全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

摘要

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。

摘要

全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用图谱对于理解基因调控、染色质重塑及其他染色质相关过程至关重要。通过甲醛交联、染色质免疫沉淀及高通量测序（X-ChIP-seq）的方法，已在基因组生物学领域获得诸多重要发现。然而，X-ChIP-seq存在明显的局限性，主要与交联和超声处理相关。天然染色质免疫沉淀（Native ChIP）通过省略交联步骤避免了这些缺陷，但通常导致染色质结合蛋白的回收率较低。此外，所有基于ChIP的方法均受限于抗体质量的影响。近年来，也发展了利用将目标蛋白与DNA修饰酶融合的酶学方法来绘制蛋白质-DNA相互作用图谱。我们近期将其中一种方法——染色质内源性切割技术（chromatin endogenous cleavage, ChEC）与高通量测序相结合，建立了ChEC-seq技术。ChEC-seq依赖于将目标染色质相关蛋白与微球菌核酸酶（MNase）融合，在活细胞中钙离子存在条件下实现靶向DNA切割。ChEC-seq不依赖免疫沉淀，因而规避了交联、超声处理、染色质溶解以及抗体质量等潜在问题，同时能够以高分辨率实现背景信号极低的精确图谱绘制。我们预期ChEC-seq将成为ChIP技术的有力补充，为验证ChIP-seq结果以及发现基因组调控新机制提供一种独立且可靠的方法。

引言

绘制转录因子（TFs）、染色质重塑因子及其他染色质相关调控因子的结合位点，是理解所有基于染色质过程的关键。尽管染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）方法已被用于获得基因组生物学中的许多重要发现，但其存在显著局限性。我们近期提出了一种替代方法，称为染色质内源性切割结合高通量测序（ChEC-seq）¹，以克服这些缺点。

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）通常首先进行甲醛交联（X-ChIP-seq），以稳定蛋白质-DNA相互作用。然而，近年来多项研究表明，X-ChIP-seq会捕获短暂或非特异性的蛋白质-DNA相互作用^{2,3,4,5,6,7,8}，从而导致假阳性结合位点的出现。此外，在X-ChIP-seq实验中常用的超声处理用于染色质片段化，但其优先剪切开放染色质区域，导致这些区域的片段回收存在偏差^9,10。超声处理还会产生长度不均一的片段混合物，最终限制结合位点的分辨率，尽管加入外切核酸酶消化步骤可显著提高分辨率^11,12。天然ChIP方法，例如通过亲和纯化天然分离染色质获得的基因组占据区域（ORGANIC）¹³，不使用交联，并利用微球菌核酸酶（MNase）对染色质进行片段化，从而避免了甲醛交联和超声处理可能带来的偏差。然而，在天然染色质提取所需的相对温和条件下，许多染色质结合蛋白的溶解性较差，可能导致动态范围降低和/或出现假阴性结果¹⁴。

尽管ChIP-seq的多种变体是全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用最常用的方法，但已有若干基于将目标蛋白质与不同DNA修饰酶融合的绘图技术被开发和应用。其中一种方法是DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DNA adenine methyltransferase identification, DamID）¹⁵，该方法将感兴趣的染色质结合蛋白在基因上与Dam融合，并在细胞或动物体内表达该融合蛋白，从而导致该蛋白结合位点附近的GATC序列发生甲基化。DamID的优势在于不依赖免疫沉淀，因此无需交联、抗体或染色质溶解步骤，且可在活体（in vivo）条件下进行。然而，DamID的分辨率仅限于千碱基（kilobase）尺度，且Dam融合蛋白的甲基化活性是组成型的。另一种基于酶融合的方法是Calling Card-seq¹⁶，该方法将目标因子与转座酶融合，从而引导转座子在特定基因组位点的整合。与DamID类似，Calling Card-seq不依赖免疫沉淀，因而具有相似的优势，并且分辨率更高。然而，Calling Card-seq可能受到转座酶序列偏好性的限制，且其效率还依赖于转座子插入位点附近是否存在合适的限制性酶切位点。

Laemmli 实验室开发的第三种酶融合方法是染色质内源性切割技术（chromatin endogenous cleavage, ChEC）¹⁷。在 ChEC 中，将染色质相关蛋白与 MNase 的融合蛋白在细胞中表达，加入钙离子以激活 MNase，从而在标记因子结合位点附近切割 DNA（图 1）。结合 Southern 印迹技术，ChEC 已被用于表征酵母中多个特定基因座的染色质结构和蛋白质结合情况^17,18，并已与低分辨率微阵列分析相结合，用于研究核孔复合物组分与酵母基因组的相互作用¹⁹。ChEC 具有与 DamID 和 Calling Card-seq 类似的优点，当采用引物延伸法分析时，其分辨率接近单碱基对¹⁹。此外，ChEC 具有可调控性：MNase 介导的强烈 DNA 切割依赖于毫摩尔浓度钙离子的添加，从而确保在活体酵母细胞内低游离钙浓度条件下 MNase 保持无活性²⁰。

此前，我们曾提出将ChEC与高通量测序技术（ChEC-seq）相结合，可获得转录因子结合位点的高分辨率图谱。事实上，ChEC-seq已成功生成了芽殖酵母中通用调控因子（GRFs）Abf1、Rap1和Reb1在整个基因组范围内的高分辨率结合图谱¹。我们还成功将ChEC-seq应用于模块化的中介复合物（Mediator complex）——一种保守且必需的全局转录共激活因子²¹，从而拓展了ChEC-seq在不直接接触DNA、且难以通过基于ChIP的方法进行定位的兆道尔顿级复合物上的应用。ChEC-seq不仅可用于独立验证ChIP-seq结果，还能为染色质相关过程的调控机制提供新的见解。本文中，我们提供了一套在芽殖酵母中实施该方法的逐步操作方案。

方案

1. 酵母菌株的构建

1. 构建一种酵母菌株，使其所含的目的因子带有MNase标签。
   1. 从目标载体中PCR扩增MNase标签盒（表1) 使用指定的反应混合物（表2）以及循环条件（表3)。取5 µL PCR反应产物与1 µL 6X DNA上样缓冲液混合，将每份PCR样品在0.8%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。预期扩增产物大小约为2.3 kb。
   2. 使用标准的醋酸锂转化法将扩增的标签盒转入目标菌株²² 并进行筛选。
   3. 通过菌落PCR验证标签盒的正确整合。
      1. 配制指定的反应混合物（表4用于筛选的菌落数量。使用前保持在冰上。
      2. 使用无菌牙签或移液器吸头，从每个菌落中挑取一部分接种至PCR管底部。
      3. 将挑取的菌落置于高火微波加热1分钟。
      4. 加入50 µL PCR混合液（表4将适量溶液加入每个微波处理后的菌落中，用移液器吹打混匀。按照指定的循环条件进行PCR反应。表5).
      5. 将50 µL PCR反应产物与10 µL 6X DNA上样缓冲液直接在每个PCR管中混合。取10 µL每种样品在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。预期扩增产物大小约为700 bp。
         注意：如有需要，可通过蛋白质印迹法验证MNase融合蛋白的适当表达。预期标签蛋白的分子量将发生约20.6千道尔顿的偏移。
2. 通过同源克隆将目标基因的启动子插入 pGZ136 载体（表 1），并按照步骤 1.1.2 进行转化与筛选，从而构建一个游离型 MNase 菌株。
   1. 或者，将目的基因的启动子与3xFLAG-MNase-SV40 NLS连接至质粒载体中，按步骤1.1.2进行转化与筛选，并在适当的筛选条件下培养菌株以维持质粒。

2. ChEC

1. 在进行ChEC实验的前一天下午或晚上，用携带MNase标签因子的菌株单菌落接种3 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基或适当的筛选培养基。将该培养物在30 °C、180 RPM振荡条件下过夜培养。
2. 在进行ChEC实验当天的早晨，将过夜培养物按OD₆₀₀为0.2–0.3的比例稀释至50 mL新鲜培养基中。在30 °C、180 RPM振荡条件下继续培养，直至OD₆₀₀达到0.5–0.7。当培养物接近目标OD₆₀₀时，将加热块或水浴预热至30 °C，并开始解冻缓冲液A的添加剂（表6）。
3. 为每份培养物准备5 mL含添加剂的缓冲液A（表6）。操作过程中将缓冲液A保持在室温（RT）。
4. 为每个待采集的时间点准备微量离心管，每管含90 µL终止液（表7）和10 µL 10% SDS。每分析一个新的因子时，需采集0 s、30 s、1 min、2.5 min、5 min和10 min时间点的样品。
5. 将培养物倒入50 mL锥形管中，在室温下以1,500 × g离心1分钟。
6. 用1 mL缓冲液A充分重悬细胞，并将重悬后的细胞转移至微量离心管中。在微量离心机中以1,500 × g、室温离心30秒，使细胞成团。
7. 吸除上清液，通过反复吹打用1 mL缓冲液A充分重悬细胞。在微量离心机中以1,500 × g、室温离心30秒，使细胞成团。重复此步骤一次。
8. 用570 µL缓冲液A充分重悬细胞。加入30 µL 2%洋地黄皂苷（终浓度为0.1%），颠倒混匀以促进细胞通透化。
9. 将细胞置于30 °C加热块或水浴中通透化5分钟。
10. 上下吹打反应液以确保细胞均匀分布。取100 µL通透化细胞作为阴性对照，加入含终止液和SDS的微量离心管中（步骤2.4），短暂涡旋混匀。
11. 向通透化细胞中加入1.1 µL 1 M CaCl₂（终浓度为2 mM）以激活MNase，快速颠倒数次或短暂涡旋混匀。立即将反应体系放回30 °C环境，并启动计时器。
12. 在每个待采集的时间点，上下吹打反应液以确保细胞均匀分布，然后取100 µL通透化细胞加入含终止液和SDS的微量离心管中，短暂涡旋混匀。每分析一个新的因子时，应采集0 s（未加CaCl₂ ）、30 s、1 min、2.5 min、5 min和10 min时间点的样品。
    注意：对于在30 °C下快速切割DNA的因子，可选择在较低温度下进行ChEC实验，以减缓MNase的切割动力学。
13. 所有时间点采集完毕后，向每个样品中加入4 µL 20 mg/mL蛋白酶K，短暂涡旋混匀，并在55 °C孵育30分钟。
14. 向每个样品中加入200 µL 25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，剧烈涡旋混匀，然后在微量离心机中以最大转速、室温离心5分钟。
15. 将各管中的水相（约150 µL）转移至新管。加入30 µg糖原和500 µL 100%乙醇，剧烈涡旋混匀，置于干冰中沉淀10分钟，或直至溶液变黏稠。
16. 在微量离心机中以最大转速、4 °C离心10分钟，沉淀DNA。
17. 弃去上清液，用1 mL室温70%乙醇洗涤沉淀。
18. 弃去乙醇，将管倒置并轻轻在纸巾上轻拍以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心，再用移液器小心吸除残余乙醇，注意勿扰动沉淀。将沉淀在室温下空气干燥5分钟。
19. 在沉淀干燥期间，配制主混合液，使每个干燥沉淀重悬于29 µL Tris（pH 8.0）和1 µL 10 mg/mL RNase A中。在37 °C消化RNA 20分钟。
20. 将1 µL 6× DNA上样染料与5 µL各样品混合，于1.5%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。

3. 大小筛选

注意：大小选择的目的是从待测序样本中去除多千碱基的基因组DNA片段，并富集约150 bp（相当于核小体DNA的大小）或更小的片段。在测序数据中，这些片段 <400 bp 的片段被富集，其中约核小体DNA大小（~150 bp）处出现显著峰，以及亚核小体片段的峰或宽分布。

1. 向每个样本中加入75 µL聚乙二醇（PEG）溶液中的固相可逆固定化（SPRI）磁珠²³ 上下吹打10次以混匀。室温孵育珠：DNA混合物5分钟。
2. 在SPRI磁珠孵育期间，为每个样本准备含有96 µL 10 mM Tris（pH 8.0）和4 µL 5 M NaCl的微量离心管。
3. 将离心管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁一侧。静置2分钟，使磁珠充分吸附在管壁一侧。
4. 将每份上清液转移至含有 Tris 和 NaCl 的新离心管中（步骤 3.2）。
5. 向每个样品中加入 200 µL 25:24:1 苯酚:氯仿:异戊醇，涡旋混匀，在微量离心机中以最大转速于室温离心 5 分钟。
6. 将每份水相移至新离心管中。加入30 µg糖原和500 µL 100%乙醇。在干冰中沉淀DNA 10分钟，或直至溶液变得黏稠。
7. 在4 °C下，以最大速度在微量离心机中离心10分钟，使DNA沉淀成团。
8. 弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。
9. 弃去乙醇，将离心管倒置并轻轻在纸巾上敲击以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心样品，用移液器小心吸除残留乙醇，注意勿扰动沉淀。将沉淀在室温下晾干5分钟。
10. 将干燥的沉淀物重悬于 25 µL Tris（pH 8.0）中。使用高灵敏度检测法测定样品浓度。在 TF ChEC 实验中，经片段大小选择后通常可回收 10–100 ng DNA。
11. 制备测序文库。文库制备方案不依赖于大小选择，如先前所述²⁴，适合对较宽范围片段大小（25-500 bp）进行测序。
12. 以双端模式进行序列文库测序。为实现高质量的读段比对，每端至少需要获得25个碱基的序列。每个ChEC样本测序100万至200万条读段即可提供足够的覆盖深度。
    注意：ChEC-seq 数据的分析是一个复杂的过程，超出本文范围。有关数据分析的详细信息可参见以往的出版物。^1,21，用于分析的自定义脚本可在 GitHub 上获取（https://github.com/zentnerlab/chec-seq）。HOMER²⁵ (http://homer.salk.edu) 也可用于 ChEC-seq 数据的命令行分析。

结果

在成功的ChEC实验中，通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA可观察到随着时间推移，DNA片段化程度呈现钙依赖性增加，表现为条带拖尾以及基因组DNA最终被完全消化。在某些情况下，经过长时间消化后，会出现类似于传统MNase消化所见的梯状条带。Reb1的ChEC分析即为此类情况，Reb1是一种结合于核小体缺失区（NDRs）的通用调控因子（图2）。我们发现，对于通用调控因子（GRFs），延长消化时间会导致在快速切割的结合位点处信号丢失¹。理想情况下，应选择基因组DNA条带变小且呈现高分子量拖尾的样本（例如Reb1 ChEC实验中30秒和1分钟时间点）用于测序，以避免因时间延长而导致信号丢失。

Reb1 ChEC-seq 实验中片段末端的可视化结果显示，与未添加钙离子的 Reb1-MNase 菌株以及经相同时间（30 秒）游离钙处理的游离 MNase 菌株所产生...

讨论

我们已证明，ChEC 可用于在染色质上定位多种类的酵母蛋白，并预计该方法将广泛适用于酵母中不同家族的转录因子（TFs）及其他染色质结合因子。ChEC-seq 的优势在于无需交联、染色质溶解或抗体。因此，ChEC 可避免 X-ChIP-seq 中可能存在的假象，例如超ChIPable假象^3,4，以及传统ChIP中因蛋白溶解不完全导致的假阴性结果¹⁴。ChEC-seq 的主要缺点与所有酶融合方法相同，即需要构建融合蛋白。在芽殖酵母中可快速实现，但在多细胞生物中则更为繁琐。ChEC-seq 的另一局限性是无法直接用于组蛋白修饰的分析。然而，可将组蛋白修饰结合结构域与MNase融合并表达，从而实现利用ChEC-seq进行组蛋白修饰的定位。在此基础上，已有研究利用表位标签标记的组蛋白修饰结合结构域进行ChIP-seq，以绘制全基因组范围内的组蛋白修饰图谱²⁶。

使用游离MNase对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
dNTPs	NEB	N0447
Q5 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0491L	其他高保真 DNA 聚合酶（如 Phusion）也可用于片段扩增。
TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA 聚合酶	NEB	M0273L
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合液	Sigma-Aldrich	11836170001	必须使用不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，以避免通过螯合 Ca2+ 抑制 MNase 的切割活性。
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin，高纯度	EMD Millipore	300410-250MG	通过将 20 mg Digitonin 溶解于 1 mL DMSO 中并剧烈涡旋，配制 2% 储存液。
蛋白酶 K，20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A，10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63880	可依据已发表的方案（参考文献 24）制备类似 Ampure 的磁珠。
MagneSphere 磁力架	Promega	Z5342