Method Article

利用磁荧光纳米进行食源性致病菌筛选: 快速检测大肠杆菌O157:H7

DOI:

10.3791/55821

⸱

September 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Kansas Polymer Research Center, Pittsburg State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议的总体目标是通过磁性松弛和荧光发射方式的结合, 合成功能性纳米, 用于便携式、cost-effective 和快速检测特定靶向致病菌。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出大肠杆菌O157:H7 已与水和食源性疾病联系在一起, 尽管目前使用的食品和 water-screening 方法仍然存在威胁。虽然传统的细菌检测方法, 如聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 可以明确检测致病污染物, 他们需要广泛的样本准备和漫长的等待期。此外, 这些做法需要先进的实验室仪器和设置, 必须由训练有素的专业人员执行。在此, 提出了一种简单的诊断技术的协议, 其特点是磁性和荧光参数在纳米平台的独特组合。所提出的多磁荧光纳米 (MFnS) 可以检测到在小于1小时内, 在溶液中存在的1菌落形成单元的大肠杆菌O157:H7 污染。此外, 还证实了 MFnS 在诸如牛奶和湖水等复杂介质中保持高度功能的能力。另外的特异性化验也被用来证明 MFnS 只检测特定目标细菌的能力, 即使在存在类似的细菌种类的情况下。磁性和荧光模式的配对允许检测和定量的病原体污染在广泛的浓度, 表现出其在早期和晚期污染检测的高性能。MFnS 的有效性、可承受性和可移植性使他们成为点筛选各种环境中的细菌污染物的理想候选者, 从水生水库到商业包装食品。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在商业生产的食物和水源中, 细菌污染的持续发生, 已使人们对越来越快速和具体的诊断平台产生了需求。1,2一些更常见的细菌污染物是由沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特菌、弧菌、志贺氏杆菌和大肠杆菌引起的。3,4这些病原体的细菌污染通常会导致发烧、霍乱、肠胃炎和腹泻等症状。4水资源的污染往往对社区造成严重和不利的影响, 无法获得足够的过滤水, 食品污染导致大量疾病和产品召回努力。5,6

为了减少因细菌污染引起的疾病的发生, 已经作出了许多努力, 以制定方法, 在销售或消费之前, 可以有效地对水和食物进行扫描。3技术, 如 PCR、1、7、8、9、10 ELISA、11、12循环介导的等温放大 (灯),13,14 ,15,16,17,18,19,20,21, 22、23、24最近被用于检测各种病原体。与传统的细菌培养方法相比, 这些技术在特异性和时间方面更有效率。然而, 这些技术仍在与虚假的正面和负面、复杂的程序和成本斗争。1,3,25正是由于这个原因, 多磁荧光纳米 (MFnS) 被提出作为细菌检测的替代方法。

这些纳米独特的配对磁松弛和荧光模式, 允许双检测平台, 既快速又准确。使用大肠杆菌O157:H7 作为样品的污染物, MFnS 在几分钟内检测到 1 CFU 的能力被证实。病原体特异抗体用于增加特异性, 并且磁性和荧光方式的组合允许检测和定量细菌污染物在两个低 high-contamination 范围。16在细菌污染的情况下, 由于特定病原体抗体的靶向能力, 纳米将围绕细菌群。磁性纳米和细菌之间的结合限制了磁性铁芯与周围的水质子之间的相互作用。这会导致 T2 松弛时间的增加, 如磁 relaxometer 所记录的那样。随着溶液中细菌浓度的升高, 纳米随细菌数量的增加而分散, 导致 T2 值降低。反之, 由于纳米直接与病原体的数量增加, 荧光辐射与细菌浓度的比例会增加。离心的样品, 和分离的细菌颗粒, 将只保存纳米颗粒直接附着在细菌, 消除任何自由漂浮的纳米, 并直接关联的荧光辐射与数量溶液中存在细菌。此机制的示意图表示形式在图 1中表示。

这个 MFnS 平台已经设计了点的筛选, 导致低成本和便携的特点。MFnS 在室温下是稳定的, 只有在非常低的浓度下才能准确检测细菌污染物。此外, 在合成后, 使用 MFnS 是简单的, 不需要在实地使用训练有素的专业人员。最后, 这个诊断平台允许高度可定制的目标, 提供一种手段, 这一平台可以用来检测各种病原体, 在许多不同的设置。

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Protocol

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1.Synthesis 多参量磁荧光纳米 (MFnS) 的功能化.

  1. 合成顺氧化铁纳米粒子 (IONPs)
    1. 准备 IONP 合成, 准备以下3解决方案: 解决方案 1: FeCl 3 (0.70 g) 和 FeCl 2 在 H 2 O (2 毫升), 解决方案 2: NH 4 OH (2.0 毫升, 13.4 米) 在 h 2 O (15 毫升) 和解决方案 3: 聚丙烯酸 (0.855 g) 在 h 2 O (5 毫升)。
    2. 将90和 #181; 2 米盐酸 (HCl) 添加到溶液 1, 然后立即与溶液2混合, 而涡流在 875 rpm。然后添加解决方案3。继续涡流60分钟.
    3. 离心20分钟, 在 1620 x g. 离心机上清液20分钟, 在 2880 x g.
    4. 通过透析净化终末清液。将上清液添加到透析袋 (分子6和 #8722; 8 K), 并将其放在含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (pH = 7.4) 和自旋棒的烧杯中。让它浸泡12小时, 用新的缓冲器每2-3 小时更换一次.
  2. IONPs 的目标特定抗体与表面的共轭
    1. 准备以下四解决方案: 溶液 A: 5 毫克 1-乙基 3-(3-dimethylaminopropyl) 二盐酸盐 (氯甲酸) 250 和 #181; L MES [2-( N -吗) 磺酸] 缓冲液 (0.1 米, pH = 6.8), 溶液 B: 3 毫克 n-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 在250和 #181; MES 缓冲器 (0.1 米, ph 值 = 6.8), 溶液 C: 5 和 #181; IgG1, 大肠杆菌单克隆, 225 和 #181; 磷酸缓冲盐水 (PBS) (ph 7.4), 溶液 D: 4 毫升的 IONP (5.0 摩尔) 在1毫升 PBS (pH 7.4).
    2. 将 2-(N-吗) 磺酸 (MES) 缓冲区添加到解决方案 a 中, 然后在十五年代内立即将解决方案 a 添加到解决方案 D 中, 并在每次增加混合后反转解决方案.
    3. 立即开始在三分钟内将解决方案 B 添加到解决方案 D 的小增量中。在每次添加后通过反转解决方案进行混合.
    4. 将解决方案 C 添加到解决方案中, 增量为5和 #181; L, 在每增加混合后反转解决方案.
    5. 允许反应在室温下持续3小时, 然后在晚上4和 #176 继续孵化.
    6. 使用 PBS (pH = 7.4, 最终 [Fe] = 3.5 摩尔) 将产生的 Ab 共轭 IONPs 通过磁性柱净化, 以去除任何游离抗体。
      1. 用 PBS (1 毫升) 清洗磁性柱。将柱连接到磁板上, 并添加 IONP 溶液.
      2. 再用 PBS (1 毫升) 清洗磁性柱。从磁性板中取出磁性柱。将 PBS 添加到列中并收集解决方案。存储在4和 #176; C
  3. 封装荧光11和 #39;-Dioctadecyl-3,3,3 和 #39;, 3 和 #39;-Tetramethylindocarbocyanine 高氯酸盐 (DiI) 染料的聚丙烯酸 (临机) 涂层的抗体共轭 IONPs 使用溶剂扩散法。
    1. 到4毫升的 IONPs, 添加滴2.0 和 #181; DiI 染料 (2 摩尔) 在100和 #181 中的 l, 以连续混合在 1100 rpm 的亚砜 l.
    2. 透析结果解决方案 (分子 6-8 KDa, 12 h) 对抗 PBS, 创建最终的 MFnS 解决方案, 最终铁浓度为 [Fe] = 2 摩尔.
  4. 特性 MFnS
    1. 进行分光光度分析, 使用平板阅读器检测 595 nM 的封装 DiI 染料和荧光发射。
    2. 动态光散射
      1. 将 MFnS 溶液的样品放到 zetasizer 中, 以确定 MFnS 的平均尺寸和表面电荷.
        注意: 在这里, 功能 MFnS 的平均大小和表面电荷分别被发现为 77.09 nm 和-22.3 mV.

2。细菌培养和砧木溶液制备

  1. 细菌培养
    1. 水合 freeze-dried 颗粒 ( 大肠杆菌 O157:H7) 在1毫升的营养液中, 然后再加入5毫升的肉汤。
    2. 应用100和 #181; 此解决方案的 L 使用无菌接种循环, 然后在37和 #176 中孵化; C 为 24 h.
    3. 24 小时后, 从琼脂板中选择一个孤立的菌落, 并将其添加到15毫升的培养液中。在37和 #176 孵育, C 为4-6 小时, 同时监测光学密度值 (吸光度在 600 nm).
    4. 一旦获得0.1 的光学密度值, 停止培养, 并执行串行稀释.
  2. 串行稀释
    1. 添加900和 #181; L 营养液为八无菌离心管。
    2. 添加100和 #181; 细菌悬浮的 L 对第一个管子 (稀释 10 -1 ).
    3. 取100和 #181; L 从第一个管, 并添加它到第二个, 获得稀释 10 -2 。继续此模式的其余管, 最后稀释 10 -8 .
    4. 传输100和 #181; 从每个试管中分离琼脂板, 并在37和 #176 孵育24小时; C.
    5. 第二天, 计算每个板块上的菌落形成单位 (CFUs)。选择 100 CFUs 的板材。使用相应的稀释进行进一步的实验 (100 和 #181; L = ~ 100 CFUs).
      注意: 这里是 10 -6 稀释, 导致 100 CFUs.

3。利用 MFnS 快速检测大肠杆菌 O157:H7

  1. 使用各种 PBS 解决方案 (1X、pH 值7.4、300和 #181; L), 10 -6 细菌的数量增加, 导致 CFU 范围从1-100。在这些解决方案中添加一致的 MFnS (100 和 #181; L).
  2. 创建一个基线解决方案, 其中仅包含 PBS (1X、pH 7.4、300和 #181; l) 和 MFnS (100 和 #181; l).
  3. 在37和 #176 孵育溶液30分钟, 然后让它们冷却到室温.
  4. 将单个解决方案转移到磁 relaxometer (0.47 泰斯拉), 并在每个解决方案中的 CFUs 中记录弛豫时间 (T2) 的变化。
    1. 若要记录 T2 值的更改, 请首先测量包含 PBS 和 MFnS 的基线解决方案的 T2 值。
      1. 将解决方案和 #160 放置在磁性 relaxometer 中。打开相应的软件, 选择和 #34; T2 放松和 #34; 设置和按下 #34; 测量. #34;
    2. 在基线 T2 的集合之后, 测量附加解决方案的 T2 值, 这些解是用各种细菌的浓度.
      注: T2 的变化相当于从尖刺 T2 中减去的基线 T2.
  5. 从磁性 relaxometer 中取出样品, 并将试管离心 2880 x g, 10 分钟.
  6. 醒酒100和 #181 中的上清和重细菌颗粒; PBS (1X, pH 7.4).
  7. 添加80和 #181; 每个悬浮为96个井板, 记录荧光强度在 595 nM.
    注: 测试可以重复使用不同的溶剂, 包括湖泊水, 牛奶和其他如在结果部分所述

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Results

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MFnS 操作的机制在图 1中表示。细菌污染物表面周围 MFnS 的聚类干扰了 MFnS 和周围氢核的磁性核心之间的相互作用。由于这种聚类, 磁松弛值增加。随着细菌污染物浓度的增加, 聚类减少, T2 值的变化减小。因此, 增加一个荧光形态是至关重要的。随着细菌浓度的增加, MFnS 所产生的荧光信号的强度增加, 从而使得对低浓度和高浓缩范围内细菌污染物的敏感检测成为可以。

根据该协议, 在 PBS (1X、pH 7.4) 的溶液中合成并首次测试了16 MFnS。用于检测、磁弛豫的初始模态用于记录 T2 值的变化。根据该协议, 样品离心, 颗粒悬浮, 收集荧光数据。相应的ΔT2 和荧光发射值显示在图 2中。如图所示, ΔT2 值最大, 在较低浓度的细菌污染, 并达到饱和约 20 CFUs。另一方面, 荧光发射变得更加准确和 #62; 20 CFUs, 显示了结合这两种模式的重要性。在这些初步化验之后, 在复杂的介质中...

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Discussion

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本协议的设计目的是尽可能简单地生成完全功能的 MFnS。但是, 根据用户的最终目标, 更改协议可能有用的许多关键点。例如, 使用不同的抗体可以使许多其他病原体成为靶向。此外, 本议定书不限于使用抗体作为靶分子。任何对目标病原体有特定约束力的分子, 如宿主细胞受体, 也可用作靶分子。只要靶向分子有一个主要胺或酒精组, 或可以功能化有一个, 它可能被共轭到表面氧化铁纳米粒子根据该协议中所列的化学物质/NHS 共轭化学品。其次, 在每个检测解决方案中使用的 MFnS 量可能会有所不同。重要的是要使用足够的, 使基线溶液的 T2 值 (只含有溶剂和无目标病原体的纳米) 在100-250 毫秒的范围内. 如果基线值低于 100, 则 T2 值的更改将不太敏感, 因为纳米的过剩。若要提高基线 T2 值, 请减少解决方案中的纳米量。但是, 如果基线高于 250, 它就变得过于敏感, 而假阳性可能会变得更有可能。基于这些原因, 建议在100-250 毫秒之间为基线解决方案 T2 值。

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Disclosures

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这一纳米技术的示范应用尚未得到 FDA 的批准。

Acknowledgements

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这项工作是支持 INBRE P20GM103418, 堪萨斯大豆委员会 (肯尼迪航天公司/电源 1663), ACS 脉冲 56629-UNI7 和电源聚合物化学启动基金, 所有的 SS。我们感谢大学摄影师, Mr. 雅各 Anselmi, 为他出色的视频工作。我们还感谢 Mr. 罗杰 Heckert 和 Mrs. 卡塔奥义 Heckert 对研究的慷慨支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
四水合氯化亚铁Fisher ScientificI90-500
六水合氯化铁Fisher ScientificI88-500
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500
盐酸Fisher ScientificA144S-500
聚丙烯酸Sigma-Aldrich323667-100G
EDCThermofisher Scientific22980
NHSFisher ScientificAC157270250
抗大肠杆菌 O111 抗体 sera care5310-0352
抗大肠杆菌 O157：H7 抗体 [P3C6] Abcamab75244
DiI 染色Fisher ScientificD282
营养肉汤Difco233000
冻干大肠杆菌 O157：H7 颗粒ATCC700728
磁性松弛仪 Brukermq20
ZetasizerMalvernNANO-ZS90
读板机 TecanInfinite M200 PRO
磁柱 QuadroMACS130-090-976
离心机Eppendorf5804 系列
离心机 （accuSpin Micro 17）Fisher Scientific13-100-676
落地式振荡培养箱SHEL LABSSI5
分析天平Metler ToledoME104E
数字涡旋混合器Fisher Scientific02-215-370
露天摇床Fisher Scientific02-217-765
剂

References

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