光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

摘要

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。

摘要

激酶活性对于多种细胞功能至关重要，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。在早期胚胎发育过程中，激酶活性在整个胚胎中呈现高度动态且广泛分布的特征。目前通常采用药理学和遗传学方法来研究激酶活性。然而，这些策略难以实现优异的空间和时间分辨率。此外，在活细胞和多细胞生物体中以可逆方式调控激酶活性尚不可行。这一局限性仍是深入定量理解发育与分化过程中激酶活性的主要瓶颈。本研究介绍了一种光遗传学策略，利用包含光可激活蛋白拟南芥（Arabidopsis thaliana）隐花色素2（CRY2）和隐花色素相互作用碱性-螺旋-环-螺旋蛋白N端结构域（CIBN）的双顺反子系统，通过光介导的蛋白质转位在活细胞中实现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的可逆激活。该方法可应用于哺乳动物细胞培养体系以及活体脊椎动物胚胎。该双顺反子系统具有普适性，可用于调控其他具有类似激活机制的激酶活性，并适用于其他模式系统。

引言

生长因子参与多种细胞功能，包括增殖、分化、迁移和凋亡，在许多生物学过程中发挥关键作用，如胚胎发育、衰老以及精神状态的调节^1,2,3,4,5。许多生长因子通过复杂的细胞内信号级联进行信号传导。这些信号事件通常以精确调控的方式通过可逆的蛋白质磷酸化来实现^6,7。因此，理解负责蛋白质磷酸化的蛋白激酶的信号转导结果具有根本性的重要意义。

不同的生长因子通过相当相似的细胞内信号通路发挥作用，尽管它们能够刺激不同的细胞反应^8,9。受体酪氨酸激酶常见的细胞内信号分子包括Ras、Raf、细胞外信号调节激酶（ERK）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK激酶（MEK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Akt以及磷脂酶Cγ（PLCγ）^10,

方案

动物实验遵循伊利诺伊大学动物护理与使用委员会（IACUC）和伊利诺伊大学动物资源部（DAR）制定的指南进行。

1. 在 BHK21 哺乳动物细胞培养中通过光遗传学诱导蛋白质定位

注意：步骤 1.1–1.3 提供了一种组装用于高倍物镜成像的细胞培养腔室的方法（例如， 63倍或100倍），这些物镜通常工作距离较短。此类物镜需要使用薄玻璃盖玻片（例如， #1.5, 170 µm 厚度）作为成像基底。或者，也可使用玻璃底细胞培养皿/载玻片，此时可省略步骤1.1–1.3。

1. 清洗玻璃盖玻片
   1. 将30片玻璃盖玻片放入盖玻片架中。
   2. 在600 mL塑料烧杯中加入20 g洗涤剂和400 mL温自来水。将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至洗涤剂完全溶解。用纸巾去除泡沫。
   3. 使用一个100 mm × 15 mm培养皿的底部作为隔离搅拌子的垫片，并作为盖玻片架的支撑面。为在清洗过程中保持足够的液体流动，在培养皿底部打3–4个排水孔。
   4. 为打排水孔，加热电烙铁并在通风橱中烧穿塑料。
      警告：切勿用手直接接触加热的电烙铁。
   5. 将盖玻片架置于培养皿上并放入烧杯中。在室温下搅拌2小时至过夜。
   6. 在1,000 mL烧杯中用500 mL去离....

结果

光可激活蛋白对的比率表达：图1A展示了基于猪捷申病毒-1的2A（P2A）肽（其在哺乳动物细胞系中具有最高的核糖体跳跃效率⁴²）构建的双顺反子光遗传学结构CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（简称为CRY2-2A-2CIBN）。在先前的研究中已确定，CIBN-GFP-CaaX与CRY2-mCherry-Raf1的最佳比例为2:1³⁵。该构型可实现CRY2-mCherry-Raf1在细胞膜上的充分募集和激活（图1B）。单独转染CRY2-2A-2CIBN的细胞在GFP和Txred荧光通道中均表现出明显的荧光信号，无论是在落射照明下（图1C）还是共聚焦显微镜下（图1D）。蓝光介导的CRY2-mCherry-.......

讨论

在搭建光源箱时，应测量单个LED的功率。根据以往经验，由于制造差异，不同LED之间的输出功率可能存在差异。应选择输出功率相互之间差异在10%以内的LED组合。可根据不同类型的细胞培养容器，调整LED数量、限流电阻和输入功率。例如， 6孔或24孔板）。以0.2 mW/cm²的功率进行24小时光照。² 不会引起可检测到的光毒性⁴⁴如果使用较高功率，可考虑采用间歇性光照以减少热量产生和光毒性。本方案中介绍的光遗传学系统在间歇性光照刺激下可诱导PC12细胞 neurite 出芽，其效果与连续光照刺激相当，前提是相邻两次光照之间的暗期间隔小于45分钟。⁴⁴由于蛋白质结合与解离动力学存在内在差异，不同蛋白质对之间的光脉冲间隔时间需进行针对性优化。在无蓝光照射条件下，细胞质Raf1的过表达不会引起PC12细胞分化。通过控制每个胚胎中注射的mRNA量，在黑暗条件下未观察到明显的胚胎表型。

尽管低功率蓝光足以刺激CRY2与CIBN融合蛋白的结合，但蓝光穿透深度较差，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃盖玻片	VWR	48393 230	活细胞成像用底物
盖玻片架	Newcomer Supply	6817B	盖玻片固定架
去垢剂	赛默飞世尔科技	16 000 104	用于清洗盖玻片
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768-500G	用于配制PLL缓冲液
四硼酸钠	Sigma-Aldrich	71996-250G	用于制备  PLL缓冲液
塑料烧杯	Nalgene	1201-1000	用于清洗盖玻片
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465-2.5KG	调节pH值
聚-L-赖氨酸氢溴化物	Sigma-Aldrich	P1274-500MG	用于包被盖玻片
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水	赛默飞世尔科技	750024	用于DNA制备
盖玻片镊子	Ted Pella	5645	盖玻片操作
组织培养皿	Thermofisher	12565321	细胞培养皿
无菌离心管	ThermoFisher	12-565-271	缓冲液储存
转染试剂	ThermoFisher	R0534	转染
CO2无血清培养基	ThermoFisher	18045088	用于活细胞成像
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	埃尔斯沃思粘合剂	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	制作细胞培养小室
质粒大量提取试剂盒	Qiagen	12965	质粒制备
DMEM 培养基	赛默飞世尔科技	11965-084	细胞培养基成分
F12K 培养基	赛默飞世尔科技	21127022	细胞培养基成分
马血清	赛默飞世尔科技	16050122	细胞培养基成分
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12303C-500 mL	细胞培养基成分
青霉素-链霉素-谷氨酰胺	ThermoFisher	10378016	细胞培养基成分
胰蛋白酶（0.25%），酚红	赛默飞世尔科技	15050065	用于哺乳动物细胞解离
琼脂糖	Fisher Scientific	BP1356-100	用于DNA制备
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	用于胚胎缓冲液
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物	Sigma-Aldrich	1.02839.0025	卵母细胞准备
ApaI	ThermoFisher	FD1414	质粒线性化
Dnase I	ThermoFisher	AM2222	去除反应中的DNA模板 体外 转录实验
折射率匹配材料（浸油）	Thorlabs	MOIL-20LN	为匹配样品基底与物镜的折射率
蓝光LED	Adafruit	301	光遗传学刺激光源
电阻器套件	亚马逊	EPC-103	限流电阻器
铝盒	BUD Industries	AC-401	光源箱
面包板	Jekewin	837654333686	用于制作LED阵列
连接导线	Electronix Express	27WK22SLD25	用于制作LED阵列
继电器模块	Jbtek	SRD-05VDC-SL-C	用于间歇性光照控制
直流电源	经颅磁刺激	直流电源-LW-(PS-305D)	LED电源
硅 功率 头部	Thorlabs	S121C	用于光强度测量
功率计	Thorlabs	PM100D	用于光强度测量
显微镜	Leica Biosystems	DMI8	用于活细胞成像
生物安全柜	赛默飞世尔科技	1300 系列 A2	用于哺乳动物细胞操作
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	Isotemp	用于哺乳动物细胞培养
体视显微镜	Leica	M60	用于胚胎显微操作
显微注射仪	Narishige	IM300	用于胚胎显微注射
微移液管拉制仪	Sutter Instruments	P87	针头拉拔器
体外 转录试剂盒	赛默飞世尔科技	AM1340	对于 体外 转录。该试剂盒包含无核酸酶水、SP6 RNA  聚合酶、核糖核苷酸混合物、帽类似物、氯化锂沉淀溶液和离心柱
RNA纯化试剂盒	Qiagen	74104	用于纯化合成RNA的硅胶膜旋转柱
对流烘箱	MTI 公司	EQ-DHG-9015	PDMS 固化
离心混合器和聚四氟乙烯容器	THINKY	AR310	用于混合PDMS
硅片	UniversityWafer	452	制作PDMS的基础材料  设备
刀片	技术边缘	01-801	用于切割PDMS
毛细玻璃管	Sutter Instruments	BF100-58-10	用于注射针头的制备。