方法文章

在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径爪蟾胚胎发育

DOI：

10.3791/55823

⸱

2017年6月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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该协议描述了在细胞分化和非洲爪蟾胚胎发育过程中调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性的光遗传策略。这种方法允许哺乳动物细胞培养物和多细胞活生物体如非洲爪蟾胚胎中具有高空间和时间分辨率的可逆激活MAPK信号通路。

摘要

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激酶活性对于多种细胞功能至关重要，包括细胞增殖，分化，迁移和细胞凋亡。在早期胚胎发育过程中，激酶活性在胚胎中是高度动态和广泛的。药理学和遗传学方法通常用于探索激酶活性。不幸的是，使用这些策略来实现优越的空间和时间分辨率是很困难的。此外，在活细胞和多细胞生物体中以可逆的方式控制激酶活性是不可行的。这种限制仍然是在开发和分化期间实现对激酶活性的定量了解的瓶颈。这项工作提出了利用含有可光活化蛋白拟南芥隐色素2（CRY2）和密码子相互作用的基质 - 螺旋 - 环 - 螺旋（CIBN）的N-末端结构域的双顺反子系统的光遗传策略。黑白棋有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路的活化可以通过活细胞中的光介导的蛋白质易位实现。这种方法可以应用于哺乳动物细胞培养物和活的脊椎动物胚胎。这种双顺反子系统可以被推广以控制具有相似活化机制的其它激酶的活性并且可以应用于其它模型系统。

引言

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生长因子参与广泛的细胞功能，包括增殖，分化，迁移和凋亡，并在许多生物学事件中发挥关键作用，包括胚胎发育，衰老和精神状态调节1,2,3,4 ， 5 。许多生长因子通过复杂的细胞内信号传导级联信号。这些信号事件通常以精确调节的方式可逆蛋白磷酸化操作6,7 。因此，对蛋白激酶的信号转导结果的理解，它们负责蛋白质磷酸化，这是非常重要的。

不同的生长因子通过相当普遍的细胞内信号网络起作用，即使它们刺激dist细胞反应8,9 。受体酪氨酸激酶的常见细胞内介质包括Ras，Raf，细胞外信号调节激酶（ERK），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ ERK激酶（MEK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K），Akt和磷脂酶Cγ （PLCγ） 10,11 。积累的证据表明信号多样性和特异性取决于信号传导活动的空间和时间调节12 。例如，在大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）中，导致细胞增殖的表皮生长因子（EGF）刺激瞬时激活ERK通路9 。另一方面，导致细胞分化的神经生长因子（NGF）的刺激以持续的方式激活ERK通路9,13。在培养的r在海马神经元中，脑源性神经....

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方案

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动物研究是按照伊利诺斯机构动物保护和使用委员会（IACUC）和伊利诺伊州动物资源大学（DAR）制定的指导方针进行的。

蛋白定位在BHK21哺乳动物细胞培养中的光学诱导

注意:步骤1.1-1.3提供了一种组装细胞培养室，用于通常具有较短工作距离的高倍率物镜（ 例如， 63X或100X）进行成像的方法。这些目标需要薄玻璃盖玻片（ 例如， ＃1.5,170μm厚度）作为成像基底。或者，可以使用玻璃底细胞培养皿/载玻片。在这种情况下，可以跳过步骤1.1-1.3。

  1. 清洁玻璃盖玻片
    1. 将30个玻璃盖玻片放在盖玻片夹中。
    2. 在600 mL塑料烧杯中加入20 g洗涤剂和400 mL温水自来水。的Plac将烧杯放在磁力搅拌器上并搅拌直到所有洗涤剂溶解。用棉纸去除泡沫。
    3. 使用100 mm x 15 mm培养皿的底部作为搅拌棒的间隔物，并作为盖玻片支架的表面。为了在清洁过程中保持足够的流动，在培养皿中排放3-4个孔。
    4. 为了做出排水孔，加热烙铁，并在排气罩中燃烧塑料。
      小心:请勿用双手触摸加热的烙铁。
    5. 将盖玻片夹放置在烧杯中的培养皿上。在室温下搅拌2小时至过夜。
    6. 在1000 mL烧杯中用500 mL去离子水洗涤三次。可以重新使用洗涤剂溶液。

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结果

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可光活化蛋白质对的比例表达: 图1A显示了基于猪teschovirum的双顺反子基因构建体CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（称为CRY2-2A-2CIBN）的设计， 112A（P2A）肽，其在哺乳动物细胞系42中显示出最高的核糖体跳跃效率。在以前的工作中，已经确定CIBN-GFP-CaaX:CRY2-mCherry-Raf1的最佳比例为2:135。该配置允许CRY2-mCherry-Raf1的足够的膜募集和活化（ 图1B ）。用CRY2-2A-2CIBN单独转染的细胞在外显子照射（ 图1C ）或共聚焦显微镜（ 图1D ）下都显示GFP和Txred荧光通道中的清晰荧光。蓝光介导的membra在共焦显微镜下可以清楚地检测到CRY2-mCherry.......

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讨论

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建造灯箱时，应测量各个LED的功率。根据以前的经验，由于制造差异，功率输出可能因个别LED而异。选择一组功率输出在10％以内的LED。可以针对不同类型的细胞培养容器（ 例如 6孔或24孔板）修改LED的数量，限流电阻和功率输入。功率为0.2mW / cm 2的 24小时的光照不会引起可检测的光毒性44 。如果使用更高的功率，请考虑使用间歇光来减少发热和光毒性。在本方案中引入的光生系统在间歇光刺激下诱导PC12细胞中的神经突生长，与连续光刺激相当，因为两个相邻光脉冲之间的暗区间小于45分钟44 。应有对于蛋白质缔合和解离的动力学的固有差异，必须针对每个独特的蛋白质对调整光脉冲之间的持续时间。细胞溶质Raf1的过度表达不引起PC12细胞分化而没有蓝光照射。通过控制注射到每个胚胎中的mRNA的量，在黑暗中没有观察到显着的胚胎表型。

虽然低功率蓝光足以刺激CRY2-和CIBN-融合蛋白的结合，但是蓝光的不良穿透深度限制了其在深层组织刺激中的应用。尽管通过经.......

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披露

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作者宣称他们没有竞争的经济利益。

致谢

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这项工作得到伊利诺伊大学厄瓜多尔香槟分校（UIUC）和美国国立卫生研究院（NIGMS R01GM111816）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃盖玻片 VWR48393 230活细胞成像底
物盖玻片架 Newcomer Supply6817B盖玻
片洗涤剂支架 ThermoFisher16 000 104用于清洁盖玻片
硼酸 Sigma-AldrichB6768-500G用于制造PLL缓冲液
四硼酸二钠Sigma-Aldrich71996-250G用于制造 PLL 缓冲液
塑料烧杯Nalgene1201-1000用于清洁盖玻片
氢氧化钠 Sigma-Aldrich221465-2.5KG用于调节pH
值 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP1274-500MG用于涂层盖玻片
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水ThermoFisher Scientific750024用于DNA制备
盖玻片 镊子Ted Pella5645盖玻片处理
组织切片皿Thermofisher12565321细胞培养皿
无菌离心管ThermoFisher12-565-271缓冲液储存
转染试剂ThermoFisherR0534转染
CO2 非依赖性培养基ThermoFisher18045088用于活细胞成像
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）Ellsworth Adhesives184 SILELAST KIT 0.5KG形成细胞腔室
质粒大提试剂盒Qiagen12965质粒制备
DMEM 培养基ThermoFisher11965-084细胞培养培养基成分
F12K 培养基ThermoFisher21127022细胞培养培养基成分
马血清ThermoFisher16050122细胞培养培养基成分
胎牛血清Signa-Aldrich12303C-500 mL细胞培养培养基成分
青霉素-链霉素-谷氨酰胺ThermoFisher10378016细胞培养培养基成分
胰蛋白酶 （0.25%）、酚红ThermoFisher Scientific15050065 用于哺乳动物细胞解离
琼脂糖Fisher ScientificBP1356-100用于 DNA 制备
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02用于胚胎缓冲液
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物Sigma-Aldrich1.02839.0025卵母细胞制备
ApaIThermoFisherFD1414用于质粒
Dnase IThermoFisherAM2222用于在 体外 转录测定中去除 DNA 模板
索引匹配材料（浸油）ThorlabsMOIL-20LN用于匹配样品基板和物镜之间的索引
蓝色 LEDAdafruit301用于光遗传学刺激的光源
电阻器套件AmazonEPC-103限流电阻器
铝箱BUD IndustriesAC-401灯箱 
面包板Jekewin837654333686用于制作 LED 阵列
连接线Electronix Express27WK22SLD25用于制作 LED 阵列
继电器模块JbtekSRD-05VDC-SL-C用于间歇性光控制
直流电源 TMS直流电源-LW-（PS-305D）LED
硅电源 电源 头部ThorlabsS121C用于光强测量
功率计ThorlabsPM100D 用于光强度测量
显微镜Leica BiosystemsDMI8用于活细胞成像
生物安全柜ThermoFisher1300 Series A2用于哺乳动物细胞处理
CO2 培养箱ThermoFisherIsotemp用于哺乳动物细胞培养
体视显微镜LeicaM60用于胚胎显微作
显微注射器NarishigeIM300用于胚胎显微注射
微量移液器拉拔器Sutter InstrumentsP87拔针器
体外 转录试剂盒ThermoFisherAM1340用于 体外 转录。该试剂盒包括无核酸酶水、SP6 RNA 聚合酶、核糖核苷酸混合物、帽类似物、胆酸锂沉淀溶液和离心柱  
RNA 纯化试剂盒Qiagen74104硅胶膜离心柱，用于纯化合成的 RNA 
对流烘箱MTI 公司 EQ-DHG-9015PDMS 固化
离心混合器和特氟龙容器THINKYAR310用于混合 PDMS
硅片UniversityWafer452用于制造 PDMS 的底座  设备
刀片Techni Edge01-801用于切割 PDMS
毛细管玻璃萨特仪器BF100-58-10用于制造注射针。nbsp;
的线性化

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 39....

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CRY2 CIBN LED

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