本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。
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方法文章
一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
抗体滴度通常被用作评估针对流感及其他病原体血清学保护效果的替代指标。要理解疫苗诱导的免疫反应，必须详细了解接种疫苗前后抗体的产生情况。本文介绍了一种可靠的逐点操作方案，用于测定流感特异性抗体滴度。第一个方案描述了确定血凝反应所需抗原量的方法，从而为后续第二个方案（血凝试验，HA试验）中的抗原浓度提供标准化依据。第二个方案描述了通过系列稀释人血清或细胞培养上清液，定量检测针对不同病毒株的流感特异性抗体滴度的方法（血凝抑制试验，HI试验）。
作为一个应用实例，我们展示了健康人群在接受三价灭活流感疫苗后产生的抗体反应。此外，还展示了不同流感病毒之间的交叉反应性，并解释了通过使用不同种类动物的红细胞（RBCs）来减少交叉反应性的方法。讨论部分重点分析了所介绍检测方法的优缺点，以及流感特异性抗体滴度的测定如何有助于加深对疫苗相关免疫的理解。
引言
流感病毒感染与较高的发病率、死亡率以及高昂的医疗费用密切相关1,2,3,4尤其是老年人、新生儿、孕妇以及慢性病患者，面临更严重临床后果的风险。因此，针对流行流感病毒株接种疫苗是降低这些高危人群疾病负担的主要措施。接种疫苗后个体免疫反应的增强， 例如，高于保护性阈值的流感特异性抗体可降低个体感染风险，并普遍降低病毒在人群中的传播可能性5在不同人群及各个年龄组中，深入理解疫苗诱导的体液免疫应答是回答重要临床问题的关键环节。6,7,8,9，例如：为何一些老年患者在既往接种疫苗后仍会发生感染？什么是 "良好" 和 "充足" 疫苗诱导的保护效果如何？对于免疫功能低下患者，应以何种频率接种疫苗才能达到保护性抗体滴度？最有效的剂量是多少？新型佐剂对疫苗接种后抗体滴度有何影响？检测疫苗特异性抗体的产生情况有助于回答这些关键问题，并改善疫苗接种效....
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方案
研究方案已获得当地伦理审查委员会（www.EKNZ.ch）的批准，并已从所有参与者处获得书面知情同意书。
1. 血清采集
- 在感兴趣的时间点采集人类血清样本。本研究中，我们在接种流感疫苗当天（第0天）以及接种后第7天、第30天、第60天和第180天采集血清。
- 为获取血清，将样本管在室温（20 - 25 °C）下以1,200 × g离心10分钟。
注意：未离心的血液样本应保存在4 °C，且保存时间不应超过24小时。 - 将血清分装至不同的试管（冻存管）中，并在-80 °C冷冻保存直至使用。
- 后续检测应成批进行，同一位受试者的各个时间点样本应一同检测，以减少个体内的变异。
2. 抗原的制备
警告：使用五种不同的抗原（参见材料表）。抗原应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行制备。
- 根据制造商说明书，用 1.0 mL 蒸馏水重悬一支冻干流感抗原安瓿瓶中的全部内容物，并在室温下静置至少 5 分钟，然后再进行后续操作。
- 将抗原溶液分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -80 °C 冻存，直至进一步使用。
3. 霍乱滤液的制备
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
流感疫苗接种前后针对甲型流感 H3N2 的抗体反应
在2014/2015流感季节之前，对26名健康志愿者接种含甲型流感A/H1N1/California/2009、A/H3N2/Texas/2012和B/Massachusetts/02/2012的灭活三价亚单位流感疫苗后诱导的抗体反应进行了评估。图6展示了其中2名疫苗接种者的代表性结果。值得注意的是，在该特定流感季节，A/H3N2/Texas/2012并未流行，取而代之的是略有不同的病毒株A/H3N2/Switzerland/2013。A/H3N2/Texas/2012与A/H3N2/Switzerland/2013的病毒血凝素氨基酸序列具有97%的一致性，仅在11个氨基酸位点上存在差异（见表4），这些位点在图7中已标出。
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讨论
定量检测接种疫苗前后流感病毒特异性抗体滴度是疫苗研究中必不可少的重要工具。根据血清保护（>1:40）或血清转化（抗体滴度升高4倍）等替代指标来评估对病毒感染的保护效果，可优化疫苗接种策略9。采用所提供的实验方案可以测定：（i）特定病毒的血凝活性，以及（ii）目标病毒的抗体滴度。
修改与故障排除：
本方案基于世界卫生组织标准12我们通过使用PCR管条进行血清制备对方案进行了修改（见步骤5）。该改进显著减轻了工作量，并提高了检测通量。此外，在抗原滴定步骤中，我们将抗原用量减少了四分之一，长期来看具有成本效益。在RDE处理中可使用更少的血清量（10 µL），这在样本量有限时尤为有利例如，小鼠血清）。抗体检测板中包含反向滴定和阳性对照，作为适当的内部对照，并用于监测红细胞的老化情况。
此外，我们采用了与世界卫生组织（WHO）标.......
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披露
A.E. 获得了“SNSF Ambizione Score”项目（PZ00P3_154709）、巴塞尔大学“Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte”、巴塞尔传染病基金会以及Bangeter Rhyner基金会的资助。L.K. 获得了奥地利格拉茨技术大学资助项目的资助。J.L. 感谢SystemsX.ch系统生物学项目（9）提供的iPhD奖学金支持。th 呼叫
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 ml 一次性多通道移液器储液槽 | Integra | 4312 | |
| 8孔PCR管 | Brand GMBH | 781332 | 用于血清分装 |
| 96孔U型微孔板 | TPP | 92097 | 使用哺乳动物红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用 |
| 96孔V型微孔板 | Corning Costar | 3897 | 使用禽类红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用 |
| 注射用水（Aqua ad iniect. Steril） | Bichsel AG | 1000004 | 用于配制流感抗原和霍乱滤液溶液 |
| 鸡红细胞（10%） | Cedarlane | CLC8800 | 在Alsever's溶液中配制的10%鸡红细胞悬液 |
| 霍乱滤液 | Sigma-Aldrich | C8772 | 用作受体破坏酶（RDE） |
| Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | 用于稀释血清样本、红细胞和抗原 |
| Eppendorf多通道移液器，12通道，10–100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf多通道移液器，8通道，10–100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| 豚鼠红细胞（10%） | Cedarlane | CLC1800 | 在Alsever's溶液中配制的10%豚鼠红细胞悬液 |
| 流感抗A/California/7/09 HA血清 | NIBSC | 14/134 | 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照 |
| 流感抗A/Switzerland/9715293/2013样HA血清 | NIBSC | 14/272 | 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照 |
| 流感抗A/Texas/50/2012样HA血清 | NIBSC | 13/178 | 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照 |
| 流感抗B/Brisbane/60/2008-HA血清 | NIBSC | 13/254 | 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照 |
| 流感抗B/Massachusetts/02/2012 HA血清 | NIBSC | 13/182 | 用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照 |
| 流感抗原A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | 灭活的、部分纯化的A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) 病毒（约46µgHA/ml） |
| 流感抗原A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | 灭活的、部分纯化的A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88)病毒（约55µgHA/ml） |
| 流感抗原A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | 灭活的、部分纯化的A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)病毒（约74µgHA/ml） |
| 流感抗原B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | 灭活的、部分纯化的B/Brisbane/60/2008病毒（约42µgHA/ml） |
| 流感抗原B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | 灭活的、部分纯化的B/Massachusetts/02/2012病毒（约35µgHA/ml） |
| 血清管 | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | 用于含凝血激活剂的血清提取 |
| 单个供体人红细胞，O型 | Innovative Research | IPLA-WB3 | 在Alsever's溶液中配制的单个供体人红细胞悬液（约26%） |
| 火鸡红细胞（10%） | Cedarlane | CLC1180 | 在Alsever's溶液中配制的10%火鸡红细胞悬液 |
| 磷酸盐缓冲盐水（PBS） | Gibco |
参考文献
- Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al.
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重印与许可
