前庭神经鞘瘤研究的统一方法学框架

摘要

本实验方案的目的是概述用于前庭神经鞘瘤和施万细胞研究中多种下游应用的人类手术样本的采集与处理流程。

摘要

前庭神经鞘瘤是桥小脑角区最常见的肿瘤，占所有颅内肿瘤的6%-8%。尽管这些肿瘤可导致高达95%的患者出现感音神经性听力损失，但其听力损失的分子机制仍不明确。本文介绍了我们实验室建立的一系列步骤，旨在促进各种原代人体组织样本的采集与处理，以支持前庭神经鞘瘤研究中的后续科研应用。具体而言，本文描述了一种统一的方法学框架，用于从手术标本中采集、处理和培养施万细胞及神经鞘瘤细胞。该框架还整合了当前研究中被认为必不可少的并行处理步骤：肿瘤和神经分泌物的收集、采集组织中RNA的保存和蛋白质的提取、组织固定以制备切片，以及将原代人源细胞暴露于腺相关病毒，以应用于基因治疗。此外，本文强调经迷路入路手术切除该肿瘤的独特优势，即可同时获取人耳内耳的感觉上皮组织和外淋巴液。文中还提供了提高实验质量的建议，并指出了常见的技术难点。

引言

前庭神经鞘瘤（VS）是桥小脑角区最常见的肿瘤，每10万人中即有1人被诊断出患有此病。尽管该肿瘤不发生转移，但会严重影响患者的生活质量^1,2,3,4,5,6。患者通常伴有听力丧失、耳鸣以及耳部胀满感。随着肿瘤的生长，症状逐渐加重，导致平衡障碍、面瘫以及其他脑神经功能受损。由于肿瘤压迫脑干，还可能引发危及生命的并发症⁷。

前庭神经鞘瘤（VS）的治疗选择主要包括对静止性肿瘤采取观察等待，对生长性肿瘤则采用立体定向放射治疗或手术切除⁸。在有研究背景的医院中进行此类肿瘤的手术切除，为获取和分析患者手术期间采集的新鲜肿瘤组织提供了机会。其中一种特定的VS手术方式——经迷路切除术，甚至可获得来自内耳的宝贵的人类感觉上皮组织及外淋巴液。

因为前庭神经鞘瘤起源于外周感觉神经（即， 前庭神经），将前庭神经鞘瘤相关观察结果与适当的对照神经（....

方案

在采集所有样本前均已获得受试者签署的知情同意书，实验严格遵循《世界医学协会伦理准则》（赫尔辛基宣言）进行。本研究方案的全部环节均已获得麻省眼耳医院和麻省总医院机构审查委员会的批准。

注意：以下第1-7节设计为在从手术室接收到原代人源前庭神经鞘瘤（VS）或耳蜗神经瘤（GAN）样本后依次进行。处理应始终从第1节开始。通常情况下，应首先保存RNA（第2节），随后准备用于收集分泌物的组织（第3节）以及进行蛋白质提取（第4节）。用于培养的组织（VS培养见第5节，GAN培养见第6节）可在补充培养基中暂存，同时完成第2、3、4节的操作。用于切片的组织固定（第7节）耗时很短，可在任何离心步骤期间进行。第8节（外淋巴液处理）和第9节（脑脊液处理）可在经迷路入路切除VS手术过程中从手术室接收到外淋巴液或脑脊液后立即开展。第10节（病毒转导）可在体外培养中正在增殖的VS细胞或施万细胞上进行。

1. 外科样本的准备与接收

注意：以下步骤需在无菌环境（如组织培养罩或层流罩）中进行。操作者应熟悉基本的无菌技术。

1. 原代人前庭神经鞘瘤或施万细胞培养基的制备
   1. 在37 °C水浴中解冻一份50 mL的冻存胎牛血清（FBS）。
   2. 向500 mL的DMEM/F-12培养基瓶中加入5 mL青霉素/链霉素混合液....

结果

如第5节所述，在培养条件下的人源性前庭神经鞘瘤（VS）细胞可作为多种下游研究应用中疾病相关过程的有用模型（图1）。第6节中培养的健康施万细胞则提供了直接且具有指导意义的对照。如下所述，依据该统一方法学框架处理的VS和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAN）的大量数据已在先前发表的多篇文章中公开^{12,13,14,15,27}。

首次展示了利用腺相关病毒对原代前庭 Schwann 细胞进行成功转导以实现基因治疗图2）。在培养物.......

讨论

本文描述了一种用于前庭神经鞘瘤（VS）研究的统一方法学框架，概述了同时处理人类VS样本和听神经瘤（GAN）样本以用于后续研究应用的流程。随着VS研究进入精准医学时代，将同一样本制备成能够回答多种研究问题的形式，将有助于发现针对个体患者的分子、细胞、遗传及蛋白质组学方面的特异性信息。

通过免疫细胞化学方法，利用S100标志物阳性细胞与DAPI核染色阳性细胞的比例，对人施万细胞和前庭神经鞘瘤（VS）培养物的纯度进行了长期评估¹⁹。因此，建议在细胞接种后的前两周内进行原代人施万细胞培养实验，因为此期间细胞纯度最高；此后，成纤维细胞样细胞将逐渐占主导地位。尽管前庭神经鞘瘤细胞培养物在培养两周时纯度也达到最高，但VS细胞缺乏接触介导的抑制作用，会在后期持续增殖。此外，对来自同一肿瘤的VS组织（第4节）和VS细胞培养物（第5节）的蛋白质表达进行直接微阵列比较，成功表明VS培养物与其相应原发肿瘤之间具有足够高的生物学相似性¹⁹。可通过第4节中制备的蛋白裂解液进行Western blot分析，实现目标蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biocoat 聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白 12 mm #1 德国玻璃盖玻片	Corning	354087	或使用 Corning 层粘连蛋白（CB-40232）和 Cultrex 聚-L-赖氨酸（3438-100-01）自行制备盖玻片
CELLSTAR 15 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌	Greiner Bio-One	188161
CELLSTAR 50 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌	Greiner Bio-One	227261
CELLSTAR 细胞培养皿，60 mm	Greiner Bio-One	628160
来自溶组织梭菌的胶原酶，经无菌过滤	Sigma-Aldrich	C1639
Costar 24 孔透明 TC 处理多孔板，无菌	Corning	3526
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM，高糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，500 mL	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12，500 mL	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 镊子，Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	使用前需高压灭菌
Dumont #5 镊子，标准尖头，不锈钢	Fine Science Tools	11251-20	使用前需高压灭菌
胎牛血清，经鉴定合格，来自 USDA 批准地区，500 mL	Thermo Fisher Scientific	10437-028	分装至 50 mL 管中，保存于 -20°C 冰箱
来自牛睾丸的透明质酸酶，I-S 型，冻干粉末	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP 注射式滤器，0.22 µm，聚醚砜，33 mm，无菌	EMD Millipore	SLGP033RS
多聚甲醛，试剂级，结晶状	Sigma-Aldrich	P6148	使用前：根据在线可获取的方案建立标准操作程序
PBS，pH 7.4，500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010-023	使用前需高压灭菌
青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100 mL	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂片剂	Roche	04906845001
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂	Thermo Fisher Scientific	88666
移液器及移液器吸头，5/10/25 mL	多种品牌	多种型号
适用于 1.5/2.0 mL 微量管的塑料匀浆杵	E&K Scientific	EK-10539
PrecisionGlide 针头，27 G × 1 1/2 英寸	BD	301629
RIPA 裂解缓冲液	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater（RNA 稳定溶液）	Thermo Fisher Scientific	AM7021
带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，0.5 mL	Eppendorf	022363719	使用前需高压灭菌
带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，1.5 mL	Eppendorf	022363204	使用前需高压灭菌
生理盐水 - 0.9% 氯化钠注射液，抑菌型，20 mL	Hospira	0409-1966-05
手术刀片 - #15	Fine Science Tools	10015-00
Schuknecht 吸引管，24 号	Bausch + Lomb	N1698 42	适用于手术入路（除常规耳科手术器械外），例如蓝色手术标记笔
标本容器，手术室用无菌，4 盎司	Medline	DYND30331H
Stemi 2000-C 体视显微镜	Zeiss	000000-1106-133
注射器/针头组合，鲁尔锁头，5 mL，22 G × 1 英寸	BD	309630
结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，1 mL	BD	309659
结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，3 mL	BD	309656
超声波匀浆仪，4710 系列，CV18 探头	Cole-Parmer	CP25013