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方法文章

前庭神经鞘瘤研究的统一方法学框架

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DOI：

10.3791/55827

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2017年6月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是概述用于前庭神经鞘瘤和施万细胞研究中多种下游应用的人类手术样本的采集与处理流程。

摘要

前庭神经鞘瘤是桥小脑角区最常见的肿瘤，占所有颅内肿瘤的6%-8%。尽管这些肿瘤可导致高达95%的患者出现感音神经性听力损失，但其听力损失的分子机制仍不明确。本文介绍了我们实验室建立的一系列步骤，旨在促进各种原代人体组织样本的采集与处理，以支持前庭神经鞘瘤研究中的后续科研应用。具体而言，本文描述了一种统一的方法学框架，用于从手术标本中采集、处理和培养施万细胞及神经鞘瘤细胞。该框架还整合了当前研究中被认为必不可少的并行处理步骤：肿瘤和神经分泌物的收集、采集组织中RNA的保存和蛋白质的提取、组织固定以制备切片，以及将原代人源细胞暴露于腺相关病毒，以应用于基因治疗。此外，本文强调经迷路入路手术切除该肿瘤的独特优势，即可同时获取人耳内耳的感觉上皮组织和外淋巴液。文中还提供了提高实验质量的建议，并指出了常见的技术难点。

引言

前庭神经鞘瘤（VS）是桥小脑角区最常见的肿瘤，每10万人中即有1人被诊断出患有此病。尽管该肿瘤不发生转移，但会严重影响患者的生活质量1,2,3,4,5,6。患者通常伴有听力丧失、耳鸣以及耳部胀满感。随着肿瘤的生长，症状逐渐加重，导致平衡障碍、面瘫以及其他脑神经功能受损。由于肿瘤压迫脑干，还可能引发危及生命的并发症7。

前庭神经鞘瘤（VS）的治疗选择主要包括对静止性肿瘤采取观察等待，对生长性肿瘤则采用立体定向放射治疗或手术切除8。在有研究背景的医院中进行此类肿瘤的手术切除，为获取和分析患者手术期间采集的新鲜肿瘤组织提供了机会。其中一种特定的VS手术方式——经迷路切除术，甚至可获得来自内耳的宝贵的人类感觉上皮组织及外淋巴液。

因为前庭神经鞘瘤起源于外周感觉神经（即， 前庭神经），将前庭神经鞘瘤相关观察结果与适当的对照神经（如人耳大神经，GAN）进行比较至关重要。健康的 GAN 常在腮腺切除术或颈部解剖术中被常规切除，可作为研究健康施万细胞生理学的可靠模型。9.

由于目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗或预防散发性前庭神经鞘瘤（VS）的药物，研究人员亟需阐明该疾病的分子机制，以确定潜在的治疗靶点。已发现参与VS发病机制的蛋白质包括merlin、血管内皮生长因子（VEGF）、环氧化酶2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-alpha）、表皮生长因子受体（EGFR）及相关信号分子10,11,12,13,14,15,16,17。

近期进展已拓展并优化了原代人源前庭神经鞘瘤及健康神经组织的采集、处理、培养和后续研究方案18,19然而，大多数现有的实验方案旨在为单一的下游研究应用准备此类组织即， 单独进行细胞培养）。本文介绍了一种统一的方法学框架，可用于对单一人源性前庭神经鞘瘤（VS）或耳蜗神经节（GAN）样本同时进行多种下游应用的处理：细胞类型特异性培养、蛋白质提取、RNA保存、肿瘤分泌物收集以及组织固定。本研究还详细描述了经迷路入路切除VS手术过程中人脑脊液（CSF）和内淋巴液的外科采集与处理步骤，因为这些密切相关的组织可能为VS提供重要的生物标志物来源。最后，本方案提供了原代人VS细胞在培养中进行病毒转导的步骤，作为该组织在基因治疗中应用的一种新途径。

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方案

在采集所有样本前均已获得受试者签署的知情同意书，实验严格遵循《世界医学协会伦理准则》（赫尔辛基宣言）进行。本研究方案的全部环节均已获得麻省眼耳医院和麻省总医院机构审查委员会的批准。

注意：以下第1-7节设计为在从手术室接收到原代人源前庭神经鞘瘤（VS）或耳蜗神经瘤（GAN）样本后依次进行。处理应始终从第1节开始。通常情况下，应首先保存RNA（第2节），随后准备用于收集分泌物的组织（第3节）以及进行蛋白质提取（第4节）。用于培养的组织（VS培养见第5节，GAN培养见第6节）可在补充培养基中暂存，同时完成第2、3、4节的操作。用于切片的组织固定（第7节）耗时很短，可在任何离心步骤期间进行。第8节（外淋巴液处理）和第9节（脑脊液处理）可在经迷路入路切除VS手术过程中从手术室接收到外淋巴液或脑脊液后立即开展。第10节（病毒转导）可在体外培养中正在增殖的VS细胞或施万细胞上进行。

1. 外科样本的准备与接收

注意：以下步骤需在无菌环境（如组织培养罩或层流罩）中进行。操作者应熟悉基本的无菌技术。

  1. 原代人前庭神经鞘瘤或施万细胞培养基的制备
    1. 在37 °C水浴中解冻一份50 mL的冻存胎牛血清（FBS）。
    2. 向500 mL的DMEM/F-12培养基瓶中加入5 mL青霉素/链霉素混合液，最终稀释比例为1:100。
    3. 将50 mL解冻后的FBS加入500 mL的DMEM/F-12培养基瓶中，最终稀释比例为1:10。
    4. 在瓶身标注日期、研究人员姓名缩写及补充信息（例如，1% P/S，10% FBS）。
    5. 将新配制的培养基置于冰箱（4 °C）中保存。
  2. 前庭神经鞘瘤或感觉神经节样本的接收与清洗
    1. 在手术室中，将新鲜获取的前庭神经鞘瘤或感觉神经节样本放入无菌生理盐水中，并置于标本容器内。将样本置于冰上，从手术室运送至实验室的超净工作台。
      注：由于肿瘤大小或切除神经组织量的不同，不同患者的样本尺寸和重量差异显著。
    2. 从冰箱中取出透明质酸酶（25,000 U/mL）和胶原酶（3,200 U/mL）的储备液分装 aliquot，于室温下解冻（根据样本为前庭神经鞘瘤或感觉神经节，分别用于步骤5.1.4或6.1.6）。
      注：冻干酶的重悬方法在产品信息说明书中已有详细描述。胶原酶可用任何无钙平衡盐溶液重悬，透明质酸酶则可用含0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、77 mM NaCl和0.01%的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液重悬。每批冻干酶的比活性可能不同，应在重悬前进行确认。
    3. 使用三个装有1.4 mL 1×无菌PBS的1.5 mL离心管，对前庭神经鞘瘤或感觉神经节样本进行三次清洗。用无菌镊子小心地将样本依次转移至各管中。每管加入样本后立即盖紧，轻轻振荡以清洗。
      注：为避免1.5 mL离心管溢出，若肿瘤组织块较大，可每管使用少于1.4 mL的PBS。
    4. 将样本放入干燥的60 mm培养皿中，用镊子去除所有坏死组织（即，电灼部分，通常呈白色或不透明状）以及富含血管的区域。
    5. 使用镊子或手术刀片将样本分割成若干部分，分别用于RNA保存、蛋白质提取、分泌物收集、固定和细胞培养（见下文第2–6节）。
    6. 将指定用于细胞培养（第5/6节）的组织块转移至一个新的60 mm培养皿中，其中含有5–8 mL冷的、添加补充物的DMEM/F-12培养基（也可使用第一个培养皿的皿盖进行此操作）。
      注：所需DMEM/F-12培养基的体积（来自步骤1.1）取决于肿瘤或神经的大小，但通常在5–8 mL之间。此组织块可在培养基中暂存，直至完成后续操作。

2. VS 和 GAN 组织的 RNA 保存（同样适用于人类感觉上皮）

  1. 在超净工作台内，将 1-1.2 mL RNA 稳定溶液转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  2. 用 PBS 清洗样本后（步骤 1.2.3），将用于 RNA 保存的小块组织（约 3 mm3 的 VS 组织或一段 5 mm 长的 GAN）迅速浸入 RNA 稳定溶液中，确保样本完全浸没在溶液中。
  3. 准备并标记一个新的 1.5 mL 离心管。从 RNA 稳定溶液中取出样本，转移至新管中，并置于 -80 °C 冰箱中保存。

3. VS 和 GAN 分泌物的收集

  1. 第1天
    1. 用PBS洗涤样本后（步骤1.2.3），将用于收集分泌物的VS或GAN组织块放入一个空的1.5 mL离心管中。
    2. 准备另外两个1.5 mL离心管，每管中加入500 µL DMEM（不含FBS）。
      注意：第一管DMEM用于收集肿瘤分泌物，第二管DMEM作为配对对照。分泌物可收集于DMEM、其他任何未添加血清的常规培养基或PBS中。
    3. 将一支含有DMEM的试管置于已校准的电子天平上。归零天平，使试管放置在天平上时显示为0 mg。
    4. 从天平上取下装有DMEM的离心管，将指定用于收集分泌物的组织样本放入管中，再次称重。记录结果，该数值即为组织本身的重量。
    5. 在超净工作台内，将试管中DMEM的体积调整为每10 mg组织样本100 µL。
    6. 将含有组织样本及其配对对照（仅 DMEM）的试管放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中2孵育组织至少72小时，以收集具有生物学意义数量的肿瘤或神经分泌物，孵育时间应与本实验的设计方案保持一致。15.
  2. 第4天
    1. 孵育 72 小时后，从样本中移除含有分泌物的培养基（即， 使用1 mL移液器将组织条件培养基分装至新离心管中，以避免反复冻融。分装量应根据计划进行的下游分析确定。例如， 进行ELISA实验时，若4个孔每孔需要50 µL，可制备210 µL的等分试样。
    2. 如有需要，可将原始试管中剩余的组织（已在第1天标记）于-80 °C保存，以备后续分析（如DNA提取）使用。
    3. 将组织、分泌物和对照 DMEM 置于 -80 °C 冰箱中保存，直至开始后续应用例如， ELISA、LC-MS/MS、细胞因子阵列 等等。).

4. 从 VS 或 GAN 组织中提取蛋白质

  1. 强化型 RIPA 缓冲液的配制
    1. 在15 mL离心管中，向10 mL RIPA缓冲液加入一片磷酸酶抑制剂和一片蛋白酶抑制剂，制成强化型RIPA缓冲液。
      注意：将 RIPA 缓冲液储存在 4 °C，并在使用前立即加入药片。
  2. 蛋白质提取
    1. 将210 µL加标RIPA缓冲液（步骤4.1.1）转移至新的1.5 mL离心管中。
    2. 用 PBS 清洗样本后（步骤 1.2.3），将用于蛋白质提取的组织小块（约 3 mm）转移至新的无酶离心管中。3 将VS或一段5 mm长的GAN加入含RIPA缓冲液的离心管中，置于冰上至少10分钟。若需研究蛋白质的磷酸化形式，应在RIPA缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂14在此期间，可同时进行组织处理其他步骤的操作，例如固定（第7节）。
    3. 将离心机预冷至 4 °C。
    4. 使用塑料研杵在含有RIPA裂解液的离心管中匀浆组织。在冰上进行超声处理，20%振幅下超声10-15秒。确保样品在超声过程中始终保持低温，即使在超声时也应置于冰上。
    5. 在 15,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。
    6. 将上清液按每份50 µL分装至新的0.5 mL离心管中（根据后续实验需求，可选择任意体积增量）。
    7. 将蛋白裂解液分装后于 -80 °C 超低温冰箱中保存，直至开始后续实验应用（例如， ELISA 或蛋白质印迹20,21.

5. 原代人类VS细胞培养

  1. 第1天
    1. 将指定用于细胞培养的VS组织（如步骤1.2.6所述，已置于培养基中）分离成约1 mm3 用每只手各持一把镊子将样品分成小块。
    2. 用10 mL血清移液管吸出含有肿瘤组织的培养基，并将所有内容物转移至15 mL离心管中。
    3. 在1,000 × g离心力下，25 °C离心3分钟。
    4. 在新的60 mm培养皿中配制消化液：将4.7 mL添加物补充的DMEM/F-12培养基、250 µL胶原酶（终浓度：160 U/mL）和50 µL透明质酸酶（终浓度：250 U/mL）混合，终体积为5 mL。
      注意：两种酶均应保存于 -20 °C 冰箱中，但在配制该培养基前（步骤 1.2.2）需预先解冻。
    5. 离心后，肿瘤组织块将在锥形管底部形成沉淀。小心吸出并弃去上清液。
    6. 向肿瘤沉淀物中加入2 mL新配制的含酶消化液（步骤5.1.4）。用移液器反复吹打数次以充分分散组织，随后将含有肿瘤组织碎片的液体转移至60 mm培养皿中。
    7. 将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO₂）218 小时。
  2. 第2天
    1. 将添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基（步骤1.1中配制）在37 °C水浴中预热。
    2. 从培养箱中取出含有VS培养物的培养皿（步骤5.1.7）。使用连接6 mL注射器的22 G针头，吸取含有培养物的培养基，并转移至新的15 mL锥形管中。
    3. 在 1,000 × g 和 37 °C 条件下离心 5 分钟。
    4. 同时，使用无菌镊子将所需数量的经多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片放入24孔培养板中。
      注意：培养的孔数取决于标本的大小；从1 cm的标本中大约可培养24–32孔3 肿瘤，因此对于大多数较小的肿瘤，计划培养8-16孔细胞是合适的。
    5. 离心后，弃去上清液（即， 酶富集培养基），并将残留的细胞沉淀重悬于步骤5.2.1中预热的新鲜添加物补充DMEM/F-12培养基中。
      注意：重悬沉淀物所需的体积取决于步骤 5.2.4 中计划使用的孔数，按每孔 1 mL 培养基估算。
    6. 用5 mL血清移液管吸取2 mL重悬的细胞培养基（步骤5.2.5），将含肿瘤细胞的培养基各1 mL加入已准备好的24孔板的每个孔中。
    7. 继续吸出含有肿瘤细胞的培养基，并分装（每次吸取2 mL，从中取出1 mL加入每个预定的孔中），直至肿瘤细胞悬液被均等地分配到所有准备好的孔中。
    8. 将24孔板放入37 °C培养箱中孵育过夜。
  3. 第3天
    1. 如果观察到孔底部有明显碎片，需小心更换每孔中的培养基为新鲜的添加补充物的DMEM/F-12培养基，注意避免扰动贴壁细胞。若无明显碎片，则将培养板放回培养箱，并于第5天首次更换培养基。
  4. 第5至7天及之后
    1. 每3天更换一次培养基。
      注意：原代人源 VS 细胞和 GAN 细胞通常在体外培养至约 14 天龄时用于后续实验应用。此后，培养纯度会逐渐下降19.

6. 原代人 GAN 培养

  1. 第1天
    1. 在解剖显微镜下，从用于GAN培养的组织中分离神经束（该组织已在培养基中静置，如步骤1.2.6所述）。
      1. 用5号镊子牵拉神经束膜，同时用3号镊子夹住神经外膜，从而将神经束从神经外膜和纤维鞘中分离出来。
    2. 当神经束充分脱离周围神经外膜后，将其转移至含有2 mL新鲜添加培养基的新培养皿中。
    3. 使用手术刀片将神经束切成1至2 mm长的片段。
    4. 用移液器将小段神经束及其周围培养基转移至含有3 mL新鲜添加培养基的15 mL离心管中，使15 mL离心管中的总体积达到5 mL。
    5. 将样本在1,000 × g、25 °C条件下离心3分钟。
    6. 在此期间，在新的60 mm培养皿中配制施万细胞培养基：加入4.7 mL添加型DMEM/F-12培养基、250 µL胶原酶和50 µL透明质酸酶，最终体积为5 mL。
      注：两种酶均储存于-20 °C；配制前在室温下解冻（见步骤1.2.2）。
    7. 样本离心后，神经束将在锥形管底部形成一个小的沉淀。弃去上清液。
    8. 向神经组织沉淀中加入2 mL新配制的含酶消化培养基（见步骤6.1.6）。反复吹打数次以悬浮组织，然后转移至新的60 mm培养皿中。
    9. 将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育20–22小时。
      注：此孵育时间比VS样本所需时间更长（见步骤5.1.7）。
  2. 第2天
    1. 将添加型DMEM/F-12培养基置于37 °C水浴中预热。
    2. 将22 G针头连接至6 mL注射器，吸取含有细胞的培养基，并转移至新的15 mL锥形离心管中。
    3. 在1,000 × g、37 °C条件下离心5分钟。
    4. 弃去上清液，将沉淀重悬于新的、预热过的添加型DMEM/F-12培养基中。
    5. 使用无菌镊子将所需数量的包被盖玻片放入24孔培养板的各孔中。
      注：每1 cm神经组织使用两孔进行培养，有助于获得良好的细胞生长效果。
    6. 向24孔板中指定的每孔加入1 mL含细胞的培养基。
    7. 将24孔板放入37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  3. 第3天
    1. 若观察到孔中有明显碎片，应小心更换为新的添加型DMEM/F-12培养基，注意避免扰动已贴壁的细胞。若无明显碎片，则将培养板放回培养箱，并在第5天首次更换培养基。
  4. 第5–7天及之后
    1. 每3天更换一次培养基。

7. VS & GAN 组织固定

  1. 用移液器将 1–1.2 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA；注意）加入一个新的 1.5 mL 离心管中。
  2. 用 PBS 清洗肿瘤或神经组织后（步骤 1.2.3），取一小块组织（约 3 mm3 的前庭神经鞘瘤组织或 5 mm 长的腹侧耳蜗神经组织）放入 4% PFA 中，并将离心管置于 4 °C 摇床上。确保标本完全浸没在溶液中。
  3. 固定至少 2 小时后，从摇床上取出离心管，继续进行后续处理（例如，包埋于石蜡或最佳切割温度化合物（OCT）中，用于后续免疫组织化学或免疫荧光染色）22,23,24。或者，也可如先前所述进行速冻处理25,26。

8. 经迷路前庭神经鞘瘤切除术中人迷路液的采集与保存

  1. 将三个无菌的1.5 mL离心管置于冰上。
    注意：将保留一管作为备用，以防污染。
  2. 用0.22 µm滤器过滤两次的PBS溶液填充一个1.5 mL离心管，体积约为1.2 mL。
    注意：在经迷路进路切除前庭神经鞘瘤期间收集外淋巴液时，术者必须首先确保手术区域无骨粉、血液或生理盐水残留。为此，术者可用非优势手持Schuknecht 21或24 G吸引管进行清理。
    一个典型的外淋巴液提取位置是外半规管（不过，根据外科医生的偏好，也可选择后半规管或圆窗膜）。外科医生应使用金刚砂钻头在持续吸引冲洗的条件下小心去除迷路骨质，以识别蓝色线条即， 半规管的膜性迷路。使用连接1 mL结核菌素注射器的长27 G针头，沿蓝线穿刺进入半规管。
  3. 请外科医生轻轻抽吸少量外淋巴液，然后将注射器及连接的针头交给手术护士。
    注意：通常仅收集到一滴或更少的外淋巴液。若观察到的液体体积较大，则样本可能被其他液体污染。
  4. 打开预先准备好的空的1.5 mL离心管以及装有PBS的离心管，立即使用。开盖时注意不要触碰到管盖内部。
  5. 从手术护士处接过注射器及连接的针头，将液体完全排入空试管中，注意避免针头接触试管本身。
  6. 小心地将针头从注射器上取下。避免污染针尖，并继续用一只手握住针头。
    注意：仅收集到极少量的外淋巴液，因此针头的长端内可能仍有部分液体残留。
  7. 另一只手使用注射器（不带针头）从已准备好的试管中吸取0.2 mL过滤后的PBS溶液至注射器内。
  8. 将针头重新连接至注射器。将注射器内的液体完全排入含有外淋巴液的试管中，并用无菌PBS冲洗针尖。
  9. 关闭含有外淋巴液和PBS的离心管，置于冰上。
  10. 将针头丢弃至锐器容器中。
  11. 尽快将含有外淋巴液的试管放入 -80 °C 冰箱中。

9. 人脑脊液的采集与储存

  1. 将三个（或更多）无菌的 1.5 mL 离心管置于冰上。
    注意：其中一个管子作为备用，以防污染或采集到的样本体积超出预期。
  2. 打开硬脑膜后，请外科医生使用 3 mL 注射器（不带针头）收集脑脊液（CSF）。
    注意：为防止污染，应在打开硬脑膜后立即进行脑脊液采集。
  3. 请外科医生将注射器交给手术护士。
  4. 从手术护士处接过注射器，并将所需体积的脑脊液完全排入离心管中。
  5. 盖紧离心管，并将其放回冰上。
  6. 尽快将离心管放入 -80 °C 超低温冰箱中保存。

10. 针对原代 VS 细胞的病毒转导实验

  1. 以病毒储存液浓度为参考，计算拟进行的转导实验所需的基因组拷贝数（gc）和感染复数（MOI）；可将病毒储存液直接稀释于含补充物的培养基中。
    注意：可使用任何适用于原代细胞转导的病毒载体；参见 Landegger 等 (2017) 年关于六种不同腺相关病毒血清型的详细比较27此外，在培养原代人源细胞时，通常不会在接种到盖玻片前进行细胞计数。原代VS细胞对胰酶消化和传代反应较差，因此为了可靠地计算感染复数（MOI），可通过相差显微镜估算每孔中贴壁细胞的数量。或者，若细胞接近汇合状态，可依据24孔板的标准细胞密度值可靠估算其数量。例如， 5 × 104 每孔细胞数
  2. 在超净工作台内，于15 mL锥形离心管中配制含有所需量病毒的完全培养基，每孔待转导细胞对应准备1 mL含病毒的培养基。用移液器将含病毒的培养基轻轻但充分地吹打混匀。
  3. 使用无菌镊子将含有原代VS细胞的盖玻片（步骤5.2.8）从原始24孔板转移至新的24孔板。每转移一张盖玻片后，加入1 mL含病毒的培养基。每次添加培养基后轻轻摇动培养板，以确保细胞均匀接触病毒。
  4. 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育2 在计划实验的整个持续期间。
    注意：48–120 小时的不同孵育时间均显示出良好的转导效果27.

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结果

如第5节所述，在培养条件下的人源性前庭神经鞘瘤（VS）细胞可作为多种下游研究应用中疾病相关过程的有用模型（图1）。第6节中培养的健康施万细胞则提供了直接且具有指导意义的对照。如下所述，依据该统一方法学框架处理的VS和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAN）的大量数据已在先前发表的多篇文章中公开12,13,14,15,27。

首次展示了利用腺相关病毒对原代前庭 Schwann 细胞进行成功转导以实现基因治疗图2）。在培养物...

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讨论

本文描述了一种用于前庭神经鞘瘤（VS）研究的统一方法学框架，概述了同时处理人类VS样本和听神经瘤（GAN）样本以用于后续研究应用的流程。随着VS研究进入精准医学时代，将同一样本制备成能够回答多种研究问题的形式，将有助于发现针对个体患者的分子、细胞、遗传及蛋白质组学方面的特异性信息。

通过免疫细胞化学方法，利用S100标志物阳性细胞与DAPI核染色阳性细胞的比例，对人施万细胞和前庭神经鞘瘤（VS）培养物的纯度进行了长期评估19。因此，建议在细胞接种后的前两周内进行原代人施万细胞培养实验，因为此期间细胞纯度最高；此后，成纤维细胞样细胞将逐渐占主导地位。尽管前庭神经鞘瘤细胞培养物在培养两周时纯度也达到最高，但VS细胞缺乏接触介导的抑制作用，会在后期持续增殖。此外，对来自同一肿瘤的VS组织（第4节）和VS细胞培养物（第5节）的蛋白质表达进行直接微阵列比较，成功表明VS培养物与其相应原发肿瘤之间具有足够高的生物学相似性19。可通过第4节中制备的蛋白裂解液进行Western blot分析，实现目标蛋...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了耳聋与其他沟通障碍国家研究所基金R01DC015824（K.M.S.）和T32DC00038（资助J.E.S.和S.D.）、美国国防部基金W81XWH-14-1-0091（K.M.S.）、Bertarelli基金会（K.M.S.）、Nancy Sayles Day基金会（K.M.S.）、Lauer耳鸣研究中心（K.M.S.）以及Barnes基金会（K.M.S.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Biocoat 聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白 12 mm #1 德国玻璃盖玻片Corning354087或使用 Corning 层粘连蛋白（CB-40232）和 Cultrex 聚-L-赖氨酸（3438-100-01）自行制备盖玻片
CELLSTAR 15 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌Greiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌Greiner Bio-One227261
CELLSTAR 细胞培养皿，60 mmGreiner Bio-One628160
来自溶组织梭菌的胶原酶，经无菌过滤Sigma-AldrichC1639
Costar 24 孔透明 TC 处理多孔板，无菌Corning3526
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM，高糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12，500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 镊子，DumoxelFine Science Tools11231-30使用前需高压灭菌
Dumont #5 镊子，标准尖头，不锈钢Fine Science Tools11251-20使用前需高压灭菌
胎牛血清，经鉴定合格，来自 USDA 批准地区，500 mLThermo Fisher Scientific10437-028分装至 50 mL 管中，保存于 -20°C 冰箱
来自牛睾丸的透明质酸酶，I-S 型，冻干粉末Sigma-AldrichH3506
Millex-GP 注射式滤器，0.22 µm，聚醚砜，33 mm，无菌EMD MilliporeSLGP033RS
多聚甲醛，试剂级，结晶状Sigma-AldrichP6148使用前：根据在线可获取的方案建立标准操作程序
PBS，pH 7.4，500 mLThermo Fisher Scientific10010-023使用前需高压灭菌
青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂片剂Roche04906845001
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂Thermo Fisher Scientific88666
移液器及移液器吸头，5/10/25 mL多种品牌多种型号
适用于 1.5/2.0 mL 微量管的塑料匀浆杵E&K ScientificEK-10539
PrecisionGlide 针头，27 G × 1 1/2 英寸BD301629
RIPA 裂解缓冲液Boston BioProductsBP-115
RNAlater（RNA 稳定溶液）Thermo Fisher ScientificAM7021
带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，0.5 mLEppendorf022363719使用前需高压灭菌
带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，1.5 mLEppendorf022363204使用前需高压灭菌
生理盐水 - 0.9% 氯化钠注射液，抑菌型，20 mLHospira0409-1966-05
手术刀片 - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht 吸引管，24 号Bausch + LombN1698 42适用于手术入路（除常规耳科手术器械外），例如蓝色手术标记笔
标本容器，手术室用无菌，4 盎司MedlineDYND30331H
Stemi 2000-C 体视显微镜Zeiss000000-1106-133
注射器/针头组合，鲁尔锁头，5 mL，22 G × 1 英寸BD309630
结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，1 mLBD309659
结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，3 mLBD309656
超声波匀浆仪，4710 系列，CV18 探头Cole-ParmerCP25013

参考文献

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