活细胞中气味受体激活的实时cAMP检测测量方法

摘要

对气味受体功能的表征是去孤儿化过程中的关键环节。本文描述了一种利用cAMP检测法实时测量气味受体激活的方法。

摘要

哺乳动物嗅觉受体（OR）家族数量庞大，导致在众多挥发性化学物质中鉴定其对应配体存在困难。为高效且准确地去孤儿化OR，我们结合使用异源细胞系表达哺乳动物OR，并利用基因改造的生物传感器质粒，实时检测OR激活后下游的cAMP生成。该检测方法可用于对OR进行气味分子筛选。 反之亦然通过使用不同气味分子浓度进行测试并绘制浓度-反应曲线，可进一步验证筛选中发现的气味分子-受体阳性相互作用。本文采用该方法对一种气味化合物在表达于Hana3A细胞中的人类嗅觉受体文库中进行了高通量筛选，并确认产生阳性反应的受体即为该目标化合物的特异性受体。我们发现，该高通量检测方法在评估嗅觉受体激活方面具有高效性和可靠性，本研究的数据为该方法在嗅觉受体功能研究中的潜在应用提供了实例。

引言

嗅觉在动物的生存中起着重要作用，因为动物依赖其嗅觉能力来获取食物、躲避捕食者和危险、区分物种以及选择配偶^1,2。这些功能的实现依赖于气味受体（ORs），这些受体在位于嗅上皮（OE）中的嗅觉感觉神经元（OSNs）的纤毛表面单独表达。ORs属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族中最大的家族，在人类和小鼠中分别约有400个和1200个不同的OR基因^3,4,5。当ORs被气味分子激活后，会通过依次激活嗅觉G蛋白（G_olf）和III型腺苷酸环化酶（ACIII），导致细胞内cAMP水平升高。升高的细胞内cAMP可作为第二信使，打开细胞膜上的核苷酸门控通道，引发包括Ca²⁺在内的阳离子内流以及动作电位的产生，最终启动神经电位传递和嗅觉感知。ORs对大量气味分子的检测与分辨过程被认为是嗅觉感知的第一步^6,7。

自从Buck和Axel以来⁸ 首次成功克隆嗅觉受体并阐明由ORs启动的嗅觉感知....

方案

1. Hana3A 细胞的培养与维持

1. 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中，将细胞培养于100 mm细胞培养皿中的10 mL最低必需培养基（MEM）中，培养基中含10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素-链霉素和1.25 µg/mL两性霉素B。每次传代时，每隔一次加入1 µg/mL嘌呤霉素，以维持质粒的稳定转染（参见引言）。
   注意：所有涉及细胞培养的操作步骤均应在II级生物安全柜中进行，以确保无菌环境。
2. 每2–3天以10–20%的比例在100 mm培养皿中进行传代培养。

2. 转染用细胞铺板

1. 在相差显微镜下观察 Hana3A 细胞，以确保细胞活性并评估汇合度。
2. 吸除细胞培养皿中的全部培养基。
3. 加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，轻轻晃动培养皿后吸除 PBS。
4. 向培养皿中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），混匀 1 分钟，或直至所有细胞悬浮。
   注意：必要时在显微镜下观察细胞从培养皿底部脱落的进程。
5. 加入 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 MEM 培养基以终止胰蛋白酶作用，并通过吹打使细胞团块分散。
   注意：若用于转染前的铺板，所用培养基中不应含有抗....

结果

麝香酮是天然麝香中的主要芳香成分。最近的研究基于与小鼠麝香酮反应性肾小球中克隆得到的MOR215-1受体的同源性，确定OR5AN1为人源麝香酮及其他大环麝香化合物的受体^37,38。通过筛选人类嗅觉受体（OR）文库，我们研究团队与东原研究组也利用荧光素酶报告基因检测系统分别鉴定出OR5AN1是环十五酮和麝香酮这两种大环麝香化合物的主要受体^38,39。

利用本文所述的实时cAMP检测方法，我们使用30 µM麝香酮对人类嗅觉受体（OR）文库进行了筛选（图1）。在检测的379种人类OR中，OR5AN1对麝香酮表现出显著响应，而其他OR以及阴性对照（无气味刺激对照和空载体.......

讨论

准确测量某一嗅觉受体（OR）在特定气味分子作用下的激活情况，是解析嗅觉信息编码的首要步骤。本研究展示的实验示例了如何利用一种方法来鉴定 体外 OR表达系统，筛选人类OR基因库中对该目标气味化学物质有响应的嗅觉受体，随后利用不同浓度的该化学物质表征受体的药理学特性。我们的结果证实OR5AN1是一种 真正有效的 麝香酮受体。这与之前的一项报道一致³⁹ 并为“仅有少量受体参与麝香气味感知”这一推测提供了进一步证据^27,40与佐藤-秋原的筛查数据相比 等 在使用萤光素酶检测法于相似或异源表达系统中进行检测时，我们的筛选结果显示信噪比较低。除不同技术本身固有的差异外，结果差异可能源于我们采用了较低的麝香酮浓度（30 µM）。 与 100 µM）。事实上，EC₅₀ OR5AN1 对麝香酮的浓度-反应曲线经实时 cAMP 检测法测得的值，与 Sato-Akuhara 所获得的值处于同一数量级 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP试剂	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP质粒	Promega	E1171
Hana3A细胞			可根据要求向作者索取
不含钙或镁的HBSS	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R质粒			克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
含EBSS和L-谷氨酰胺的MEM	Hyclone	SH30024
麝香酮	Santa Cruz	sc-200528
西藏麝香酮	Sigma-Aldrich	S359165
OR质粒			用Rho标签克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
不含钙或镁的PBS	Cellgro	21-040-CV
青霉素-链霉素	Hyclone	SV30010
质粒小提试剂盒	Tiangen	DP103-03
嘌呤霉素	Sigma	P8833
RTP1S质粒			克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中
胰蛋白酶-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2 mL PCR管	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL Eppendorf管	Eppendorf
15 mL 17 mm × 120 mm锥形管	BD Falcon	352096
8通道和/或12通道多通道移液器	Eppendorf
96孔平底白色细胞培养板	Greiner	655098
100 mm × 20 mm细胞培养皿	BD Falcon	353003
带有层流的II级生物安全柜
细胞培养孵育箱，含5% CO2
离心机，配备适用于15 mL锥形管的摆动桶转子
Infinite F200酶标仪	Tecan
配备×10和×20物镜的相差显微镜
分光光度计
用于多通道分配的无菌试剂储液槽
无菌纸巾