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一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

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DOI：

10.3791/55833

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2017年12月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Clinical Microbiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。

摘要

抗体滴度通常被用作评估针对流感及其他病原体血清学保护效果的替代指标。要理解疫苗诱导的免疫反应，必须详细了解接种疫苗前后抗体的产生情况。本文介绍了一种可靠的逐点操作方案，用于测定流感特异性抗体滴度。第一个方案描述了确定血凝反应所需抗原量的方法，从而为后续第二个方案（血凝试验，HA试验）中的抗原浓度提供标准化依据。第二个方案描述了通过系列稀释人血清或细胞培养上清液，定量检测针对不同病毒株的流感特异性抗体滴度的方法（血凝抑制试验，HI试验）。

作为一个应用实例，我们展示了健康人群在接受三价灭活流感疫苗后产生的抗体反应。此外，还展示了不同流感病毒之间的交叉反应性，并解释了通过使用不同种类动物的红细胞（RBCs）来减少交叉反应性的方法。讨论部分重点分析了所介绍检测方法的优缺点，以及流感特异性抗体滴度的测定如何有助于加深对疫苗相关免疫的理解。

引言

流感病毒感染与较高的发病率、死亡率以及高昂的医疗费用密切相关1,2,3,4尤其是老年人、新生儿、孕妇以及慢性病患者，面临更严重临床后果的风险。因此，针对流行流感病毒株接种疫苗是降低这些高危人群疾病负担的主要措施。接种疫苗后个体免疫反应的增强， 例如，高于保护性阈值的流感特异性抗体可降低个体感染风险，并普遍降低病毒在人群中的传播可能性5在不同人群及各个年龄组中，深入理解疫苗诱导的体液免疫应答是回答重要临床问题的关键环节。6,7,8,9，例如：为何一些老年患者在既往接种疫苗后仍会发生感染？什么是 "良好" 和 "充足" 疫苗诱导的保护效果如何？对于免疫功能低下患者，应以何种频率接种疫苗才能达到保护性抗体滴度？最有效的剂量是多少？新型佐剂对疫苗接种后抗体滴度有何影响？检测疫苗特异性抗体的产生情况有助于回答这些关键问题，并改善疫苗接种效果。

病毒特异性抗体滴度的定量可通过多种免疫学方法进行，包括固相10 或基于微珠的ELISA11 检测，血凝抑制试验12和中和实验13基于ELISA的方法可用于对大量血清样本进行多种抗原的筛查，并可分别检测病原体特异性的免疫球蛋白（Ig）M和IgG。尽管抗原的特性 例如线性氨基酸序列或病毒样颗粒可能影响抗体的结合，潜在表位的范围非常广泛，且无法提供抗体反应是否具有功能相关性的信息。

相比之下，中和试验用于确定抗体在功能上抑制细胞感染的能力，因此可反映其潜在的中和活性。然而，该方法劳动强度大，需要培养特定的细胞系和活病毒，因此耗时较长、成本较高，且需要特殊设备。

本文介绍了一种基于世界卫生组织（WHO）的血凝抑制（HI）实验方案12，用于定量检测流感特异性抗体滴度。血凝是某些病毒的特征性效应，可导致红细胞发生凝集。利用患者血清抑制该效应，可测定具有抑制能力的抗体浓度，从而反映其中和作用。

我们已对世界卫生组织（WHO）方案的工作流程进行了改进，以便更高效地同时处理多个样本，从而缩短所需时间。第一个方案描述了特定流感抗原凝集能力的测定方法。通过该步骤，可确定第二个方案所需的正确流感抗原浓度。每次使用新的病毒抗原或每批血液时，均应重复此部分操作。

第二个方案描述了流感特异性抗体滴度的测定。所展示的方案已针对流感病毒和人血清样本的检测进行了优化，但也可适用于小鼠血清样本或经刺激的免疫细胞的细胞培养上清液。 例如，病毒特异性B细胞。结果可表示为绝对测定滴度。在许多疫苗研究中，通常会展示每个特定人群的几何平均滴度及其95%置信区间。在结果解读中，常使用血清保护或血清转化来描述人群对某种病毒的易感性。血清保护定义为滴度≥1:40，血清转化则定义为两次时间点之间（最常见的是接种前与接种后30天）滴度升高超过4倍，并达到血清保护水平的滴度。

两种方案均易于使用，且可针对广泛的研究问题进行调整。特别是，它们可用于可靠且快速地确定 针对具有血凝能力的多种其他病毒（如麻疹病毒、多瘤病毒、腮腺炎病毒或风疹病毒）的抗体滴度14,15,16.

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方案

研究方案已获得当地伦理审查委员会（www.EKNZ.ch）的批准，并已从所有参与者处获得书面知情同意书。

1. 血清采集

  1. 在感兴趣的时间点采集人类血清样本。本研究中，我们在接种流感疫苗当天（第0天）以及接种后第7天、第30天、第60天和第180天采集血清。
  2. 为获取血清，将样本管在室温（20 - 25 °C）下以1,200 × g离心10分钟。
    注意：未离心的血液样本应保存在4 °C，且保存时间不应超过24小时。
  3. 将血清分装至不同的试管（冻存管）中，并在-80 °C冷冻保存直至使用。
  4. 后续检测应成批进行，同一位受试者的各个时间点样本应一同检测，以减少个体内的变异。

2. 抗原的制备

警告：使用五种不同的抗原（参见材料表）。抗原应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行制备。

  1. 根据制造商说明书，用 1.0 mL 蒸馏水重悬一支冻干流感抗原安瓿瓶中的全部内容物，并在室温下静置至少 5 分钟，然后再进行后续操作。
  2. 将抗原溶液分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -80 °C 冻存，直至进一步使用。

3. 霍乱滤液的制备

注意：根据世界卫生组织（WHO）方案12，霍乱滤液被用作受体破坏酶（RDE），以去除血清中会干扰检测的天然抑制物17。

  1. 根据制造商说明书重新溶解冻干的 RDE。
  2. 将 RDE 溶液置于 15 mL 离心管中，于 4 °C 保存，待后续使用。

4. HA 测定

注意：为了确保多个检测板之间的血凝抑制（HI）实验结果具有可比性，每块板必须使用相同数量的病毒颗粒。通过血凝试验（也称为血凝滴定）来定量能够引起红细胞凝集的病毒颗粒数量，并以血凝单位（HA单位）表示。一个血凝“单位”是依赖于所用血凝滴定方法的操作性单位，并非病毒绝对数量的测量值。因此，一个HA单位定义为能够凝集等体积标准化红细胞悬液所需的病毒量。根据世界卫生组织（WHO）的标准，HI试验中使用的标准量为每25 µL含4 HA单位。有关血凝试验原理的图示，请参见图1。

血凝抑制示意图；病毒、红细胞、抗体相互作用；免疫学结果。
图1：血凝及血凝抑制原理。 在无病毒和抗体的阴性对照情况下不发生血凝（左列），仅在存在流感病毒时红细胞发生血凝（中列）。然而，当流感病毒的血凝素被病毒特异性抗体阻断后，则不发生血凝现象（右列）。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：所使用的红细胞取决于检测中流感病毒的类型（表1）。此外，对于不同类型的96孔微量滴定板，孵育时间以及未发生凝集的细胞形态表现也有所不同（表2）。

流感抗原A/California/7/09 (H1N1)A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)A/Texas/50/2012 (H3N2)B/Brisbane/60/08B/Massachusetts/02/2012
红细胞物种鸡豚鼠豚鼠火鸡火鸡

表1：流感抗原及对应的红细胞物种。依据生产商说明书（NIBSC）。

红细胞物种ChickenTurkeyGuinea pigHuman type O
红细胞浓度 (v/v)0.75%0.75%1%1%
微量滴定板类型V 型底V 型底U 型底U 型底
室温孵育时间30 min30 min1 hour1 hour
未凝集细胞的外观Button*Button*halohalo

表2：使用不同物种红细胞的检测条件。 根据世界卫生组织（WHO）实验方案。（* 倾斜时流动）

  1. 红细胞悬液的制备
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释红细胞储备悬液（10%，v/v；人O型血除外）（参见材料表），分别配制鸟类和哺乳类红细胞所需浓度为0.75%和1%的悬液。

血凝试验示意图；连续稀释法；抗原检测；PBS、红细胞溶液步骤。
图 2：血凝试验的板式设计。 血凝滴定实验设两个重复。对照行中未添加抗原。有关最佳抗原浓度的确定，请参见图 4。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 96孔微量滴定板的制备
    注：有关板设计的概述，请参见 图2 。
    1. 使用多通道移液器，在96孔微量滴定板每个使用行的第1至第12孔中各加入25 µL PBS（图2）。当使用禽类红细胞（如鸡和火鸡）时，使用V型微量滴定板；当使用哺乳动物红细胞（如豚鼠和人O型红细胞）时，使用U型微量滴定板（Table 2）。
    2. 将25 µL流感抗原加入抗原检测行的第一孔中，抗原检测行需设置成复孔。对照行不加抗原。对照行不应出现血凝现象，作为阴性对照（图2）。
    3. 使用多通道移液器，从抗原检测行的第一孔开始，将25 µL液体依次转移至后续各孔，进行连续的2倍系列稀释。每次稀释后，轻柔地上下吹吸混匀10次。
    4. 弃去最后一孔中多余的25 µL液体。
    5. 使用多通道移液器，在每个使用行的第1至第12孔中再加入25 µL PBS，使每孔总体积达到50 µL。
    6. 使用多通道移液器，向每个使用孔中加入50 µL红细胞悬液。
    7. 轻轻在四个侧面上将板轻敲10次，以充分混匀。
    8. 用盖子盖好板，于室温下孵育适当时间，具体时间取决于所用红细胞的物种（见 Table 2）。孵育期间避免移动板。

血凝试验结果示意图；微量滴定板中的凝集模式；完全凝集、部分凝集、无凝集。
图3：禽类与哺乳类红细胞的凝集模式。 在使用禽类红细胞时，采用V型微量滴定板。读取结果时将板倾斜，未发生凝集的红细胞会沿底部下滑，形成泪滴状。在使用哺乳类红细胞时，则采用U型微量滴定板，读取结果时板保持水平，未凝集的红细胞形成一个小环状。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 读取酶标板结果
    注意：由于微孔板孔型不同，使用禽类红细胞（RBCs）时的读数与哺乳类红细胞略有差异（图3）。
    1. 禽类红细胞的读数
      1. 将酶标板倾斜90°，持续25秒。
        ​注意：倾斜酶标板对于区分禽类红细胞的凝集模式至关重要，因为三种不同的凝集模式（完全凝集、部分凝集和无凝集）在未倾斜时均呈现为底部的一个点状团块。
      2. 在酶标板仍处于倾斜状态时，立即在96孔板的打印图上标记结果。禽类红细胞的凝集模式见图3。
    2. 哺乳类红细胞的读数
      1. 在不倾斜酶标板的情况下（即平放在实验台上的水平位置），直接在96孔板的打印图上记录结果。
        注意：发生血凝时，凝集的细胞不会沉降到孔底，而非凝集的细胞则在孔底形成光环状。部分凝集细胞形成的光环较弱且直径更大（图3）。
    3. 确定4个血凝单位（HA单位）。
      注意：血凝滴定终点是指最后一个出现完全血凝的孔，该孔含有1个HA单位的病毒。由于抗原进行了2倍系列稀释，因此在血凝滴定终点前两个孔即为含有4个HA单位病毒的孔（图4）。

血凝试验示意图；抗原-抗体相互作用、滴度结果、抗原定量。
图 4：利用禽类红细胞进行血凝滴定以确定 4 个血凝单位滴度的读数结果。 血凝试验（抗原滴定试验）用于测定引起完全血凝所需的最适抗原量。完全血凝发生的最后一个孔即为血凝滴定终点，其中含有 1 个血凝单位（HA unit）。由于抗原进行了 2 倍系列稀释，在血凝滴定终点前两个孔的抗原滴度对应为 4 个血凝单位。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 血凝抑制试验

注意：本实验方案的工作流程已优化，通过使用PCR管条和热循环仪（见下文），可同时更高效地处理多个样本。

  1. 血清样本的制备
    注意：应在生物安全二级（BSL-2）实验室中制备血清样本。
    1. 在室温下解冻每个人的各个时间点的冷冻血清样本（见步骤1.2）。
    2. 使用多通道移液器，将每份解冻后的血清样本各取10 µL，加入一条PCR管条（每条含10个管）中的对应管内。
      注意：使用PCR管条的主要优势在于，后续血凝抑制（HI）实验步骤中可使用多通道移液器，这在处理大量血清样本或对同一样本重复检测针对不同病毒株的抗体滴度时，可显著节省时间。
    3. 将分装后的血清样本保存于PCR管条中，并置于-80 °C冰箱中，直至使用。
    4. 在进行HI实验的前一天，将目标血清样本分装物在室温下解冻。
    5. 向一个空的PCR管中加入10 µL相应的抗血清。
      注意：作为阳性对照，抗血清必须与所用病毒相匹配。阳性对照有助于在多块实验板之间实现板间性能的标准化。
    6. 使用多通道移液器，向每份血清分装物及抗血清中各加入30 µL霍乱滤液溶液（即每1体积血清加入3体积霍乱滤液）。
    7. 将PCR管置于PCR 96孔板架或空的吸头盒中，涡旋振荡5秒。
    8. 使用热循环仪，在37 °C条件下孵育样本过夜。
    9. 使用热循环仪，在56 °C条件下孵育样本30分钟，以灭活霍乱滤液。
      注意：根据所用热循环仪的型号，此步骤可编程设置，以进一步实现流程自动化。
    10. 将PCR管置于PCR 96孔板架或空的吸头盒中，涡旋振荡5秒。
    11. 将样本置于4 °C冰箱中保存，直至用于HI实验。

使用抗血清回滴定法进行抗体效价分析的连续稀释实验示意图。
图 5：血凝抑制试验的板式设计与实验流程。 一块板可同时检测两位受试者共五个时间点的样本。血凝抑制效价范围为 8 至 1,024。以针对所用抗原的抗血清作为阳性对照，并进行回滴定以确认抗原稀释度是否等于 4 个血凝单位（HA 单位）。图中展示了两名个体疫苗接种者血清样本的连续稀释过程。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. HI试验
    注意：有关血凝抑制试验原理的图示，请参见 图1根据病毒种类的不同，血凝试验中会使用不同物种的红细胞（RBCs）表1）。不同种类的红细胞用于不同类型的96孔板，且孵育时间以及未凝集细胞的形态表现也有所不同（表 2）。对于血凝抑制（HI）试验，将4个血凝单位（HA单位）的病毒或抗原加入样本的2倍系列稀释液中。
    1. 抗原溶液的制备
      1. 根据所用 96 孔板的数量计算所需抗原溶液的体积（25 µL 每孔抗原量 × 96 = 2,400 µL 每96孔板加入抗原；添加 100 µL 每块板因使用多通道移液器储液槽而额外增加；每块板共需抗原2.5 mL。
        注意：例如，若要检测100个血清样本，则需要10块板（每板10个样本）：2.5 mL × 10 = 总共需要25 mL抗原溶液。
      2. 使用 PBS 为计算出的体积配制适当稀释度的 4 HA 单位。
        注意：血凝（HA）试验中确定为4个血凝单位。要获得合适的抗原量，需将计算出的体积除以对应于4个血凝单位的滴度。例如，4个血凝单位对应1/64的稀释度，此时我们需要 15,000 µL 需要抗原溶液的量为：15,000/64 = 234.4 µL 加入溶解的冻干流感抗原。
    2. 红细胞悬液的制备
      1. 根据所使用的96孔微孔板数量计算所需红细胞悬液的体积（50 µL 每孔红细胞悬液 × 96 = 4,800 µL 每块96孔板加入红细胞悬液；添加 200 µL 每块板额外增加（由于多通道移液器使用了试剂储液槽）。
      2. 将红细胞储备悬液（通常为10% v/v，人O型血除外）用PBS稀释，分别配制成禽类和哺乳类红细胞所需的0.75%和1%浓度。
    3. 96孔微孔板的制备
      1. 标记96孔微孔板（样本编号、阳性对照和回滴定）。请检查酶标板的方向 图5 仔细地。
      2. 添加 25 µL PBS，但“回滴定”行的第一孔除外（图5, 12th 使用多通道移液器进行操作。
        注意：通过返滴定法检测所用抗原稀释度是否等于4 HA单位。若在“返滴定”行的前三个孔中发生血凝，而第四个孔中无血凝，则表明抗原滴度为4 HA单位。
      3. 添加 50 µL 将制备的抗原溶液（见5.2.1）加入“反向滴定”行（12）的第一个孔中th 行
      4. 添加 25 µL 使用多通道移液器将经RDE处理的血清样本加入每块板第1至第10行的第一孔中。
      5. 添加 25 µL 将适量的相应抗血清加入到第11排的第一个孔中th 作为阳性对照
      6. 进行连续2倍稀释，通过转移 25 µL 从每行（1 - 12）的第一个孔开始，使用多通道移液器依次移液至后续各孔。每次稀释步骤通过上下吹打10 - 15次混匀。每个样本的各稀释步骤可使用同一吸头。
      7. 弃去最终的 25 µL 最后一个孔。
      8. 添加 25 µL 使用多通道移液器将抗原溶液加入第1至第11行各孔（血清样本和抗血清）中。若枪头未接触孔壁，可重复使用。
      9. 添加 25 µL 用 PBS 代替抗原加入至“回滴定”行（12）的每孔中th 行
      10. 轻轻敲击平板的四个侧面，每侧10次，以混匀。
      11. 用盖子盖住培养板，在室温下孵育30分钟。孵育期间请勿移动培养板。
      12. 添加 50 µL 每孔加入 RBC 悬液。
      13. 轻轻敲击平板的4个侧面，每侧10次，以混匀。
      14. 用盖子盖住培养板，根据所使用的红细胞物种在室温下孵育适当的时间（参见 表2孵育期间请勿移动培养板。
    4. 读取酶标板
      注意：HI滴度是指能够完全抑制血凝的（抗）血清最高稀释度的倒数。需要注意的是，经RDE处理的血清初始已稀释为1:4，在进行系列稀释步骤后，第一孔中的血清稀释度为1:8，对应的HI滴度为8。
      1. 禽类红细胞的检测
        1. 倾斜培养板 90° 25 秒。
          注意：倾斜平板对于区分禽类凝集模式至关重要，因为三种不同的凝集模式（完全凝集、部分凝集和无凝集）在未倾斜时均呈现为团块状。
        2. 立即在96孔板的打印示意图上标记结果，此时平板仍处于倾斜状态。禽类红细胞的凝集模式如下所示 图3.
      2. 哺乳动物红细胞的检测读出
        1. 在96孔板的打印示意图上标记结果，标记时勿倾斜孔板。
          注意：当发生血凝反应时，凝集的细胞不会沉降到底部，而非凝集的细胞则在孔底形成晕环状。部分凝集细胞的晕环强度较弱，且直径较大（图3).
        2. 确定每个样本的HI值，并将其录入计算机表格中（图6)
        3. 注意：部分凝集的孔判定为较低滴度。例如，若血清样本在第4孔（1:64稀释）仍完全抑制血凝，而第5孔th 若某孔（1:128 稀释度）出现部分凝集，则血凝抑制滴度在最终分析中确定为较低的滴度 64（图6, 4th 行

血凝抑制试验图表、血清滴度结果、病毒-宿主相互作用研究。
图 6：使用禽类红细胞进行的血凝抑制（HI）试验结果读取。 通过血凝抑制（HI）试验测定疫苗接种前和接种后诱导产生的流感特异性抗体反应。在此示例中，个体一的 HI 滴度高于个体二。两名个体在接种疫苗后均显示出抗体反应；但在接种疫苗后 180 天，两人的抗体滴度均再次下降。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

流感疫苗接种前后针对甲型流感 H3N2 的抗体反应
在2014/2015流感季节之前，对26名健康志愿者接种含甲型流感A/H1N1/California/2009、A/H3N2/Texas/2012和B/Massachusetts/02/2012的灭活三价亚单位流感疫苗后诱导的抗体反应进行了评估。图6展示了其中2名疫苗接种者的代表性结果。值得注意的是，在该特定流感季节，A/H3N2/Texas/2012并未流行，取而代之的是略有不同的病毒株A/H3N2/Switzerland/2013。A/H3N2/Texas/2012与A/H3N2/Switzerland/2013的病毒血凝素氨基酸序列具有97%的一致性，仅在11个氨基酸位点上存在差异（见表4），这些位点在图7中已标出。

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讨论

定量检测接种疫苗前后流感病毒特异性抗体滴度是疫苗研究中必不可少的重要工具。根据血清保护（>1:40）或血清转化（抗体滴度升高4倍）等替代指标来评估对病毒感染的保护效果，可优化疫苗接种策略9。采用所提供的实验方案可以测定：（i）特定病毒的血凝活性，以及（ii）目标病毒的抗体滴度。

修改与故障排除：

本方案基于世界卫生组织标准12我们通过使用PCR管条进行血清制备对方案进行了修改（见步骤5）。该改进显著减轻了工作量，并提高了检测通量。此外，在抗原滴定步骤中，我们将抗原用量减少了四分之一，长期来看具有成本效益。在RDE处理中可使用更少的血清量（10 µL），这在样本量有限时尤为有利例如，小鼠血清）。抗体检测板中包含反向滴定和阳性对照，作为适当的内部对照，并用于监测红细胞的老化情况。

此外，我们采用了与世界卫生组织（WHO）标...

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披露

A.E. 获得了“SNSF Ambizione Score”项目（PZ00P3_154709）、巴塞尔大学“Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte”、巴塞尔传染病基金会以及Bangeter Rhyner基金会的资助。L.K. 获得了奥地利格拉茨技术大学资助项目的资助。J.L. 感谢SystemsX.ch系统生物学项目（9）提供的iPhD奖学金支持。th 呼叫

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 ml 一次性多通道移液器储液槽Integra4312
8孔PCR管Brand GMBH781332用于血清分装
96孔U型微孔板TPP92097使用哺乳动物红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用
96孔V型微孔板Corning Costar3897使用禽类红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用
注射用水（Aqua ad iniect. Steril）Bichsel AG1000004用于配制流感抗原和霍乱滤液溶液
鸡红细胞（10%）CedarlaneCLC8800在Alsever's溶液中配制的10%鸡红细胞悬液
霍乱滤液Sigma-AldrichC8772用作受体破坏酶（RDE）
Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）Sigma-AldrichD8537用于稀释血清样本、红细胞和抗原
Eppendorf多通道移液器，12通道，10–100 µlSigma-AldrichZ683949
Eppendorf多通道移液器，8通道，10–100 µlSigma-AldrichZ683930
豚鼠红细胞（10%）CedarlaneCLC1800在Alsever's溶液中配制的10%豚鼠红细胞悬液
流感抗A/California/7/09 HA血清 NIBSC14/134 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照
流感抗A/Switzerland/9715293/2013样HA血清 NIBSC14/272用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照
流感抗A/Texas/50/2012样HA血清 NIBSC13/178用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照
流感抗B/Brisbane/60/2008-HA血清 NIBSC13/254 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照
流感抗B/Massachusetts/02/2012 HA血清 NIBSC13/182用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照
流感抗原A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) NIBSC12/168灭活的、部分纯化的A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) 病毒（约46µgHA/ml）
流感抗原A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88)NIBSC14/254灭活的、部分纯化的A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88)病毒（约55µgHA/ml）
流感抗原A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)NIBSC13/112灭活的、部分纯化的A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)病毒（约74µgHA/ml）
流感抗原B/Brisbane/60/2008NIBSC13/234灭活的、部分纯化的B/Brisbane/60/2008病毒（约42µgHA/ml）
流感抗原B/Massachusetts/02/2012NIBSC13/134灭活的、部分纯化的B/Massachusetts/02/2012病毒（约35µgHA/ml）
血清管S-Monovette, Sardstedt01.1601.100用于含凝血激活剂的血清提取
单个供体人红细胞，O型Innovative ResearchIPLA-WB3 在Alsever's溶液中配制的单个供体人红细胞悬液（约26%）
火鸡红细胞（10%）CedarlaneCLC1180在Alsever's溶液中配制的10%火鸡红细胞悬液
磷酸盐缓冲盐水（PBS）Gibco

参考文献

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