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使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

DOI：

10.3791/55821

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2017年9月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Kansas Polymer Research Center, Pittsburg State University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肠出血性 大肠杆菌 O157:H7 与水源性和食源性疾病均有关联，尽管目前已有食品和水质筛查方法，但仍构成持续威胁。传统的细菌检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），虽可特异性地检测病原污染物，但需要复杂的样品前处理过程和较长的等待时间。此外，这些方法依赖精密的实验室仪器和环境，且必须由经过培训的专业人员操作。本文提出一种更为简便的诊断技术方案，该技术采用基于纳米颗粒平台的磁性和荧光参数的独特组合。所提出的多参数磁-荧光纳米传感器（MFnS）能够检测 E. coli O157:H7污染，即使溶液中仅含1个菌落形成单位，也可在不到1小时内被检测出。此外，已验证MFnS在牛奶和湖水等复杂介质中仍能保持高度功能活性。通过额外的特异性检测实验，进一步证明了MFnS即使在存在相似细菌物种的情况下，仍能特异性识别目标细菌。磁性与荧光两种模式的结合，使MFnS能够在宽浓度范围内实现对病原体污染的检测与定量，在早期和晚期污染检测中均表现出优异性能。MFnS具备高效性、低成本和便携性，使其成为适用于多种场景下细菌污染物现场筛查的理想选择，应用范围涵盖水体储库至商业包装食品。

引言

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商业生产的食品和水源中持续存在的细菌污染问题，促使人们需要开发越来越快速且特异的诊断平台。1,2 引起食品和水源污染的一些更常见的细菌污染物来自沙门氏菌属（Salmonella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、李斯特菌属（Listeria）、弧菌属（Vibrio）、志贺氏菌属（Shigella）、芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属（Escherichia）。3,4 这些病原菌引起的细菌污染通常导致发热、霍乱、胃肠炎和腹泻等症状。4 水源污染往往对无法获得充分过滤饮用水的社区造成严重且不利的影响，而食品污染已导致大量疾病发生以及大规模产品召回事件。5,6

为了降低由细菌污染引起的疾病发生率，人们已开展多项研究，致力于开发可在销售或食用前对水和食品进行高效检测的方法。3 近年来，聚合酶链式反应（PCR）1,7,8,9,10、酶联免疫吸附测定（ELISA）11,12、环介导等温扩增（LAMP）13,14 以及其他技术15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 已被用于多种病原体的检测。与传统的细菌培养方法相比，这些技术在特异性和检测时间方面具有显著优势。然而，这些方法仍存在假阳性与假阴性结果、操作流程复杂以及成本较高等问题。1,3,25 正是由于这些原因，多参数磁-荧光纳米传感器（MFnS）被提出作为细菌检测的一种替代方法。

这些纳米传感器独特地结合了磁弛豫和荧光两种模式，从而构建出一种兼具快速性与准确性的双模检测平台。利用 E. coli 以O157:H7作为示例污染物，展示了MFnS在数分钟内检测低至1 CFU的能力。采用病原体特异性抗体以提高特异性，磁性和荧光两种模式的结合使得能够在低污染和高污染范围内实现对细菌污染物的检测与定量。16 在发生细菌污染的情况下，由于病原体特异性抗体的靶向能力，纳米传感器将聚集于细菌周围。磁性纳米传感器与细菌的结合会限制其磁性铁核与周围水质子之间的相互作用，从而导致T2弛豫时间延长，该变化可由磁弛豫仪记录。随着溶液中细菌浓度的升高，纳米传感器随细菌数量增加而分散，导致T2值降低。相反，由于直接结合到病原体上的纳米传感器数量增多，荧光发射强度将与细菌浓度成比例增加。通过对样品进行离心并分离细菌沉淀，可仅保留直接附着于细菌上的纳米颗粒，去除游离的纳米传感器，从而使荧光发射强度与溶液中细菌数量直接相关。该机制的示意图如下所示 图1.

该MFnS平台的设计着眼于即时检测筛查，具有低成本和便携的特点。MFnS在室温下稳定，且仅需极低浓度即可准确检测细菌污染物。此外，合成后MFnS的使用过程简便，无需现场依赖受过专业训练的技术人员。最后，该诊断平台具有高度可定制的靶向能力，使得这一平台可在多种不同场景下用于检测各类病原体。

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方案

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1. 多参数磁-荧光纳米传感器（MFnS）的合成与功能化。

  1. 超顺磁性氧化铁纳米颗粒（IONPs）的合成
    1. 为准备IONP的合成，配制以下3种溶液：溶液1：FeCl3（0.70 g）和FeCl2溶于H2O（2 mL）中，溶液2：NH4OH（2.0 mL，13.4 M）溶于H2O（15 mL）中，溶液3：聚丙烯酸（0.855 g）溶于H2O（5 mL）中。
    2. 向溶液1中加入90 µL的2 M盐酸（HCl），然后立即在875 rpm转速下涡旋混合的同时与溶液2混合。随后加入溶液3，继续涡旋60分钟。
    3. 在1,620 × g条件下离心20分钟。将上清液在2,880 × g条件下再次离心20分钟。
    4. 通过透析纯化最终上清液。将上清液加入透析袋（截留分子量6–8 K）中，并将其置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）（pH = 7.4）和搅拌子的烧杯中。浸泡12小时，每2–3小时更换一次新鲜缓冲液。
  2. 将靶向特异性抗体偶联至IONPs表面
    1. 配制以下四种溶液：溶液A：5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于250 µL MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸]缓冲液（0.1 M，pH = 6.8）中，溶液B：3 mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于250 µL MES缓冲液（0.1 M，pH = 6.8）中，溶液C：5 µg的IgG1（大肠杆菌单克隆抗体）溶于225 µL磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）中，溶液D：4 mL的IONP（5.0 mmol）溶于1 mL PBS（pH 7.4）中。
    2. 向溶液A中加入2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液，然后在15秒内将溶液A分小份迅速加入溶液D中，每次加入后翻转混匀。
    3. 立即在三分钟内将溶液B分小份加入溶液D中，每次加入后翻转混匀。
    4. 将溶液C以每份5 µL的增量加入反应体系中，每次加入后翻转混匀。
    5. 室温下继续反应3小时，随后在4 °C下过夜孵育。
    6. 使用磁性柱并通过PBS（pH = 7.4，最终[Fe] = 3.5 mmol）纯化所得的抗体偶联IONPs，以去除未偶联的抗体。
      1. 用PBS（1 mL）洗涤磁性柱。将柱子固定在磁力架上，然后加入IONP溶液。
      2. 再次用PBS（1 mL）洗涤磁性柱。将柱子从磁力架上取下，向柱中加入PBS并收集洗脱液。于4 °C保存。
  3. 采用溶剂扩散法将荧光染料1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）包封入抗体偶联IONPs的聚丙烯酸（PAA）涂层中。
    1. 在持续1100 rpm搅拌下，将2.0 µL DiI染料（2 mmol）溶于100 µL DMSO中，逐滴加入4 mL IONP溶液中。
    2. 将所得溶液进行透析（截留分子量6–8 KDa，12小时），使用PBS缓冲液，最终获得铁浓度为[Fe] = 2 mmol的MFnS溶液。
  4. MFnS的表征
    1. 进行分光光度分析时，使用酶标仪检测包封的DiI染料，其荧光发射波长为595 nM。
    2. 动态光散射
      1. 将MFnS溶液样品放入Zetasizer中，测定MFnS的平均粒径和表面电荷。
        注：此处测得功能化MFnS的平均粒径为77.09 nm，表面电荷为-22.3 mV。

2. 细菌培养与储备液制备

  1. 细菌培养
    1. 将冻干菌粒（E. coli O157:H7）用 1 mL 营养肉汤溶解，再加入 5 mL 肉汤。
    2. 取 100 µL 该溶液接种于琼脂平板，使用无菌接种环划线，随后在 37 °C 下培养 24 小时。
    3. 24 小时后，从琼脂平板上挑取单个孤立菌落，接种至 15 mL 培养肉汤中，在 37 °C 下培养 4–6 小时，并监测其光密度值（600 nm 处吸光度）。
    4. 当光密度值达到 0.1 时，停止培养，并进行系列稀释。
  2. 系列稀释
    1. 向八个无菌微量离心管中各加入 900 µL 营养肉汤。
    2. 取 100 µL 菌悬液加入第一管（稀释度为 10-1）。
    3. 从第一管中取 100 µL 加入第二管，获得 10-2 稀释度。依此类推，直至最后一管，最终稀释度为 10-8。
    4. 从每管中各取 100 µL 分别接种至不同的琼脂平板，于 37 °C 培养 24 小时。
    5. 次日，计数各平板上的菌落形成单位（CFU）。选择含有约 100 个 CFU 的平板，使用对应的稀释度进行后续实验（100 µL ≈ 100 CFU）。
      注意：本实验中，10-6 稀释度的平板产生了约 100 个 CFU。

3. 使用MFnS快速检测大肠杆菌O157:H7

  1. 向不同体积的 PBS 溶液（1X，pH 7.4，300 µL）中加入逐渐增加量的 10-6 细菌原液，使菌落数（CFU）范围为 1–100。向这些溶液中加入等量的 MFnS（100 µL）。
  2. 制备一份仅含 PBS（1X，pH 7.4，300 µL）和 MFnS（100 µL）的空白对照溶液。
  3. 将上述溶液在 37 °C 下孵育 30 分钟，随后冷却至室温。
  4. 将各溶液分别转移至磁弛豫仪（0.47 特斯拉）中，记录各溶液中 T2 弛豫时间相对于 CFU 的变化。
    1. 为记录 T2 值的变化，首先测量仅含 PBS 和 MFnS 的空白对照溶液的 T2 值。
      1. 将溶液 放入磁弛豫仪中。打开相应软件，选择"T2 弛豫"设置，然后点击"测量"。
    2. 在获取空白对照的 T2 值后，测量加入不同浓度细菌的其他溶液的 T2 值。
      注意：T2 的变化值等于加菌溶液的 T2 值减去空白对照的 T2 值。
  5. 从磁弛豫仪中取出样品，将离心管在 2880 × g 条件下离心 10 分钟。
  6. 弃去上清液，并将细菌沉淀用 100 µL PBS（1X，pH 7.4）重悬。
  7. 将每种重悬液取 80 µL 加入 96 孔板中，在 595 nM 处测定荧光强度。
    注意：可按照结果部分所述，使用不同溶剂（包括湖水、牛奶等）重复测试

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结果

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MFnS的作用机制如图1所示。MFnS在细菌污染物表面聚集，会干扰MFnS磁性核心与周围氢核之间的相互作用，从而导致磁弛豫值升高。随着细菌污染物浓度的增加，聚集现象减少，T2值的变化也随之降低。因此，引入荧光模态至关重要。随着细菌浓度的升高，MFnS产生的荧光信号强度增强，从而可在低浓度和高浓度范围内灵敏地检测细菌污染物。

按照方案16，合成了MFnS并首先在PBS溶液（1×，pH 7.4）中进行测试。用于检测的初始模式为磁弛豫，用于记录T2值的变化。根据方案，随后对样品进行离心，沉淀重新悬浮，并收集荧光数据。相应的ΔT2和荧光发射值如图2所示。如图所示，ΔT2值在细菌污染浓度较低时最大，并在约20 CFUs时达到饱和。而荧光发射在>20 CFUs时变得更加准确，显示出结合这两种检测模式的重要性。在完成初步检测后，还在复杂介质（包括湖水和牛奶）中进行了类似的测试，以确保纳米传感器在更复杂的介质中仍然有效。这些检...

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讨论

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本方案旨在以尽可能简单的方式制备功能完整的磁性荧光纳米传感器（MFnS）。然而，根据使用者的最终目标，可在多个关键步骤对方案进行适当调整。例如，使用不同的抗体可实现对多种其他病原体的靶向检测。此外，本方案并不仅限于使用抗体作为靶向分子，任何对目标病原体具有特异性结合亲和力的分子（如宿主细胞受体）均可作为靶向分子使用。只要靶向分子含有伯胺基或羟基，或可通过化学修饰引入此类基团，即可依据本方案中列出的EDC/NHS偶联化学方法将其共价连接至氧化铁纳米颗粒表面。其次，每次检测溶液中使用的MFnS用量可进行调整。应确保所用剂量使基线溶液（仅含溶剂和纳米传感器，不含目标病原体）的T2值处于100–250 ms范围内。若基线T2值低于100 ms，则由于纳米传感器过量，T2值的变化将变得不够敏感；此时可通过减少溶液中纳米传感器的用量来提高基线T2值。反之，若基线T2值高于250 ms，则系统将过于敏感，可能导致假阳性结果的发生率增加。因此，建议将基线溶液的T2值控制在100–250 ms之间。

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披露

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目前，该纳米技术的示范应用尚未获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。

致谢

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本研究由K-INBRE P20GM103418、堪萨斯大豆委员会（KSC/PSU 1663）、美国化学会石油研究基金（ACS PRF 56629-UNI7）以及匹兹堡州立大学高分子化学启动基金资助，以上项目均由SS负责。我们感谢大学视频制作人Jacob Anselmi先生在视频制作方面的出色工作。同时感谢Roger Heckert先生和Katha Heckert女士对科研工作的慷慨支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
四水合氯化亚铁Fisher ScientificI90-500
六水合氯化铁Fisher ScientificI88-500
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500
盐酸Fisher ScientificA144S-500
聚丙烯酸Sigma-Aldrich323667-100G
EDCThermofisher Scientific22980
NHSFisher ScientificAC157270250
抗大肠杆菌 O111 抗体 sera care5310-0352
抗大肠杆菌 O157:H7 抗体 [P3C6] Abcamab75244
DiI 染料Fisher ScientificD282
营养肉汤Difco233000
冻干大肠杆菌 O157:H7 菌粒ATCC700728
磁弛豫仪 Brukermq20
Zetasizer 粒径电位仪MalvernNANO-ZS90
酶标仪 TecanInfinite M200 PRO
磁性分离柱 QuadroMACS130-090-976
离心机Eppendorf5804 Series
离心机（accuSpin Micro 17）Fisher Scientific13-100-676
台式振荡培养箱SHEL LABSSI5
分析天平Metler ToledoME104E
数字涡旋混合器Fisher Scientific02-215-370
开放式摇床Fisher Scientific02-217-765

参考文献

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O157 H7 Zetasizer

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