验过程中细胞增殖不会导致过度生长，并使用适当的电场强度，因为对敏感细胞系施加过高的强度可能导致细胞数量过少，无法完成所需的检测以确定最佳频率。相反，在敏感性较低的细胞系上施加过低强度的TTFields将产生微小效应，可能被固有的实验变异所掩盖。应检查治疗日志，获取每个培养皿在整个实验过程中有关温度稳定性、电流和电阻的宝贵信息。在治疗开始时更换有问题的培养皿，并剔除未达到理想治疗参数的培养皿数据，可最大限度地减少重复样本间的变异性。

总之，肿瘤治疗电场（TTFields）是一种新兴的抗癌治疗方式，已在临床环境中显示出疗效和安全性8,9,10。采用本文所述方案在体外（in vitro）条件下对TTFields进行测试，可能有助于优化临床治疗参数，并加深我们对TTFields作用机制的理解。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porat Yaara、Giladi Moshe、Schneiderman S. Rosa、Blat Roni、Shteingauz Anna、Zeevi Einav、Munster Mijal、Voloshin Tali、Kaynan Noa、Tal Orna 和 Kirson D. Eilon D 是以色列 Novocure 公司的带薪雇员。Weinberg Uri 是瑞士卢塞恩 Novocure GmbH 公司的带薪雇员。Yoram Palti 是美国纽约 Novocure 公司的股东。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
体外系统及软件NovocureITG1000 和 IBP1000每个单元包含1台TTFields发生器、1个基板、8个带盖的TTFields培养皿和1根扁平电缆。 
灭菌袋西菲尔德医疗24882
塑料盖玻片赛默飞世尔科技（NUNC）174977预处理并灭菌
玻璃盖玻片Thermo Scientific (Menzel-GläserCB00220RA1必要时进行灭菌
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基以色列 Biological Industries01-055-1A37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
RPMI 1640Gibco21875-03437℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
胎牛血清（FBS）以色列 Biological Industries04-007-1A37℃预热 °使用前将水浴预热至 C 水浴
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）Gibco25030-029
青霉素/链霉素（10,000 U/mL 青霉素，10,000 µg/mL 链霉素Gibco15140-122
100 mM 丙酮酸钠溶液 以色列 Biological Industries03-042-1B
Hepes缓冲液 1 M以色列 Biological Industries03-025-1B
牛胰岛素溶液Sigma-Aldrich10516-5ML
0.25% 胰蛋白酶/EDTA以色列 Biological Industries03-050-1B37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
甲醇默克1.06009.2511冷却至 -20 °使用前将 C 置于冷冻室冷冻
结晶紫Sigma-Aldrich120M1445有害。在25%甲醇和75%水的混合液中配制0.1% w/v结晶紫溶液。
温和去污剂Alcononx242985按说明书或用水配制5%的溶液。
PBS以色列 Biological Industries02-023-1A不含钙和镁
A2780ECACC93112519在添加了胎牛血清（10%）、青霉素-链霉素（100）的 RPMI 1640 培养基中培养 U/mL / 100 µg/mL)，丙酮酸钠（1 毫摩尔）和 HEPES 缓冲液（12 mM
F98ATCCCRL-2397在Dulbecco中培养’s 改良伊格尔’s 培养基中添加 FBS（10%）、青霉素/链霉素（100） U/mL / 100 µg/mL)，丙酮酸钠（1 毫摩尔）和谷氨酰胺（2 毫摩尔（mM）。
Ovcar-3ATCCHTB-161在添加了胎牛血清（20%）、青霉素/链霉素（100）的 RPMI 1640 培养基中培养 U/mL / 100 µg/mL)，丙酮酸钠（1 毫摩尔), HEPES缓冲液 (12 毫摩尔）和胰岛素（10 µg/mL
U-87 MGATCCHTB-14在杜尔贝科培养基中培养’s 改良伊格尔’s 培养基中添加 FBS（10%）、青霉素/链霉素（100） 单位/毫升 / 100 µg/mL）、丙酮酸钠（1 mM）和谷氨酰胺（2 mM
冷藏的 CO2 培养箱CARON7404-10-3
层流柜ADS LaminairBio12 和 VSM12

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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TTFields

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