本方案描述了一种用于超快微流控流动中单细胞成像的非对称检测时间拉伸光学显微系统，及其在成像流式细胞术中的应用。
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摘要
摘要
扩大可测量参数的数量，从而实现多维数据分析并获得更高置信度的统计结果，是流式细胞术先进发展的主要趋势。值得注意的是，增加高分辨率成像能力可实现对细胞/亚细胞结构的复杂形态学分析，而这是传统流式细胞仪无法实现的。然而，这种能力对于推动我们对细胞功能的理解具有重要价值，并可惠及生命科学研究、临床诊断和环境监测。将成像功能整合到流式细胞术中会降低检测通量，这主要受限于相机技术在速度和灵敏度方面的局限性。为了在保持图像质量的同时克服成像流式细胞术面临的速度或通量挑战，非对称检测时间拉伸光学显微术（asymmetric-detection time-stretch optical microscopy, ATOM）已被证明能够在高达每秒10万个细胞的成像通量下，实现具有亚细胞分辨率的高对比度单细胞成像。ATOM基于传统的时域拉伸成像原理，依赖超快宽带激光脉冲进行全光学图像编码与重建，进一步通过增强未标记/未染色细胞的图像对比度，提升了成像性能。该技术通过获取细胞的相位梯度信息，并将其光谱编码至单次发射的宽带脉冲中，从而实现这一目标。因此，ATOM在单细胞形态和纹理的高通量测量方面具有显著优势——这些信息可反映细胞类型、状态乃至功能。最终，该技术有望成为一种强大的成像流式细胞术平台，用于细胞的生物物理表型分析，从而补充当前基于生物化学标志物的细胞检测技术。本文介绍了一套建立ATOM系统关键模块（从光学前端到数据处理与可视化后端）的实验方案，并以人源细胞和微藻为例，描述了基于ATOM的成像流式细胞术工作流程。
引言
光学成像是一种强大的工具和基于细胞的检测方法，能够（几乎）无创地可视化多种细胞/亚细胞组分的详细空间分布，从而揭示细胞的多种形态学、生物物理和生物分子特征。然而，当需要研究数量巨大且具有异质性的细胞群体时，从单个细胞中提取高含量信息的能力通常会受到限制。这在基于细胞的检测中形成了测量通量与信息含量之间的常见权衡。一个显著的例子是，将成像功能引入流式细胞术，导致其通量相比传统的非成像流式细胞仪至少下降了1到2个数量级。尽管成像流式细胞术能够实现标准流式细胞仪无法完成的复杂单细胞形态分析1，但其通量通常不足以以高统计学置信度识别细胞异质性。而这种能力对于生物学新发现以及理解疾病发病机制至关重要。关键的技术挑战在于常规光学成像策略本身存在的速度限制：激光束扫描（例如，通过振镜扫描）和/或图像传感器（例如，电荷耦合器件（CCD）和互补金属氧化物半导体（CMOS））。激光扫描速度本质上受限于扫描镜的机械惯性，而CCD或CMOS的帧率则受限于成像速度与灵敏度之间的基本权衡（即，提高帧率会导致信号检测灵敏度降低，反之亦然）。
基于一种全光学、超快图像编码机制，光时间拉伸成像已被证明是一种极具吸引力的高通量成像流式细胞术平台，无需传统的图像传感器或机械激光扫描2,3。关于时间拉伸成像工作原理的详细描述可参见文献4,5,6,7。简而言之，该技术包含两个可互换的映射步骤：（i）光谱编码（波长-空间映射），即将被成像样本的空间坐标映射到脉冲光束光谱中的不同波长上8,9；以及（ii）色散傅里叶变换（波长-时间映射）9，即通过群速度色散（GVD）将单个激光脉冲的波长成分转换（拉伸）为时间域上的（波长扫描）波形（图1）。时间拉伸成像的一个重要特征是光学放大，其在克服因超快光电探测和GVD损耗导致的灵敏度下降方面起着关键作用，从而在不被光电探测器噪声污染的情况下提升图像信噪比（SNR）9。由于每个激光脉冲编码了被成像样本的一条线扫描信息，且该线扫描方向垂直于细胞的单向流动方向，因此有效线扫描速率由激光重复频率决定，通常超过10 MHz。这种超快操作实现了无模糊的单细胞图像采集，通量可达每秒10,000至100,000个细胞（即，比传统成像流式细胞术高10至100倍）。因此，时间拉伸成像可在高通量、单细胞、基于图像的筛选中发挥独特作用，尤其适用于在大规模细胞群体（数千至数百万个细胞）中识别未知异质性或稀有/异常细胞的情形，例如稀有癌细胞筛查10或微藻分类11。
时间拉伸成像主要依赖明场（BF）图像采集，其图像对比度由细胞对光的散射和吸收产生2,3,9,10,11。这种无需标记的单细胞成像能力可避免荧光标记带来的不利影响（如细胞毒性和光漂白），同时仍能基于细胞及亚细胞的纹理和形态提供有价值的单细胞分析信息。这些无标记参数已被证明在细胞深度图像分类中具有有效性，尤其是在拥有大量细胞群体时尤为显著11,12。然而，在许多情况下，明场成像无法提供足够的对比度以揭示无标记透明细胞的精细形态。为此，已开发出多种无标记、相位对比型的时间拉伸成像模式，用于在超快帧率下增强成像对比度13,14,15。其中，非对称检测时间拉伸光学显微术（ATOM）基于类似于纹影摄影（Schlieren photography）的概念，可呈现相位梯度（类似微分干涉对比，DIC-like）的对比效果，实现无需标记、高对比度的单细胞成像，且适用于超高速微流控环境（最高达10 m/s）16。该效应可通过倾斜探测或照明实现，例如部分遮挡编码光束路径，或在光电探测前对光束进行倾斜。ATOM的另一优势在于能够同时获取两个相反方向上的相位梯度对比图像。通过对两个相反对比图像进行强度相减和相加，可在同一次线扫描中分别获得微分相位梯度对比和吸收对比。本文提供了一套详细的ATOM实施操作流程，包括光学系统的搭建、样品制备以及数据采集与可视化。具体而言，本文展示了ATOM在人血细胞、癌细胞和浮游植物（微藻）单细胞成像中的应用。这突显了ATOM在成像流式细胞术中的广泛适用性，不仅可用于生物医学研究，还可拓展至海洋科学与生物燃料研究领域17,18。
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方案
1. 样品制备
- 样品制备（贴壁细胞；MCF-7 细胞）
- 从培养箱中取出细胞培养皿，弃去培养基。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿中的细胞，以去除多余的培养基。
- 向培养皿（直径100 mm）中加入3 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，并将其放入 37 °C，5% CO₂2 孵育4分钟。
注意：胰蛋白酶可溶解细胞的黏附蛋白，从而使细胞从培养皿上脱落。 - 使用倒置显微镜（10倍物镜）检查所有细胞是否已从培养皿上脱落。如未完全脱落，可轻轻晃动细胞培养皿。
- 加入4 mL标准培养基（含89%达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS））以终止胰蛋白酶的作用。
- 将全部混合物（含胰蛋白酶溶液和培养基的细胞）转移至离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
- 移除所有液体，并将细胞重悬于 1 mL 1×PBS（pH 值：7.4，预热至 37 °C).
- 样品制备（培养的微藻）
- 将培养的微藻及培养基（例如， 将微藻与培养基以1:5的体积比接种于新的玻璃培养管（约15 mL）中，培养基可为海水、琼脂或淡水，以建立新的继代培养体系。
- 将玻璃培养管置于防尘室中，按照明暗周期（通常为16小时光照:8小时黑暗）使用荧光灯进行恒定光照，实验前培养72–120小时。
- 将转接培养的样品转移至离心管中，充分混匀。
2. ATOM 系统设置
图1：ATOM系统的示意图。 宽带脉冲激光器被用于向（a）一个时间拉伸模块和（b）一个在线光放大器模块。时间拉伸模块产生一列时域波形，其中每个波形均为激光光源波长谱的复制品，（即， 波长到时间映射）。放大模块用于补偿脉冲展宽（色散）过程中的损耗。随后，展宽后的脉冲（c) 通过衍射光栅在空间上分散，形成一维光谱阵列照明，其中各个波长成分由一对中继透镜传递，并通过物镜聚焦到流动细胞内不同位置的（d微流控芯片。这一过程即为光谱编码。经过光谱编码的光将再次通过另一物镜和反射镜穿过细胞，返回至衍射光栅并重新组合成为空间上无色散的脉冲光束。该经图像编码的脉冲光束随后 (e）分为两束，使得两束光均被部分遮挡（f）刀口边缘，但来自相反方向，然后耦合进光纤。这两束光代表最终图像的两种（相反）编码相位梯度对比。为了同时检测这两种信号对比，其中一路信号会经历（g一条延时线，使两个信号在时间上复用（交错）。使用高速光电探测器和实时示波器进行数据采集。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 时间拉伸模块
- 使用宽带飞秒（fs）或皮秒（ps）脉冲激光光源，推荐其中心波长位于近红外（NIR）范围，即800–1,500 nm。
注意：典型的所需脉冲宽度范围可从亚100飞秒至数皮秒。脉冲激光光源的详细要求可参见参考文献4和5。重要参数指标在下文突出显示。 表1.- 确保激光光源具有高重复频率，应处于兆赫兹范围（例如， 数十 MHz）以确保 ATOM 中的超快成像。同时，将激光器的峰值输出功率设置在光纤腔的损伤功率阈值（约 1 kW）以下。
- 确保脉冲激光光源具有良好的逐发时间与光谱稳定性。
注意：光谱幅度波动的典型容差应保持在1.2%以内19,20,21，由本实验装置中的光纤锁模激光器实现。
注意：激光光源的光学带宽应为10–100 nm，这对于在单细胞成像中保证足够的成像视场（FOV）至关重要21.
- 通过光纤准直器，将激光脉冲光束耦合至单模色散光纤中，利用群速度色散（GVD）使脉冲在光纤中展宽图1a).
注意：此为将每个脉冲的光谱作为波长扫描波形映射到时间上的过程（即， 波长-时间映射
注意：所需的总群速度色散（GVD）应足够大，以确保整体的 ATOM 图像分辨率不受波长到时间映射过程的影响（见讨论部分）。通常，在近红外（NIR）波段，GVD 应远大于 0.1 ns/nm。例如，当前实验装置中使用的单模光纤在 1,060 nm 波长附近可提供 0.38 ns/nm 的总 GVD（光纤总长度为 10 km）。
- 使用宽带飞秒（fs）或皮秒（ps）脉冲激光光源，推荐其中心波长位于近红外（NIR）范围，即800–1,500 nm。
- 光谱编码模块
- 构建一个光学显微镜系统，用于对沿微流控通道流动的细胞进行光谱编码成像，如图所示 图1.
注意：该光学显微镜的关键组件包括：（1）一个衍射光栅，一个望远镜中继透镜模块（RL1 和 RL2） 图1），以及两个物镜（Obj1 和 Obj2） 图1).- 首先，将展宽且准直的光束照射到衍射光栅上（本实验装置采用透射型光栅），以产生光谱展宽图1c).
注意：衍射光束的功率（即， 通过调整光栅取向接近利特罗（Littrow）构型，可使衍射效率最大化。 - 配置两个中继透镜（RL1 和 RL2）以构成一个 4-f 成像系统（即， 将衍射光栅置于RL1的焦平面上，并使RL1与RL2之间的距离等于它们焦距之和。此时，光谱展宽将成像于物镜Obj1的后焦平面。
- 仔细调整光谱光束的位置，使其充满物镜1（Obj1）的后光瞳，从而使光谱光束能够投射并聚焦到显微镜的像平面上。
注意：此处物镜（Obj1）的数值孔径（NA） 图10.75。 - 放置另一个物镜（Obj2 在 图1使用一个具有相似数值孔径（NA）的物镜（Obj2），并在其后焦孔径处放置一个平面镜，使得光谱雨束能够对准并双次通过像平面，然后返回至衍射光栅。
- 调整物镜组（Obj1 和 Obj2），使它们的焦平面相互重合。检查光谱光束是否在同一位置以双通方式通过像平面，并沿相同路径返回至光栅。若未实现，需进一步对光学系统进行准直与调谐。
注意：返回的光应通过一个额外的分束器，以便将光传输至非对称检测模块。 - 将光放大器的增益调节至适当水平，使所产生的信号能够以良好的信噪比被光电探测器检测到，通常处于 >10 dB
- 将微流控芯片放置在样品平台上并调整其位置，确保光谱喷淋区域（即成像区域）覆盖微流控通道图1d).
注意：光谱喷淋的照射方向与微流控芯片内流体的流动方向正交，使得流动过程自动完成二维（2D）扫描。
- 首先，将展宽且准直的光束照射到衍射光栅上（本实验装置采用透射型光栅），以产生光谱展宽图1c).
- 构建一个光学显微镜系统，用于对沿微流控通道流动的细胞进行光谱编码成像，如图所示 图1.
- 不对称检测模块
- 放置一个额外的分束器，将成像编码光束分成两束图1e).
注意：每个光束复制品均被刀口部分遮挡。 - 测量并记录光束在光束挡板前的光功率。然后手动调节安装在直线平移台上的刀口，使其大致遮挡光束的一半（通过目视观察）。随后，在将刀口沿光束横向移动以精细调节其位置的同时，使用光功率计监测光束功率。
注意：建议的最佳位置是功率降至原始值约50%的位置（即， 未封闭的情况）。该条件可提供最佳的图像信号强度与图像对比度增强的组合。 - 对另一束光复制体重复步骤 2.3.2。注意，一个光束的部分光束阻挡器的方向应相对于另一光束完全相反（图1f).
- 通过两个光纤准直器，将两束部分被遮挡的光束分别耦合到两个单模光纤臂中。
注意：其中一条臂具有一段额外长度的光纤，作为基于光纤的延迟线，用于相对于另一条未设延迟线的副本引入时间延迟（图1g）。两者均由光纤耦合器引导至单根光纤，再进行光电探测。时间延迟应足够长，以在时间上分离两个副本，同时足够短，以避免与下一个波形发生时间重叠。即， 两个副本在检测前始终在单根光纤中进行时间交错和时分复用。图 2a)). - 使用实时示波器捕获并数字化检测到的光信号。注意，示波器的带宽及其采样率应足够高，以确保不会影响最终的图像分辨率（见讨论部分）。
注意：此处采用 0.38 ns/nm 的群速度色散（GVD），后端采集带宽和采样率分别为 >20 GHz 和 >分别为 40 GSa/s。
- 放置一个额外的分束器，将成像编码光束分成两束图1e).
3. 实验步骤
- 样品加载
- 在标准血细胞计数板中，使用常规相差显微镜进行细胞计数。
- 用1×PBS（微藻使用泉水）稀释调节细胞密度，并用移液器充分混匀。
注意：建议浓度范围为105至106个细胞/mL。 - 将微流控芯片安装到光学成像系统的样品平台上。
注意：微流控芯片主要由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，采用标准复制模塑法制备。微流控通道设计为非对称弯曲通道，以产生惯性流动聚焦效应，使细胞在成像区域（尺寸为80 µm × 80 µm（高度×宽度））内以高速单列流动。 - 将调节好密度的细胞溶液转移至10 mL注射器中。
- 将注射器连接至微流控芯片的入口，同时将离心管连接至微流控芯片的出口，用于废液收集。
- 将注射器安装到注射泵上，并设置合适的流速，以获得理想的通量，同时避免细胞与通道之间产生过大的剪切力。
注意：样品的线速度应控制在0.5至10 m/s之间。请注意，在实际图像采集前，通常需要进一步微调系统，通过重复步骤2.2.1.4–2.2.1.6来最大化图像信号强度并优化图像聚焦。
4. 数据采集
- 为每次实验设置合适的保存数据点数量。需保存的数据点数量取决于样品的大小和流速。
注意：通常在 80 GSa/s 的采样率下，设置为 800 万至 1600 万个采样点。 - 使用示波器以批处理模式采集并保存数据。
5. 后端处理
图 2：从线扫描时间轨迹重建 ATOM 图像。 为了重建具有吸收对比度和差分（增强）相位梯度对比度的 ATOM 图像，需从（a）时间复用的时间波形轨迹中提取两组时域展宽脉冲（见紫色和绿色脉冲），然后通过数字方式将其分割并堆叠，形成（b）两幅二维图像，分别显示两种相反的相位梯度对比度。注意，需要进行剪切操作以补偿由于激光重复频率估算中的舍入误差引起的次级索引偏移，从而生成（c）无畸变图像。通过从激光源的光谱强度包络中减去（d）原始线扫描信号，可去除图像背景。（g）吸收对比度图像可通过图像（e）和（f）的像素级强度求和获得，而（h）差分相位梯度对比度图像则可通过图像（e）和（f）相减得到。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将示波器中的数据传输至计算机，用于离线图像重建。
注意：此处数据存储在便携式硬盘中，并在示波器与处理计算机之间手动传输。每次实验所需的硬盘容量应超过 500 GB。- 使用关键图像重建程序将线扫描数据进行数字叠加，以生成二维图像（图2).
注意：该自定义程序（MATLAB 编写）随后通过分离两个时分复用的数据集（紫色和绿色波形）生成两幅非对称检测图像 图2).- 通过减去两张非对称检测图像的强度获得差分相位梯度对比图像；通过将两张非对称检测图像的强度相加可获得吸收对比图像。参见MCF-7细胞和微藻的选代表性图像 图3请注意，在进行图像叠加和相减操作之前，应先消除各图像的背景轮廓，并对其强度进行归一化处理。
- 生成一个由图像导出的参数库，例如细胞体积、圆形度和吸收密度 等等。 用于进一步分析。
- 使用关键图像重建程序将线扫描数据进行数字叠加，以生成二维图像（图2).
- 将数据文库输入数据可视化平台（图4).
- 将参数库及相应的重建图像加载至可视化界面平台。
- 将坐标轴设置为感兴趣的参数。
注意：参数是特定于具体问题的，由用户定义，由MATLAB程序根据ATOM图像导出。此处可选择的参数包括细胞的光吸收密度、细胞面积、细胞体积和细胞圆度。 - 选择要显示的数据集，使得每个细胞图像均可在散点图上可视化为不同的数据点。
- 将鼠标光标移至每个点，以在浮动子窗口中显示相应的图像及其他参数。
注意：坐标轴可在线性与对数尺度之间进行交互式切换。 - 通过在散点图上手动设门，对数据集的任意子集进行进一步分析。
注意：门控子集的每个参数的直方图均可与整个文库的相应参数直方图进行对比绘制。单独的直方图将在另一个浮动子窗口中显示。
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结果
本研究展示了 ATOM 的两项单细胞成像应用：一项用于哺乳动物细胞（人外周血单个核细胞）s （外周血单个核细胞（PBMC）和乳腺癌细胞（MCF-7））以及另一组与浮游植物s （栅藻和衣藻）。第一项实验源于人们对液体活检日益增长的兴趣，旨在检测、计数和表征血液中循环肿瘤细胞（CTCs）23. 检测从原发肿瘤部位扩散至血液中的循环肿瘤细胞（CTCs），有助于研究转移性癌症的进展过程24,25然而，CTC 分析仍存在挑战：（i）CTC 数量远低于全血中极高的血细胞含量。目前识别和回收 CTC 的方法大多涉及细胞富集和分离步骤26,27,28然而，血液细胞的污染背景...
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讨论
在ATOM系统搭建过程中，有几个技术细节需要特别注意。首先，必须认识到非对称/斜向光谱编码照明可能会引入残余的相位梯度分量（即， 吸收对比度中的阴影效应会影响ATOM中相位梯度对比度的增强效果。因此，应尽量减小倾斜照明的这一影响。其次，需要强调的是，涉及两个副本的时间复用或时间交错方案不会对成像速度造成明显折损。即， 线扫描速率 >MHz 仍可保持），前提是两束光复制脉冲的总时间宽度不超过一次行扫描周期。第三，色散光纤与放大器集成模块的最佳配置取决于目标增益以及可用放大器的规格。光学放大对于时间拉伸过程至关重要，用以补偿与群速度色散（GVD）相关的光学损耗。22原则上，它可以由任何类型的光放大器实现，优选采用光纤形式，以便与基于光纤的时间拉伸过程相兼容。图1b）。基于光纤的光放大器的实际示例包括掺铒光纤放大器（EDFA；工作波长约为 1,500–1,600 nm）、掺镱光纤放大器（YDFA；工作波长约为 1,060 nm）、光纤拉曼放大器以及光纤光学参量放大器（FOPA；原则上可在任意工...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢杨先生为我们准备MCF-7细胞。本研究部分得到了中国香港特别行政区研究资助局基金（项目编号：17259316、17207715、17207714、17205215和HKU 720112E）、创新及科技支持计划（ITS/090/14）以及香港大学大学发展基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 尼康 Plan Fluorite 生理学物镜 40X | Nikon | MRF07420 | 物镜 (Obj2) |
| 奥林巴斯 Plan Fluorite 物镜，0.75 数值孔径，0.51 mm 工作距离，40X | Olympus | RMS40X-PF | 物镜 (Obj1) |
| N-BK7 平凸透镜 | Thorlabs | LA1145-C | 用于传递光谱展宽光束 |
| FC/APC 光纤准直组件 | Thorlabs | F220APC-1064 | 用于输出和收集激光脉冲 |
| 薄膜分束器 | Thorlabs | BP145B3 | 用于生成光束副本 |
| 镀保护银膜反射镜 | Thorlabs | PF10-03-P01 | 用于反射光 |
| 800-1650 nm 12 GHz 单模直流耦合近红外光电探测器 | Newport | 1544-B | 用于将光信号转换为电信号 |
| Infiniium 高性能示波器 | Agilent | DSOX91604A | 用于保存光转换后的电信号 |
| HI1060 光纤 | Corning | HI1060 | 用于时间拉伸的光纤 |
| 掺镱光纤放大器 | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | 光路中继放大器 |
| 全息光栅 | Wasatch Photonics | 020305-6 | 光栅 |
| 推注/抽吸式注射泵 | Harvard Apparatus | PHD 2000 | 用于微流控通道中的样品加载 |
参考文献
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