活细胞中气味受体激活的实时cAMP检测测量方法

摘要

对气味受体功能的表征是去孤儿化过程中的关键环节。本文描述了一种利用cAMP检测法实时测量气味受体激活的方法。

摘要

哺乳动物嗅觉受体（OR）家族数量庞大，导致在众多挥发性化学物质中鉴定其对应配体存在困难。为高效且准确地去孤儿化OR，我们结合使用异源细胞系表达哺乳动物OR，并利用基因改造的生物传感器质粒，实时检测OR激活后下游的cAMP生成。该检测方法可用于对OR进行气味分子筛选。 反之亦然通过使用不同气味分子浓度进行测试并绘制浓度-反应曲线，可进一步验证筛选中发现的气味分子-受体阳性相互作用。本文采用该方法对一种气味化合物在表达于Hana3A细胞中的人类嗅觉受体文库中进行了高通量筛选，并确认产生阳性反应的受体即为该目标化合物的特异性受体。我们发现，该高通量检测方法在评估嗅觉受体激活方面具有高效性和可靠性，本研究的数据为该方法在嗅觉受体功能研究中的潜在应用提供了实例。

引言

嗅觉在动物的生存中起着重要作用，因为动物依赖其嗅觉能力来获取食物、躲避捕食者和危险、区分物种以及选择配偶^1,2。这些功能的实现依赖于气味受体（ORs），这些受体在位于嗅上皮（OE）中的嗅觉感觉神经元（OSNs）的纤毛表面单独表达。ORs属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族中最大的家族，在人类和小鼠中分别约有400个和1200个不同的OR基因^3,4,5。当ORs被气味分子激活后，会通过依次激活嗅觉G蛋白（G_olf）和III型腺苷酸环化酶（ACIII），导致细胞内cAMP水平升高。升高的细胞内cAMP可作为第二信使，打开细胞膜上的核苷酸门控通道，引发包括Ca²⁺在内的阳离子内流以及动作电位的产生，最终启动神经电位传递和嗅觉感知。ORs对大量气味分子的检测与分辨过程被认为是嗅觉感知的第一步^6,7。

自从Buck和Axel以来⁸ 首次成功克隆嗅觉受体并阐明由ORs启动的嗅觉感知机制后，OR家族的去孤儿化成为该领域的研究热点之一。多种 体内, 离体 和 体外 已报道了多种测量嗅觉受体激活的方法^9,10,11,12一种使用Ca的传统方法²⁺ 成像结合对嗅觉神经元的单细胞RT-PCR，实现了对脂肪族气味物质响应的不同嗅觉受体的鉴定^13,14,15近年来，大规模转录组分析的出现推动了更高通量技术的发展 体内 方法。利用S100a5-tauGFP报告小鼠品系和微阵列分析，肯塔基检测法鉴定了对丁子香酚和麝香酮有响应的小鼠嗅觉受体⁹基于气味暴露后OR mRNA水平的下降，DREAM技术采用转录组学方法来确定脊椎动物和非脊椎动物物种中的OR激活谱型。¹⁶同样，鉴于S6在神经元激活过程中的磷酸化现象，Matsunami研究组通过对磷酸化核糖体进行免疫沉淀后测序mRNA，以鉴定响应性的嗅觉受体（ORs）。¹²最后，Feinstein 团队报道了超级嗅觉小鼠，可作为研究气味编码的平台 体内，称为MouSensor技术¹⁷.

在体外（in vitro）条件下，由于培养嗅觉神经元（OSNs）存在困难，因此构建一种能够模拟体内（in vivo）嗅觉受体（OR）功能表达的异源表达系统，成为对气味化学物质进行大规模筛选的理想方案。然而，由于非嗅觉来源的培养细胞系与天然OSNs存在差异，OR蛋白往往滞留在内质网中，无法转运至细胞膜，导致OR降解并丧失受体功能^18,19。为解决这一问题，研究人员已开展大量工作，致力于在异源细胞系中实现OR在细胞膜上的功能性表达。Krautwurst 等首次将视紫红质（rhodopsin）的前20个氨基酸（Rho标签，Rho-tag）连接至OR蛋白的N端，从而促进了部分OR在人胚肾（HEK）细胞中的细胞表面表达²⁰。Saito 等通过分析单个OSNs的基因表达序列标签（SAGE）文库，首次克隆出受体转运蛋白（RTP）家族成员RTP1和RTP2，以及受体表达增强蛋白1（REEP1），这些蛋白可促进OR向细胞膜的转运，并增强HEK293T细胞中OR对气味分子的响应能力²¹。基于上述发现，Matsunami研究团队成功构建了Hana3A细胞系，该细胞系在HEK293T细胞中稳定转染了RTP1、RTP2、REEP1和Gα_olf，并瞬时转染带有Rho标签的OR，从而实现了高效的OR功能性表达。后续研究进一步揭示：1）RTP1的一个较短亚型RTP1S，其促进OR功能的效果优于全长RTP1蛋白；2）M3型毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M3R）可通过抑制β-arrestin-2的募集来增强OR活性。这两项成果随后被引入异源表达系统，以优化实验结果^22,23。

已有多种检测方法用于量化异源系统中的受体激活。分泌型胎盘碱性磷酸酶（SEAP）检测法利用由cAMP反应元件（CREs）转录调控的报告酶，使其成为评估嗅觉受体（OR）激活的优选方法。在与SEAP检测试剂孵育后，可直接在培养基样品中检测到荧光信号²⁴。利用该方法，不仅嗅觉受体（ORs）的功能得到了表征，而且在嗅上皮（OE）中表达的另一类化学感受受体——痕量胺相关受体（TAARs）的功能也已被阐明^25,26,27。另一种常用方法是荧光素酶检测法，该方法采用受cAMP反应元件（CRE）调控的萤火虫荧光素酶报告基因。通过检测荧光素酶表达所产生的发光信号，可高效且稳健地量化OR的激活水平^10,11,28。

实时cAMP检测技术也已广泛用于动态监测异源或内源性G蛋白偶联受体（GPCR）的功能。其中一种先进的检测方法利用了一种基因编码的生物传感器变体，该传感器包含一个与突变型荧光素酶融合的cAMP结合域。当cAMP结合时，引发构象变化，从而激活荧光素酶，其产生的发光信号可通过化学发光检测仪进行测量^29,30。已有研究报道，实时cAMP技术适用于在HEK293细胞和NxG 108CC15细胞中对人类嗅觉受体进行去孤儿化研究^31,32,33，同时也适用于HEK293T衍生的Hana3A细胞^34,35。Krautwurst研究组还详细描述了该技术适用于双向大规模嗅觉受体筛选策略^32,33。

本文介绍了一种利用Hana3A细胞中实时cAMP检测方法测定嗅觉受体（OR）激活的实验方案。在此方案中，对预先平衡的活细胞在加入特定挥发性化合物后，连续30分钟动力学地测定其发光信号，从而实现对OR激活更为高效且准确的分析，该方法相较于长时间孵育条件下易产生的细胞环境干扰及气味诱导的细胞毒性等假象具有更强的抗干扰能力。这种实时检测方法可用于大规模筛选OR受体及其配体，并可用于表征特定的OR-配体相互作用。利用该方法，我们通过对379种人源OR进行筛选，并进一步验证阳性结果，成功鉴定出OR5AN1为麝香成分麝香酮的受体。

方案

1. Hana3A 细胞的培养与维持

1. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中，将细胞培养于100 mm细胞培养皿中的10 mL最低必需培养基（MEM）中，培养基中含10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素-链霉素和1.25 µg/mL两性霉素B。每次传代时，每隔一次加入1 µg/mL嘌呤霉素，以维持质粒的稳定转染（参见引言）。
   注意：所有涉及细胞培养的操作步骤均应在II级生物安全柜中进行，以确保无菌环境。
2. 每2–3天以10–20%的比例在100 mm培养皿中进行传代培养。

2. 转染用细胞铺板

1. 在相差显微镜下观察 Hana3A 细胞，以确保细胞活性并评估汇合度。
2. 吸除细胞培养皿中的全部培养基。
3. 加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，轻轻晃动培养皿后吸除 PBS。
4. 向培养皿中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），混匀 1 分钟，或直至所有细胞悬浮。
   注意：必要时在显微镜下观察细胞从培养皿底部脱落的进程。
5. 加入 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 MEM 培养基以终止胰蛋白酶作用，并通过吹打使细胞团块分散。
   注意：若用于转染前的铺板，所用培养基中不应含有抗生素。添加抗生素可能会降低转染效率。
6. 根据待转染的培养板数量，将适量细胞转移至 15 mL 离心管中。每块 96 孔板接种 2 × 10⁶ 个细胞，约为一个 100% 汇合度的 100 mm 培养皿细胞量的 1/5，相当于每孔 2 × 10⁴ 个细胞，或每孔汇合度约为 15–30%。在 200 × g 条件下离心 5 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
   注意：应准确计算接种至 96 孔板的细胞数量，以避免在刺激前出现细胞过度生长或生长不足的情况。
7. 向 15 mL 离心管中加入适量含 10% FBS 的 MEM 培养基，通过吹打使细胞团块充分分散。每块 96 孔板使用 6 mL 含 10% FBS 的 MEM 重悬细胞。
   注意：操作时需小心，避免在离心管中产生气泡。
8. 将重悬的细胞加入储液槽中，使用多通道移液器向 96 孔板的每孔加入 50 µL 细胞悬液。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。

3. 质粒转染

1. 转染前，在相差显微镜下观察培养板中的细胞，确保每孔细胞汇合度约为30-50%，随后将培养板放回培养箱。
2. 提前准备好带有Rho标签的OR构建体^11,21,22,28，辅助因子构建体（RTP1S^22,36 和 M3R²³），以及生物传感器变体构建体^29,30 通过质粒小提纯化。使用分光光度计测定DNA浓度，并调整质粒DNA浓度（例如必要时用蒸馏水稀释至100 ng/µL。
3. 转染混合物的制备
   1. 为每块96孔板，在500 µL MEM中配制质粒转染混合液，具体步骤如下 表1.
      注意：当在同一块96孔板上测试不同的嗅觉受体（OR）时，转染混合物体积以及加入的质粒DNA量必须根据转染了特定OR的孔数进行相应调整。
   2. 在试管中，将18 µL脂质介导转染试剂加入500 µL MEM中，配制转染混合液。
4. 用移液器反复吹打，将质粒混合物与转染混合物混匀。室温孵育15分钟。
5. 通过加入5 mL含10% FBS的MEM终止反应。
6. 在细胞培养超净台内铺一层较厚的无菌纸巾。从培养箱中取出含有细胞的96孔板，轻轻反复将板子倒置敲击在纸巾堆上，使培养基被纸巾完全吸收。
   注意：切勿用力或突然敲击培养板，以免造成细胞丢失。
7. 将50 µL混合转染液转移至96孔板的每个孔中，在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜18–24 h₂.
   注意：当一个实验中需检测多个96孔板时，应事先规划好转染和刺激的时间安排，以确保所有孔板在相同的转染时间和刺激暴露时间后进行检测。

4. 使用实时 cAMP 检测法刺激并测量嗅觉受体活性

1. 在相差显微镜下观察转染后的细胞，确保每孔细胞融合度为50-80%，然后放回培养箱中继续培养。
2. 通过向Hank's平衡盐溶液（HBSS）中添加10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5 mM葡萄糖，制备刺激培养基。
3. 将实时cAMP检测底物试剂分装样品置于冰上解冻。将底物试剂以每管55 µL分装于PCR管中，于-80 °C保存。每块板使用1管。
4. 将55 µL底物试剂与2750 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液混合，配制2%平衡溶液。
5. 在实验台上铺一层厚的纸巾。将培养板倒置，轻轻反复敲击纸巾，使转染培养基被纸巾完全吸收。
6. 用移液器向每孔加入50 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液，洗涤细胞。
7. 轻轻反复敲击96孔板，去除HBSS/HEPES/葡萄糖溶液。
8. 向每孔加入25 µL 2%平衡溶液，在室温避光条件下孵育2小时。
9. 提前用DMSO配制1 M气味分子储备液，并于-20 °C保存，直至使用。
10. 在孵育结束前，将气味分子储备液用HBSS/HEPES/葡萄糖刺激培养基稀释至工作浓度。
    注意：本步骤中配制的气味分子稀释液浓度应为最终所需浓度的两倍，以确保每孔中达到正确的终浓度。
11. 使用化学发光酶标仪，在加入气味分子前，以每孔1000 ms的速率连续测量培养板的基础发光水平两次³⁴。
12. 迅速将培养板从酶标仪中取出，向每孔加入25 µL气味分子稀释液，并立即开始对所有孔进行连续发光检测，30分钟内完成20个循环的测量。
    注意：当在同一块板中使用不同气味分子或同一气味分子的不同浓度时，应小心移液，避免污染相邻孔。

5. 数据分析

1. 从化学发光酶标仪软件中导出数据。
2. 使用以下公式计算每个时间点的归一化OR反应值：
   （luminescence_N – luminescence_basal）/（luminescence_highest – luminescence_basal）
   其中，N 表示某一孔的发光值；basal 表示两个基础发光值的平均值；highest 表示一块或一组板中的最高发光值。
   注意：根据实验目的，可采用其他图形表示方法。例如，在筛选实验（见图1）和构建浓度-反应曲线时，可使用动力学测量过程中某一特定时间点（如最大值或终末值）的某一孔的发光值。

结果

麝香酮是天然麝香中的主要芳香成分。最近的研究基于与小鼠麝香酮反应性肾小球中克隆得到的MOR215-1受体的同源性，确定OR5AN1为人源麝香酮及其他大环麝香化合物的受体^37,38。通过筛选人类嗅觉受体（OR）文库，我们研究团队与东原研究组也利用荧光素酶报告基因检测系统分别鉴定出OR5AN1是环十五酮和麝香酮这两种大环麝香化合物的主要受体^38,39。

利用本文所述的实时cAMP检测方法，我们使用30 µM麝香酮对人类嗅觉受体（OR）文库进行了筛选（图1）。在检测的379种人类OR中，OR5AN1对麝香酮表现出显著响应，而其他OR以及阴性对照（无气味刺激对照和空载体...

讨论

准确测量某一嗅觉受体（OR）在特定气味分子作用下的激活情况，是解析嗅觉信息编码的首要步骤。本研究展示的实验示例了如何利用一种方法来鉴定 体外 OR表达系统，筛选人类OR基因库中对该目标气味化学物质有响应的嗅觉受体，随后利用不同浓度的该化学物质表征受体的药理学特性。我们的结果证实OR5AN1是一种 真正有效的 麝香酮受体。这与之前的一项报道一致³⁹ 并为“仅有少量受体参与麝香气味感知”这一推测提供了进一步证据^27,40与佐藤-秋原的筛查数据相比 等 在使用萤光素酶检测法于相似或异源表达系统中进行检测时，我们的筛选结果显示信噪比较低。除不同技术本身固有的差异外，结果差异可能源于我们采用了较低的麝香酮浓度（30 µM）。 与 100 µM）。事实上，EC₅₀ OR5AN1 对麝香酮的浓度-反应曲线经实时 cAMP 检测法测得的值，与 Sato-Akuhara 所获得的值处于同一数量级 <...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP试剂	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP质粒	Promega	E1171
Hana3A细胞			可根据要求向作者索取
不含钙或镁的HBSS	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R质粒			克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
含EBSS和L-谷氨酰胺的MEM	Hyclone	SH30024
麝香酮	Santa Cruz	sc-200528
西藏麝香酮	Sigma-Aldrich	S359165
OR质粒			用Rho标签克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
不含钙或镁的PBS	Cellgro	21-040-CV
青霉素-链霉素	Hyclone	SV30010
质粒小提试剂盒	Tiangen	DP103-03
嘌呤霉素	Sigma	P8833
RTP1S质粒			克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
胰蛋白酶-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2 mL PCR管	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL Eppendorf管	Eppendorf
15 mL 17 mm × 120 mm锥形管	BD Falcon	352096
8通道和/或12通道多通道移液器	Eppendorf
96孔平底白色细胞培养板	Greiner	655098
100 mm × 20 mm细胞培养皿	BD Falcon	353003
带有层流的II级生物安全柜
细胞培养孵育箱，含5% CO2
离心机，配备适用于15 mL锥形管的摆动桶转子
Infinite F200酶标仪	Tecan
配备×10和×20物镜的相差显微镜
分光光度计
用于多通道分配的无菌试剂储液槽
无菌纸巾