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使用渗透泵或直接肌肉注射皮下输注神经营养因子4可增强老年大鼠喉部肌肉功能 神经营养因子4、渗透泵、肌肉注射、喉肌、衰老、大鼠

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DOI：

10.3791/55837

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2017年6月13日

 ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过全身性和直接性应用神经营养因子4（NTF4）来重塑大鼠衰老喉部肌肉的实验方案。

摘要

老年性喉部功能障碍是导致老年人残疾的主要原因之一，可表现为发声障碍、吞咽困难以及气道保护反射丧失。目前尚缺乏针对年龄相关性喉肌功能障碍的有效治疗方法。神经营养因子参与肌肉神经支配及神经肌肉接头（NMJs）的分化过程，被认为可通过增加神经递质释放来增强神经肌肉传递功能。在衰老的大鼠喉肌中，神经肌肉接头（NMJs）体积变小、数量减少，并出现功能性去神经化的证据。本研究探讨NTF4在未来临床应用中作为改善老年人喉肌功能的潜在治疗手段。本文提供了系统性给药与直接注射NTF4的详细实验方案，用于评估衰老大鼠喉肌对NTF4干预的结构重塑能力。在该方法中，大鼠通过全身途径给予NTF4 通过 通过渗透泵或经声带直接注射给药。随后解剖喉部肌肉，用于组织学检查其形态及与年龄相关的去神经变化。

引言

喉部肌肉收缩迅速且稳定，但容易受到衰老的不利影响。这种持续的活动被认为是导致65岁以上人群出现声音障碍或吞咽困难的原因之一1,2,3,4,5,6,7。多种分子和病理生理机制参与了与年龄相关的功能障碍。这些机制可能包括喉黏膜重塑、肌纤维萎缩或丢失、肌纤维再生能力缺失或萎缩，从而导致声带弓形变以及声门闭合不全8,9,10,11。目前尚无经证实的药物疗法能够完全预防或逆转这些肌肉随年龄增长而发生的变化。

神经肌肉传递效能的调节可显著影响神经运动功能。神经营养因子家族包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NTF3）和NTF412,13。研究表明，神经营养因子能够调节突触效能1,4。肝细胞生长因子、转化生长因子β和成纤维细胞生长因子最近已用于人类声带瘢痕的治疗15-17。NTF4亦可调节神经肌肉接头（NMJ）的效能；缺乏NTF4的小鼠表现出神经肌肉接头解体11,18,19。这些研究为应用生长因子治疗衰老相关的喉肌疾病及去神经化病变带来了有前景的疗效。

向声带组织直接注射治疗药物在人类中并非前所未有。例如，目前局部注射肉毒杆菌毒素已被用作治疗影响喉部肌肉的神经性运动障碍的有效方法，如痉挛性发声障碍和双侧喉返神经麻痹20,21。透明质酸水凝胶是另一种可注射材料，用于治疗声带瘢痕和声门闭合不全22,23。注射性喉成形术可用于治疗多种言语交流障碍24。这些直接注射方法有望改善老年人群的发声功能和吞咽能力。

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方案

本实验方案使用6个月和30个月大的雄性Fischer 344-Brown Norway大鼠。大鼠来源于国家衰老研究所的啮齿类动物群。本研究选用大鼠是因为大鼠喉部结构在功能上与人类相似，均具有保护气道和产生物种特异性发声的作用。本研究遵循《公共卫生服务实验室动物人道护理与使用政策》（PHS Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）、《美国国立卫生研究院实验室动物护理与使用指南》（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）以及《动物福利法》（Animal Welfare Act, 7 U.S.C. et seq.）；动物使用方案已获得肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 大鼠的麻醉

  1. 通过将盐酸氯胺酮（分离麻醉剂）和盐酸赛拉嗪（镇静剂和镇痛剂）溶于缓冲生理盐水中来配制麻醉剂。最终溶液中氯胺酮和赛拉嗪的浓度分别为每公斤体重100 mg和8 mg。
  2. 使用带有25 G针头的注射器，通过腹腔注射方式将麻醉剂注入大鼠体内。
  3. 用镊子轻夹大鼠脚趾或足部，以判断其是否已充分麻醉。若大鼠对夹捏无反应，则可开始手术；若大鼠对脚趾夹捏出现反射性或肌肉收缩反应，则等待1–2分钟并重复夹捏测试。若大鼠再次出现反应，应更换新的动物，并从步骤1.2重新开始操作。
  4. 待大鼠完全不动后，将其眼睛涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。

2. 渗透压泵植入

  1. 将大鼠腹侧朝下置于无菌手术区域。  以美洛昔康作为麻醉前用药。使用带有25 G针头的注射器，按每公斤体重1-4 mg的剂量进行腹腔注射。
  2.  使用剪刀剪除约1" × 1" 颈部后方一块方形皮毛，以及约1" 肩胛骨间隙的尾侧区域。尽可能贴近皮肤剃毛。
  3. 用70%的消毒乙醇润湿背部和颈部。
  4. 剃毛后，用刷子清洁颈部背面 连续进行3次碘酒擦洗，最后用酒精脱碘。
  5. 将大鼠置于设定为34 °C的加热垫上以维持其体温。
  6. 无菌条件下将渗透泵分别装入50 µL NTF4或生理盐水，用于系统性NTF4治疗（图1).
    1. 使用手术刀在皮肤上做一个约2厘米宽的横向切口，位置位于颅侧稍前方 在肩胛骨之间进行操作。用一只手以镊子提起切口的后缘，同时将止血钳的尖端插入切口后方并轻轻向后推。
    2. 止血钳尖端向前上方约2 cm处 沿切口方向打开止血钳的手柄，扩开钳尖以形成空腔 "口袋" 位于切口部位皮下。此处将作为泵的植入位置。
  7. 插入时应先将泵的输送端朝向目标位置，以尽量减少NTF4与囊袋切口愈合部位的相互作用。
  8. 分别给予50 µL NTF4生理盐水，持续7天或14天。7天组每日给予6.72 mg NTF4，总剂量为47.04 mg；14天组每日给予6.72 mg NTF4，总剂量为94.08 mg。25.
  9. 使用5-0尼龙缝合线、止血钳和镊子缝合用于泵放置的切口。
  10. 观察大鼠从麻醉中恢复的过程，至少持续30分钟。监测结束的标准包括动物恢复活动能力，能够在笼内移动、饮水，并开始其他正常行为，如理毛。
  11. 术后第一周内每天监测动物，观察手术部位愈合情况、饲料和水的正常摄取、尿液/粪便排出情况，以及是否存在应激、疼痛或其他术后并发症的异常行为迹象。
  12. 如果大鼠表现出疼痛或痛苦迹象，可给予每24小时一次、每次5 mg/kg的皮下卡洛芬注射，最多持续5天，以缓解疼痛。
  13. 如果出现感染迹象，应咨询兽医以确保伤口正常愈合。
  14. 根据大鼠所属的实验分组，在手术后7-10天移除5-0尼龙缝线，以防止缝线引起的刺激。

3. 大鼠直接注射的麻醉

  1. 手术前一晚对大鼠禁食。这能确保没有食物阻塞内窥镜或注射针。
  2. 称重并按每公斤体重1-2 mg的剂量配制乙酰丙嗪，进行肌肉注射（注射部位为左侧甲状软骨肌）。
  3. 将大鼠放入诱导箱中，使用5%异氟烷和1 L/min的氧气在诱导箱内进行麻醉诱导。2.
  4. 将大鼠转移至含有2%异氟烷和600 mL/min氧气的鼻罩中2.
  5. 通过用镊子夹捏大鼠的脚趾或足部，判断其是否已充分麻醉。若大鼠对夹捏无反应，则可开始注射操作。若大鼠对脚趾夹捏出现反射性或肌肉收缩反应，则等待1-2分钟并重复夹捏测试。若大鼠再次出现反应，则更换新的动物，并从步骤3.4重新开始操作。

4. 直接注射与可视化

  1. 将无菌制备的含 NTF4 或生理盐水的 50 µL 剂量置于 25°C 的 H2O 浴中，注射前孵育 30 分钟。
  2. 将大鼠仰卧并呈倾斜位固定于亚克力玻璃平台（图 2）上。通过穿过平台顶部的引导线钩住大鼠上门齿前部，使其保持倾斜体位。
  3. 将一支 50 mm、30 号、100 µL 注射器连接至 1.9 mm、30° 鼻窦内窥镜（图 3）。
    注：注射器组件通过夹具固定，使套管牢固附着于内窥镜外壁。内窥镜可用于观察声带并指导经口注射针头定位。每次实验前需调整套管尖端位置，以确保在内窥镜视野下清晰完整地看到针尖（图 4）。
  4. 使用带橡胶头的镊子牵拉舌头并向侧方移位。随后插入塑料开口器以维持口腔通畅。开口器可由 5 mL 塑料注射器筒截取 1.5 至 2 cm 长度制成，切口边缘需去毛刺并打磨光滑。
  5. 关闭室内灯光，将卤素光源连接至内窥镜，并开启录像设备以记录操作过程。
  6. 将内窥镜远端浸入温水中数秒，以减少插入大鼠口腔时玻璃尖端产生冷凝水雾。
  7. 根据显示器提供的视觉反馈，小心引导针头至左侧声带区域。
  8. 在动物呼吸周期的吸气相进行注射，以便充分暴露并进入声带。在吸气相期间，声带完全展开。
    1. 当声带完全可见后，将针头插入位于声带白色内侧缘外侧的左侧甲杓肌。针头就位后，推动注射器注入溶液。
  9. 关闭内窥镜的卤素光源和录像设备，重新打开室内灯光。
  10. 将大鼠放回其饲养笼，并置于加热垫上。
  11. 待大鼠完全恢复意识后，方可从加热垫上移除，并在笼内补充食物和饮水。
  12. 注射后连续观察大鼠 7 天，随后实施安乐死。取出喉部组织用于冷冻切片24。

5. 大鼠的安乐死

  1. 使用盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪（按每公斤体重100 mg/8 mg剂量进行腹腔注射）对大鼠进行麻醉。
  2. 行胸骨正中切开术后放血处死动物。

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结果

在渗透泵灌注2周后或NTF4直接注射1周后，将大鼠实施安乐死。取出喉部组织，置于冷冻保护液（30%蔗糖和70%磷酸盐缓冲液）中，随后使用冷冻切片机连续切片，厚度为10 µm。衰老的喉部肌肉会受到NTF4给药的影响25。除年轻和老年大鼠外，我们还比较了甲状室带肌注射侧与未注射侧的差异。通常情况下，肌纤维大小随年龄增长而发生变化，且该变化因NTF4给药途径不同而异（图5）。治疗后，纤维化程度在定性观察下也有所减少。在老年大鼠中，系统性及直接应用NTF4均可降低失神经纤维的比例（图6）。神经肌肉接头（NMJs）的数量也有所增加（图7）。这种增加的显著性取决于治疗持续时间或给药途径。

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讨论

喉部肌肉容易受到衰老不利影响的作用。既往研究表明，衰老的喉部肌肉会发生多种变化，包括肌纤维大小、肌纤维总数、再生能力、神经肌肉接头（NMJ）的大小和数量变化，以及收缩功能的改变和肌球蛋白同工型的转换4,11,27,30,31。应用神经营养因子可改变衰老的喉部肌肉，这些变化易于测量。因此，大鼠喉部肌肉为研究衰老及发声相关疾病/障碍的影响提供了一个有用的模型。对这些肌肉的研究还可能有助于开发针对人类衰老过程的干预措施或保护性机制。

我们通过全身性或直接应用NTF4的方法，在衰老大鼠的喉部肌肉中诱导出了重塑反应。这表明神经营养因子可能对与衰老相关的肌肉功能障碍具有治疗潜力。通过注射载体将神经营养因子直接应用于人体，可轻松转化为人类嗓音衰老的研究模型

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了耳聋与其他沟通障碍国家研究所的资助（R21DC010806 资助 C.A.M. 和 J.C.S.，R01DC011285 资助 C.A.M.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
神经营养蛋白4Pepro Tech450-0450 μL中含200 ng
Alzet渗透泵DURECT Corporation2001D
30 ° 内窥镜Stoltz61029D
50 mm 30号 100-μL注射器Hamilton84850 和 201812
生理盐水（氯化钠溶液）Sigma-AldrichS8776
盐酸氯胺酮Henry Schein56344
盐酸赛拉嗪Henry Schein33198
25 G 5/8针头Becton-Dickinson305901
1 mL注射器Becton-Dickinson309659
眼科软膏Henry Schein8897
电动剪毛器Oster44-018
乙醇Decon2716
碘（聚维酮碘）Purdue Pharma L.P.606404
加热垫Sunbeam731-5
5-0尼龙缝合线AD SurgicalPMN-518R6
克利止血钳Fine Science Tools13005-14
精细缝合打结镊Fine Science Tools11063-07
美洛昔康Henry Schein49756
卡洛芬Merritt Veterinary Supplies148700
抗生素软膏Henry Schein57110
乙酰丙嗪 AceprojectHenry Schein3845
异氟烷 IsothesiaHenry Schein50033
诱导箱（麻醉箱）Harvard Apparatus50-0116
压缩氧气罐Scott GrossUN1072
聚甲基丙烯酸甲酯平台Small Parts Inc (Amazon)
橡胶头镊子Fine science tools 橡胶11075-00
上述镊子用液态橡胶Lowe's42518
塑料窥器（BD注射器截成所需长度）Becton-Dickinson309659
卤素光源喉镜-喉部频闪仪Kay-PentaxRLS 9100 B
录像机Kay-Pentax
蔗糖Sigma-AldrichS0389-500G
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP4417-100TAB
冷冻切片机 Mictotom HM525Thermo ScientificHM 525
吉氏苏木精染液1号VWR10143-142
Shandon 醇溶伊红-YThermo Fisher Scientific6766007
兔源抗钠通道Nav1.5抗体Sigma-AldrichS0819
德克萨斯红-X鬼笔环肽Sigma-AldrichT7471
α-银环蛇毒素 Alexa Fluor 488偶联物Thermo Fisher ScientificB-13422
小动物麻醉机Smiths MedicalCDS 9000

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