诱导细胞分化和单细胞成像副溶血性弧菌

摘要

该协议允许单细胞显微镜检查差异不同的副溶血弧菌游泳运动员和swarmer细胞。该方法产生容易获得单细胞分析的swarmer细胞群，并涵盖细胞培养物的制备，诱导分子分化，样品制备和图像分析。

摘要

研究蛋白质的细胞内定位的能力对于了解许多细胞过程是至关重要的。反过来，这需要获得用于荧光显微镜的单细胞的能力，当在细菌群落内存在细胞时，这可能是特别具有挑战性的。例如，人类病原体副溶血弧菌在液体条件下作为短棒状游泳细胞存在，其在表面接触时分化成专门用于在固体表面上生长的高度细长的漂浮细胞的亚群。本文提出了一种在其两种差异状态下进行副溶血弧菌的单细胞荧光显微镜分析的方法。该协议非常可重复地诱导副溶血弧菌分解成更细胞的生命周期，并促进其在固体表面上的增殖。该方法产生从t延伸的分化的swarmer细胞的耀斑他的群体边缘。值得注意的是，在群星的尖端，细胞细胞存在于单层细胞中，这允许它们容易地转移到显微镜载玻片上并随后进行单细胞的荧光显微镜成像。此外，介绍了细菌社会人口统计学图像分析工作流程。作为原理证明，描述了溶血性弧菌的游泳者和swarmer细胞中趋化性信号阵列的细胞内定位的分析。

引言

细菌不断经历对外部环境的变化，并开发了几种技术来相应地改变和调整其行为。一种这样的机制涉及分化为更好地补充改变的环境的不同细胞类型。分化通常涉及细胞周期调控，细胞形态和细胞时空组织的重大变化。可以进行分化的一种生物体是副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus） 。 副溶血性弧菌属于Vibrionaceae ，它是通常居住在新鲜或咸水中的一类蛋白菌。 伏立木科植物广泛分布在环境中，包括引起人类肠道感染的若干物种，也包括霍乱弧菌。副溶血弧菌是一个二态生物，能够分化成两种不同的细胞类型，作为对其变化的反应外部环境在水环境中，它作为一个短杆形游泳细胞存在，单个极鞭毛位于老细胞柱上。在表面接触时，触发分解成更细胞的细胞。 Swarmer细胞分化涉及两个主要变化:通过抑制细胞分裂使细胞形态发生变化，并诱导第二鞭毛系统。这导致形成了围绕和高度细长的棒状的旋转细胞，其可以继续使用更生命的生活方式，其中分裂事件导致后代的swarmer细胞，或者分化回游泳细胞。

据报道有几个因素诱导或影响sw mer分化。主要刺激似乎是通过机械感应驱动的，其中副溶血性弧菌使用极鞭毛作为触觉传感器，其检测表面接触时的旋转抑制，但是涉及其他几个因素好¹ 。在实验室中，极地鞭毛的旋转可以通过加入苯胺进行人为的抑制，其阻止钠通道驱动的鞭毛旋转，从而诱导更多的分化² 。此外，在早期的研究中，当细胞在用透明塑料胶带密封的培养皿中的生长培养基上繁殖时，诱导溶解在溶解固体培养基上的溶弧弧菌 。碱饱和过滤纸在这些条件下阻止了群集，因此表明一个或多个挥发性酸可能参与诱导群集。因此，用塑料胶带密封培养皿可能允许在板的顶部空间内积聚作为细胞新陈代谢的副产物的挥发性酸。当在未密封的培养皿中将H ₂ O ₂加入到生长培养基中以通过水解培养基成分人工产生挥发性酸时，获得了相同的效果 ^3，4，5 。然而，这种挥发性酸的身份仍然是未知的。此外，已经表明，钙⁶和铁限制^7的过量可用性都增强了在固体表面上的分散和增殖。通过将化合物2,2'-联吡啶加入到生长培养基中，可以使细胞饥饿，这已经显示出影响swarmer分化⁸ 。已知调节分化的因素现在在可重复地诱导副溶血弧菌分化成swarmer细胞的方案的设计中实现，并且在固体琼脂表面上增殖。

副溶血性分化涉及细胞分裂调控，细胞形态学，大分子机器如flagell的定位的重大变化a和趋化性装置 - 根据细胞周期都需要蛋白质的特异性定位的过程。因此，研究这些蛋白质的细胞内定位的能力对于理解上述细胞过程是至关重要的。为了进行这样的研究，需要在单细胞上进行荧光显微镜检查。当在密集细菌群体中存在的细胞成像时，这可能是特别有挑战性的，如同泡沫细胞的情况。已经尝试在液体培养基中诱导更多的分化，这可能潜在地产生用于显微镜研究的单细胞。尽管在转录水平上，这些细胞已经部分地诱导了Swarmer分化程序，但是它们不像在固体培养基⁸上生长的完全分化的swarmer细胞经历相同的形态学变化。本文提供了一种强大且可重复的方法来诱导swarmer ce的方法在琼脂表面上分化。该方案产生容易获得的swarmer细胞群，可用于单细胞显微镜和随后的分析。此外，该方案可以使游泳者和swarmer细胞类型中的荧光标记蛋白质的定位研究（部分1,2,3,4）。此外，该协议描述了如何处理和分析来自荧光显微镜实验的生成数据的后续工作流程，其允许细菌学社会的人口统计学分析（第5节）。

方案

1.电生理的副溶血性弧菌细胞的制备和质粒DNA电泳到游泳细胞中

注意:该协议的以下部分允许制备电感受态细胞，随后将质粒DNA电穿孔到游泳细胞中。如果荧光蛋白从质粒外显子表达，这个步骤很重要。

1. 将来自-80℃甘油储备的V.副溶血弧菌细胞分离到含有100μg/ mL氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。
2. 第二天，接种具有单个副溶血弧菌菌落的200mL LB培养基，并在37℃下在振荡条件下孵育，直到达到OD ₆₀₀为1.0。孵化通常需要5-6小时才能使细胞培养达到所需的光密度。
3. 立即将细胞转移到冰上和水中在冰上和4°C预冷离心机中进行所有进一步的步骤。
4. 以2,000×g在4℃下收获细胞10分钟。
5. 通过倾析弃去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于25mL冰冷的273mM蔗糖溶液（pH7.4，用KOH缓冲）中。
6. 在2000×g下在4℃下再次收获细胞10分钟。重复两次。
7. 将洗涤的细胞沉淀物重新悬浮在400μL冰冷的273mM蔗糖溶液中。随后，加入甘油至最终浓度为15体积％体积。这些细胞现在可以进行电穿孔，但是也可以在-80℃的70μL等分试样中冷冻以供以后使用。
8. 对于电穿孔，将70μL等电量的电感受态细胞与100-1000ng质粒DNA混合，并将混合物转移到冰冷的电穿孔试管（0.2cm电极间隙）中。使用以下设置执行电穿孔:25μF，2400 V和200Ω。
9. 暂停在600μLLB肉汤中的电穿孔试管中的细胞，转移到2mL管中，并在37℃下振荡孵育3小时。
10. 将细胞以2,000 x g的速度旋转5分钟，并将沉淀重新悬浮在100μLLB肉汤中。将细胞悬浮液扩散到含有必需抗生素的选择性LB琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。
11. 第二天，检查盘子的集落形成。生长的菌落携带在质粒上编码的正确抗生素抗性基因，现在可用于进一步的实验。

2.诱导Swarmer细胞分化

注意:以下步骤描述了如何诱导副溶血弧菌分解为其更长的细胞生命周期以及如何刺激固体表面的增殖。

1. 将4g心输液（HI）琼脂悬浮于100mL ddH ₂ O中，以制备群组。
2. 小心煮沸HI琼脂溶液在微波炉中，不时摇动瓶子直到粉末溶解。在121℃高压灭菌20分钟。
3. 经高压灭菌后，将HI琼脂冷却至60-65℃。加入最终浓度为50μM的2,2'-联吡啶（100％乙醇中50mM的储备溶液）。加入最终浓度为4mM的CaCl ₂ （ddH ₂ O中4M的储备溶液）。如有必要，在溶液中加入抗生素以维持质粒。
   注意:如果计划使用诱导型质粒，请将诱导剂加入其最终浓度。
   小心:2,2'-联吡啶:急性毒性（口服，皮肤吸入）。使用手套和安全护目镜。
4. 将30 - 35 mL最终的HI琼脂溶液倒入150 mm培养皿中，让琼脂固化。
5. 在仔细观察细胞培养之前，将琼脂平板在37℃下干燥至少10分钟（或直到任何液体残留物都具有ppeared，但不再）右开一个敞开的盖子。
   注意:干燥时间高度依赖于使用的培养箱，严重干燥的板不会允许副溶血弧菌的聚集 。 （这一步非常重要！）板必须使用新鲜，不应超过2 - 3小时。旧板太干了，不能刺激群众。
6. 将少量细胞从单个菌落的边缘接种到5mL LB肉汤中。孵育培养物在37℃振荡直至达到OD ₆₀₀ = 0.8，通常需要2-3小时。之后，细胞准备好被发现到HI群体琼脂平板上。
7. 将1μL细胞培养物置于HI琼脂积聚板的中心（ 图1A ）。
8. 让斑点干燥（ 图1B ）。
9. 用透明胶带密封板，并确保其牢固连接，否则可能会在过夜孵育期间分离（ 图1C ）。
   注意:非常重要的是，密封是完美的。应用时，避免气泡的形成和胶带折叠。
10. 将板在24℃孵育过夜。这将导致从群集周边延伸的群聚体形成副溶血弧菌群落（ 图2 ）。

荧光显微镜检查副溶血弧菌Swarmer细胞的制备

注意:以下协议描述了如何制备显微镜琼脂糖载玻片和随后将琼脂糖斑块印刷到琼脂糖垫上，以获得单一的微泡显微镜细胞。

1. 为了制备用于显微镜的琼脂糖载玻片，将1g琼脂糖加入到100mL的20体积/体积的PBS和10％vol / vol的LB肉汤溶液中。小心地煮沸微波溶液溶解琼脂糖，让其冷却至65-70℃，同时用磁力搅拌器混合。
2. 放置ac瘦肉显微镜滑到工作台上的完美水平部分。用两层通用实验室标签胶带盖住滑块的两端，将滑块固定到工作台上。两条胶带之间的距离应为3厘米左右。
   注意:两层胶带产生非常小的高度，这将确定琼脂糖垫的高度。重要的是，工作空间是水平的，以确保细胞将在同一平面进行显微镜分析。
3. 将Pipet〜250μL先前制备的琼脂糖溶液加到非覆盖的玻璃表面上。
4. 现在放置第二个显微镜载玻片与顶部底部相同的方向，稍微按下它，使残留的琼脂糖可以流出到两侧。
5. 让琼脂糖固化1-2分钟，然后慢慢地将顶部的玻璃滑板从底部的水平运动中拉出。
6. 使用手术刀，切断所有残留的琼脂糖显微镜的两侧滑动并从显微镜载玻片的末端缓慢取下胶带。
   注意:琼脂糖载玻片现在已经准备就绪，应尽快使用，因为它会慢慢开始变干。
7. 为了在swellmer细胞上进行显微镜检查，从群集群体的最外边缘切出约3毫米×10毫米的琼脂琼脂（ 图1D ）。直到将swellmer细胞转移到显微镜载玻片之前，不要破坏群盘的胶带密封是非常重要的。一旦去除了胶带， 聚集的副溶血性细胞就会分化为游泳细胞。
   注意:确保将切片从群集边缘外侧引导到菌落内部（ 图1D ）。这样就可以防止"游泳者污染"进入群众的边缘。
8. 将琼脂糖片转移到显微镜琼脂糖载玻片上，细胞朝向琼脂糖片d（ 图1E ）。这样将这些细胞印迹到琼脂糖垫上。
9. 等待〜30秒后，从琼脂糖垫中小心地取出琼脂片（ 图1F ）。
10. 将玻璃盖玻片放在琼脂糖垫上，细胞被印记。这些细胞现在可以用于显微镜。
    注意:重要的是立即对swellmer细胞进行成像，因为swellmer细胞缓慢地向游泳者状态分化。

4.副溶血素游离细胞培养物的制备用于荧光显微镜

注意:该方案的这一部分描述了如何准备副溶血弧菌的培养物，以对游泳细胞进行荧光显微镜观察。

1. 将少量细胞从单个菌落的边缘接种到5mL LB肉汤中。孵育培养物在37℃振荡1小时或直到轻微的细胞生长变得可见。
2. 在如果需要，该阶段添加用于表达目的蛋白质的诱导剂。在该实施例中，为了诱导YFP-CheW9的表达，加入L-阿拉伯糖至终浓度为0.2％（w / vol）。
3. 将培养物在37℃下再培养2小时。
4. 按照步骤3.1-3.7准备显微镜琼脂糖载玻片。
5. 在琼脂糖垫的中心点点1μL细胞培养物，让斑点孵育直至干燥。
6. 将玻璃盖玻片放在琼脂糖垫上，细胞被发现。现在准备在荧光显微镜下成像细胞。

图像分析

该协议的这一部分描述了图像分析的工作流程，特别是如何提取用于人口统计学分析的单细胞荧光数据。

1. 在开始图像分析之前，请确保所有显微镜图像都以16位TIF格式保存。
2. 将DIC（或相位对比度）和相应的荧光通道图像加载到软件中。
3. 通过选择"显示/覆盖图像"生成两个通道的叠加图像。将图像数（"＃图像:"）设置为2，并选择第一个通道中的DIC图像和第二个通道中的荧光图像。
4. 从工具栏中选择"多行"工具，将单元格从一个极点标记到另一个单元格的中间。为了获取所有生成的行（行对象）的列表打开"测量/区域测量"。配置区域测量仅显示区域标签，距离和平均强度。
5. 将"测量/校准距离"下的像素大小校准为显微镜设置特定的像素大小，然后单击"应用于所有打开的图像"。
6. 将所有区域（线对象）转移到荧光通道图像。在"地区/运输"er Regions"选择源图像（叠加图像）和目的图像（荧光通道图像），选择"所有区域"，然后按"确定"。
   注意:为了能够以后重新生成精确的行（行对象，区域，ROI），请打开"区域/保存区域"并保存区域。
7. 通过打开"测量/区域测量"并按"打开日志"将所有区域测量结果导出到电子表格中。确认打开并导出数据。一旦电子表格在后台打开，最后按"F9:Log Data"导出数据。
8. 要确定荧光灯沿着细胞的位置，打开"测量/线条扫描"。将"Linescan宽度"设置为一个值，以便单元格的整个宽度被先前创建的区域覆盖。右键单击行扫描图，然后选择"显示图形数据"。通过左键单击并将鼠标拖放到行扫描中兴趣点，"图形数据"窗口将显示相应的像素/两点之间的距离。选择蓝色突出显示的行，然后复制内容。
   注意:通过在"Linescan"窗口中按"日志数据"，可以将整个行扫描强度配置文件记录到电子表格中。提取的数据现在可以用于图形中的可视化或进一步的统计分析。在细胞周期的细胞长度和细胞体的荧光强度的人口统计学表示中，可以容易地观察细胞周期上的定位模式。这些表示可以使用先前选择的相同ROI获得。以下步骤将给出如何生成类似于图3C和4C所示的人口统计的示例。
   1. 在先前在软件中创建的Fiji / ImageJ加载区域标记（.rgn）（步骤5.6）中使用"Metamorph nd＆ROI files importer";。或者，可以使用内置的"分段线"工具在Fiji / ImageJ中直接创建要分析的单元的感兴趣区域（ROI）。
   2. 打开"分析/工具/投资回报率管理器"并标记所有活动列表条目"。
   3. 之后，点击"更多/多图"，然后在新的"多图"窗口中选择"列表"。点击一个表项，然后选择并"全部复制"。随后，粘贴到一个新的电子表格。
      注意:请确保电子表格中最长单元格的数据（两行对应的X和Y行数最多的行）是最右边的数据。
   4. 将电子表格另存为"CSV（逗号分隔）（* .csv）"。
   5. 从这里下载R脚本"https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"10。脚本按照长度排序细胞，并将所有细胞的荧光强度分布归一化为每个细胞荧光素的平均值即
   6. 在R [版本3.0.1中运行整个脚本"单元格配置文件function.R" ¹¹ ]。
   7. 编辑第30行中的"example plots.R"脚本，以便文件路径引用保存以前生成的.csv文件的文件夹。另外，将第31行中的文件名"profile.csv"更改为在步骤5.9.4中生成的.csv文件所选择的文件名。然后，运行"example plots.R"，并按照"https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"中的文档以及脚本文件中的注释生成人口统计分析。

结果

诱导分化和产生群集菌落

图1提供了生产副溶血弧菌群落的重要步骤的模式（ 图1A-C ）。游泳者培养物被发现在群体琼脂上，并在24 ^℃下孵育，在固体琼脂表面上诱发更多的分化和增殖。 图2中给出了群集群体的代表性立体显微镜图像。立体显微镜成像清楚地显示了从群集周边向外延伸的群体。较高的放大倍数显示，在群体中，细胞仅分成单层或双层，而在群集细胞的中间，细胞堆叠成多层（ 图2A ）。群发喇叭可以很容易地转移（如步骤3.8-3.11中所述， 图2B ）。这与群集中间的细胞相比，这些细胞明显更短，可能代表游泳者和泡沫细胞的混合物（ 图2B ）。此外，将耀斑小心地转移到显微镜载玻片上，使群体的整体结构和群体的边缘完整无缺，导致单层细胞可以单细胞显微镜...

讨论

本文报告了一种用于副溶血性弧菌细胞的显微镜成像的方法，随后进行下游分析，旨在解决和量化研究的荧光标记蛋白质的亚细胞定位和其他特征。虽然对于显微镜图像处理和分析存在几种工具14,15,16,17,18，副溶血弧菌聚集细胞的分析仍然是具有挑战性的，因为它们通常存在于密集的细胞群中，并且细胞长度的变化很大（ 图2 ）。因此，自动细胞检测有时是错误的，因此结果有些不可靠。该协议概述了一条管道，旨在增长，形象和分析副溶血弧菌的群体细胞，这是根据规范量身定制的这些细胞的需要，例如表面上的受控生长环境和下游图像分析，其适应在接近生长的可变长度的细胞的存在。

从质粒外显子表达感兴趣的蛋白质的能力对于几个实验是重要的， 例如荧光标记的蛋白质的表达用于显微镜研究或基因缺失的互补。这里还描述了制备化学感受态细胞和将质粒DNA 电穿孔到副溶血弧菌中的过程。通常用于副溶血弧菌的电穿孔对缀合的优点是，质粒骨架不需要被修饰以允许缀合。不过，应采取一些预防措施;如步骤1.2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基组分
LB 培养基	Roth	X968.3
Difco 琼脂，颗粒状	BD	214510	用于制备含有 LB 培养基的 LB 琼脂
Difco 心脏输液琼脂	BD	244400	用于制备 HI 琼脂蜂群平板
琼脂糖 NEEO，超优质	Roth	2267.3	用于制备显微镜琼脂糖垫
名称<	strong>Company	目录号<	strong>注释
添加剂
L-阿拉伯糖	Roth	5118.3	诱导pBAD衍生物
2,2'-联吡啶	Sigma Aldrich	D216305-25G	用于制备 HI 琼脂蜂群板
氯化钙二水	Roth	5239.1	用于制备 HI 琼脂蜂群板
氨苄青霉素钠盐	Roth	K029.3
氯霉素	Roth	3886.3
PBS 缓冲液	-		磷酸盐缓冲盐水
D（+） 蔗糖	Roth	4621.1	用于制备电感受态细胞
甘油	Roth	3783.5	用于制备电感受态细胞
名称	Company	目录号	评论
Hardware
培养皿 150 mm x 20 mm，带凸轮	Sarstedt	82.1184.500	用于制备 HI 琼脂蜂群板
Kelvitron t （B 6420）	贺利氏	-	用于干燥 HI 琼脂蜂群板
Gene Pulser Xcell 微生物系统	BioRad	1652662	用于质粒 DNA 的电极
Name	Company	目录号<	strong>评论
软件
MetaMorph 离线（版本 7.7.5.0）	器件	-	用于显微镜图像分析
Excel	Microsoft	-	用于显微镜数据分析