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细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞

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DOI：

10.3791/55842

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2017年5月15日

 ,  , 
1Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology

本文内容

摘要

本方案可实现对具有显著差异的Vibrio parahaemolyticus游动细胞和群游细胞进行单细胞显微观察。该方法能够获得易于用于单细胞分析的群游细胞群体，涵盖了细胞培养制备、群游分化诱导、样品制备以及图像分析等步骤。

摘要

研究蛋白质在细胞内的定位能力对于理解许多细胞过程至关重要。而实现这一目标需要能够获得单个细胞以进行荧光显微镜观察，这在对存在于细菌群落中的细胞进行成像时尤为具有挑战性。例如，人类病原体Vibrio parahaemolyticus在液体环境中以短杆状的游动细胞形式存在，当接触表面后，会分化为一类高度伸长的、专用于在固体表面生长的子群体——群集细胞。本文介绍了一种对V. parahaemolyticus在两种不同状态下的单细胞进行荧光显微镜分析的方法。该方案可高度可重复地诱导V. parahaemolyticus进入群集细胞的生活周期，并促进其在固体表面的增殖。该方法能够产生从群集菌落边缘向外延伸的分化群集细胞簇。值得注意的是，在群集簇的最尖端，群集细胞以单层形式存在，这使其能够被轻松转移至显微镜载玻片上，进而实现对单个细胞的荧光显微成像。此外，本文还展示了用于细菌群体人口学表征的图像分析工作流程。作为原理验证，文中描述了对V. parahaemolyticus游动细胞与群集细胞中趋化信号阵列的细胞内定位分析。

引言

细菌不断经历其外部环境的变化，并已进化出多种机制以相应地改变和适应其行为。其中一种机制涉及分化为不同的细胞类型，以更好地适应变化后的环境。分化过程通常伴随着细胞周期调控、细胞形态以及细胞时空组织结构的重大改变。能够发生分化的生物之一是 副溶血性弧菌. 副溶血性弧菌 属于 弧菌科，这是一类通常栖息于淡水或海水中的变形菌。 弧菌科 在环境中广泛分布，包含多种可引起人类肠道感染的物种，也包括 霍乱弧菌、副溶血性弧菌 是一种双形性生物，能够响应外界环境变化而分化为两种不同的细胞类型。在水环境中，它以短杆状的游动细胞形式存在，具有单一生长于旧细胞极的极生鞭毛。当接触表面时，会触发其向泳动细胞的分化。泳动细胞的分化过程包含两个主要变化：通过抑制细胞分裂实现泳动细胞的形态发生，以及诱导第二套鞭毛系统的生成。这导致形成周生鞭毛且高度伸长的杆状泳动细胞，该细胞可继续维持泳动生活方式（其分裂产生的子代仍为泳动细胞），或 alternatively 再次分化为游动细胞。

已有研究报道多种因素可诱导或影响泳动分化。主要刺激信号似乎源于机械感应，即副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）利用极鞭毛作为触觉传感器，当其接触表面导致旋转受阻时，可被检测到并触发分化，但还有其他多种因素参与其中1。在实验室中，可通过添加苯胺霉素（phenamil）人为抑制极鞭毛的旋转，该化合物可阻断由钠离子通道驱动的鞭毛转动，从而诱导泳动细胞分化2。此外，早前一项研究表明，当溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）在用透明塑料胶带密封的培养皿中的固体培养基上培养时，可被诱导产生群体泳动现象。而在相同条件下，若使用碱性饱和滤纸则可抑制泳动，提示一种或多种挥发性酸可能参与了泳动的诱导过程。因此，用塑料胶带密封培养皿可能促进了细胞代谢副产物——挥发性酸在培养皿顶空环境中的积累。在未密封的培养皿中向培养基添加过氧化氢（H2O2）也可实现相同效果，其通过水解培养基成分人为产生挥发性酸3,4,5。然而，这些挥发性酸的具体身份仍不明确。此外，已有研究表明，钙离子过量供应6和铁限制条件7均可增强泳动细胞在固体表面的分化与增殖能力。通过向培养基中添加化合物2,2´-联吡啶（2,2´-Bipyridyl）可使细胞处于缺铁状态，该处理已被证明会影响泳动分化过程8。目前，上述已知调控分化的因素已被整合到实验方案的设计中，以可重复地诱导副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）向泳动细胞分化，并促进其在固体琼脂表面增殖。

V. parahaemolyticus 的分化过程涉及细胞分裂调控、细胞形态以及鞭毛和趋化装置等大分子机器定位方面的重大变化——这些过程均需蛋白质根据细胞周期进行特异性定位。因此，研究这些蛋白质在细胞内定位的能力，对于理解上述细胞过程至关重要。要开展此类研究，需要对单个细胞进行荧光显微镜观察。当对存在于高密度细菌群体中的细胞进行成像时，这一工作尤其具有挑战性，例如对泳菌细胞（swarmer cells）的观察即是如此。已有研究尝试在液体培养基中诱导泳菌分化，以期获得可用于显微镜研究的单个细胞。尽管从转录水平上看，这些细胞部分激活了泳菌分化程序，但它们并未表现出在固体培养基上完全分化的泳菌细胞所具有的显著形态学变化8。本文提供了一种在琼脂表面诱导泳菌细胞分化的稳健且可重复的方法。该方案可获得大量易于获取的泳菌细胞，适用于单细胞显微观察及后续分析。此外，该方案还支持对游动细胞（swimmer）和泳菌细胞（swarmer）中荧光标记蛋白的定位研究（第1、2、3、4节）。同时，本方案还描述了荧光显微镜实验后数据处理与分析的后续工作流程，可用于细菌群体的群体统计学分析（第5节）。

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方案

1. 感受态细胞的制备 副溶血性弧菌 细胞及质粒DNA向游动细胞的电穿孔转染

注意：本方案的以下部分涉及电转感受态细胞的制备，以及将质粒DNA电转化至游动细胞中。如果需要在质粒上异源表达荧光蛋白，则此步骤至关重要。

  1. 从-80 °C甘油保藏菌种中挑取V. parahaemolyticus细胞，在含有100 µg/mL氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上划线，于37 °C培养过夜。
  2. 次日，挑取单个V. parahaemolyticus菌落接种至200 mL LB液体培养基中，在37 °C振荡培养，直至OD600达到1.0。通常需要培养5–6小时，使菌液达到目标光密度。
  3. 立即将菌液置于冰上，后续所有操作均在冰上进行，并使用预冷至4 °C的离心机。
  4. 在4 °C、2,000 × g条件下离心10分钟，收集菌体。
  5. 倾去上清液，将菌体沉淀重悬于25 mL冰预冷的273 mM蔗糖溶液（pH 7.4，用KOH缓冲）中。
  6. 再次于4 °C、2,000 × g离心10分钟，重复此洗涤步骤两次。
  7. 将洗涤后的菌体沉淀重悬于400 µL冰预冷的273 mM蔗糖溶液中，随后加入甘油至终浓度为15%（体积比）。此时菌体可用于电转化，也可分装为70 µL每份，于-80 °C冻存以备后续使用。
  8. 进行电转化时，取70 µL电转化感受态细胞与100–1,000 ng质粒DNA混合，转移至冰预冷的电转化杯（电极间隙0.2 cm）中，采用以下参数进行电击：25 µF、2400 V、200 Ω。
  9. 电击后，在电转化杯中加入600 µL LB液体培养基重悬菌体，转移至2 mL离心管中，于37 °C振荡培养3小时。
  10. 在2,000 × g条件下离心5分钟收集菌体，将沉淀重悬于100 µL LB液体培养基中，将菌液涂布于含相应抗生素的LB琼脂选择性平板上，于37 °C过夜培养。
  11. 次日观察平板上的菌落生长情况。能够生长的菌落携带质粒编码的正确抗生素抗性基因，可用于后续实验。

2. 诱导游动细胞分化

注意：以下步骤描述了如何诱导副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）分化为其游走型细胞生命周期，以及如何在固体表面刺激其增殖。

  1. 将4 g心浸液（HI）琼脂溶于100 mL ddH2O中，以制备泳动平板。
  2. 将HI琼脂溶液在微波炉中小心煮沸，并不时摇动瓶身，直至粉末完全溶解。于121 °C下高压灭菌20分钟。
  3. 灭菌后，将HI琼脂冷却至60–65 °C，加入2,2´-联吡啶至终浓度为50 µM（用100%乙醇配制的50 mM储存液）。加入CaCl2至终浓度为4 mM（用ddH2O配制的4 M储存液）。如有需要，可加入抗生素以维持质粒稳定性。
    注意：若计划使用可诱导质粒，请加入诱导剂至其终浓度。
    警告：2,2´-联吡啶具有急性毒性（经口、经皮、吸入）。操作时需佩戴手套和护目镜。
  4. 将30–35 mL最终的HI琼脂溶液倒入直径150 mm的圆形培养皿中，静置使其凝固。
  5. 在点样前，将琼脂平板置于37 °C下正放、开盖干燥至少10分钟（或直至表面液体残留完全消失，但不可过度干燥）。
    注意：干燥时间高度依赖所用培养箱条件，过度干燥的平板将无法支持副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）的泳动生长。（此步骤极为重要！）平板必须新鲜使用，存放时间不应超过2–3小时。陈旧平板过于干燥，无法诱导泳动。
  6. 从单菌落边缘挑取少量细胞接种至5 mL LB液体培养基中，于37 °C振荡培养至OD600 = 0.8（通常需2–3小时）。此后，菌液即可用于点样至HI泳动琼脂平板。
  7. 取1 µL菌液点样于HI琼脂泳动平板中心（图1A）。
  8. 待液滴自然干燥（图1B）。
  9. 用透明塑料胶带密封平板，确保胶带牢固贴合，否则可能在过夜培养过程中脱落（图1C）。
    注意：密封必须严密。贴胶带时应避免产生气泡或褶皱。
  10. 将平板于24 °C下过夜培养。将形成副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）的泳动菌落，菌落周围可见向外延伸的泳动条纹（图2）。

3. 准备 副溶血性弧菌 用于荧光显微镜观察的游动细胞

注意：以下方案描述了如何制备用于显微镜观察的琼脂糖载玻片，以及随后将成群运动的菌群印迹到琼脂糖垫上，以获得可用于显微镜观察的单个游动细胞。

  1. 为制备用于显微镜观察的琼脂糖载玻片，将1 g琼脂糖加入100 mL含20%（体积比）PBS和10%（体积比）LB肉汤的溶液中。在微波炉中小心加热至沸腾以溶解琼脂糖，并在磁力搅拌器上搅拌使其冷却至65–70 °C。
  2. 将一块洁净的显微镜载玻片放置于工作台面完全水平的区域。用两层通用实验室标签胶带覆盖载玻片两端，并将载玻片固定在工作台上。两段胶带之间的距离应约为3 cm。
    注意：两层胶带形成微小的抬升高度，这将决定琼脂糖垫的厚度。确保工作区域水平非常重要，以保证细胞处于同一焦平面，便于显微镜分析。
  3. 用移液器吸取约250 µL预先配制好的琼脂糖溶液，滴加到未被覆盖的玻璃表面。
  4. 将第二块显微镜载玻片以与底部载玻片相同的方向置于其上，并轻轻下压，使多余的琼脂糖向两侧溢出。
  5. 让琼脂糖凝固1–2分钟，然后以水平动作缓慢地将上层载玻片从下层滑离。
  6. 使用解剖刀切除附着在载玻片边缘的多余琼脂糖，并缓慢移除载玻片两端的胶带。
    注意：琼脂糖载玻片现已制备完成，应尽快使用，因其会逐渐干燥。
  7. 为对游走细胞进行显微观察，从游走菌落最外缘处切取一块约3 mm × 10 mm的游走琼脂块（图1D）。在将游走细胞转移至显微镜载玻片前，切勿提前破坏游走平板的封口胶带。一旦移除胶带，游走的V. parahaemolyticus细胞即开始向游动细胞分化。
    注意：切割方向应从游走菌落边缘的外侧向内侧进行（图1D），以避免将"游动细胞污染"带入菌落边缘。
  8. 将游走琼脂块转移至显微镜用琼脂糖载玻片上，使细胞面朝向琼脂糖垫（图1E），从而将游走细胞印迹到琼脂糖垫上。
  9. 等待约30秒后，小心地将琼脂块从琼脂糖垫上移除（图1F）。
  10. 在细胞印迹所在的琼脂糖垫区域加盖盖玻片。此时细胞已准备好进行显微观察。
    注意：必须立即对游走细胞进行成像，因为游走细胞会缓慢启动向游动状态的分化过程。

4. 用于荧光显微镜观察的V. parahaemolyticus 游动细胞培养物的制备

注意：本实验方案部分描述了如何制备一种培养物 副溶血性弧菌 对游动细胞类型进行荧光显微镜观察。

  1. 从单个菌落边缘接种少量细胞至5 mL LB液体培养基中，在37 °C条件下振荡培养1小时，或直至观察到轻微的细胞生长。
  2. 在此阶段，如需要，可加入诱导剂以表达目标蛋白。本示例中，添加L-阿拉伯糖至终浓度为0.2%（w/vol），以诱导YFP-CheW9的表达。
  3. 继续在37 °C条件下振荡培养2小时。
  4. 按照步骤3.1–3.7制备显微镜用琼脂糖载片。
  5. 取1 µL菌液滴加在琼脂糖垫中央，静置至液滴干燥。
  6. 将盖玻片覆盖在已点样细胞的琼脂糖垫上。此时样品已准备好用于荧光显微镜观察。

5. 图像分析

本部分实验方案描述了图像分析的工作流程，特别是如何提取单个细胞的荧光数据以进行群体分析。

  1. 开始图像分析之前，请确保所有显微镜图像均已保存为16位TIF格式。
  2. 将DIC（或相差）图像及其对应的荧光通道图像加载到软件中。
  3. 通过选择"Display/Overlay images"生成两个通道的叠加图像。将图像数量（"# Images:"）设置为2，并在第一通道中选择DIC图像，在第二通道中选择荧光图像。
  4. 从工具栏中选择"Multi-Line"工具，并穿过细胞中部从一极到另一极标记细胞。为了获得所有生成线段（线段对象）的列表，请打开"Measure/Region Measurements"。将区域测量设置为仅显示区域标签、距离和平均强度。
  5. 在"Measure/Calibrate Distances"下校准像素大小，使其与您显微镜设置对应的特定像素大小一致，然后点击"Apply To All Open Images"。
  6. 将所有区域（线段对象）转移至荧光通道图像。在"Regions/Transfer Regions"中选择源图像（叠加图像）和目标图像（荧光通道图像）。选择"All Regions"，然后点击"OK"。
    注意：为了能够后续精确重现相同的线段（线段对象、区域、ROI），请打开"Regions/Save Regions"并保存这些区域。
  7. 通过打开"Measure/Region Measurements"并点击"Open Log"，将所有区域测量结果导出至电子表格。确认打开并导出数据。一旦电子表格在后台打开，最后通过点击"F9: Log Data"完成数据导出。
  8. 为确定荧光焦点在细胞中的位置，请打开"Measure/Linescan"。将"Linescan Width"设置为一个值，使之前创建的区域覆盖整个细胞宽度。在剖面图上右键单击并选择"Show Graph Data"。通过左键单击并沿剖面图拖动鼠标指针至感兴趣点，“"Graph Data"”窗口将显示两点之间对应的像素/距离。选择高亮的蓝色行，然后复制其内容。
    注意：通过在"Linescan"窗口中点击"Log Data"，可将整个剖面强度分布记录到电子表格中。提取的数据现在可用于图表可视化或进一步的统计分析。细胞周期中的定位模式可通过细胞长度及沿细胞体的荧光强度的人口统计学图示轻松展示。这些图示可使用先前选定的相同ROI获得。以下步骤将举例说明如何生成类似于图3C和4C所示的人口统计图。
    1. 在Fiji/ImageJ中使用"Metamorph nd & ROI files importer"加载先前在软件中创建的区域标记（.rgn）（步骤5.6）。或者，可直接在Fiji/ImageJ中使用内置的"Segmented Line"工具创建待分析细胞的兴趣区域（ROI）。
    2. 打开"Analyze/Tools/ROI manager"，并标记所有活动列表项"。
    3. 随后，点击"More/Multi Plot"，然后在新的"Multi Plot"窗口中选择"List"。点击一个表格条目，然后选择并"copy all"。接着将其粘贴到一个新的电子表格中。
      注意：请确保最长细胞的数据（具有最多行数的两列对应X和Y）在电子表格中最右侧。
    4. 将电子表格另存为"CSV (Comma delimited) (*.csv)"格式。
    5. 从此处下载R脚本："https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles”10。这些脚本按细胞长度排序，并将所有细胞的荧光强度分布归一化为各细胞荧光的平均值。
    6. 在R软件[版本3.0.1;11]中运行整个脚本"cell profiles function.R"。
    7. 编辑"example plots.R"脚本的第30行，使文件路径指向先前生成的.csv文件所在文件夹。此外，将第31行中的文件名"profile.csv"更改为步骤5.9.4中生成的.csv文件所选用的文件名。之后运行"example plots.R"，并参照"https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles”中的文档以及脚本文件中的注释生成人口统计分析结果。

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结果

诱导分化并生成群集迁移菌落

图1展示了产生副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）群游菌落的关键步骤示意图（图1A-C）。将游动型菌液点种于群游琼脂平板上，并在24 oC下培养，诱导细菌在固体琼脂表面发生群游细胞分化并增殖。一个典型的群游菌落的体视显微镜图像见图2。体视显微镜图像清晰显示，群游菌落边缘向外延伸出群游焰状结构（swarm-flares）。高倍镜下可见，在群游焰状结构区域，细胞仅排列成单层或双层结构，而在菌落中心区域，细胞则堆叠成多层结构（图2A）。群游焰状结构可按照步骤3.8–3.11所述方法（见图1）轻松转移至显微镜载玻片上。重要的是，焰状结构仅包含完全分化的群游细胞群体（图2B），这与菌...

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讨论

本文报道了一种用于显微成像的方法 副溶血性弧菌 游动细胞，随后进行下游分析，旨在解析和量化所研究的荧光标记蛋白的亚细胞定位及其他特征。尽管目前已有一些用于显微图像处理与分析的工具14,15,16,17,18，对 副溶血性弧菌 运动细胞的观察仍然具有挑战性，主要是因为它们通常存在于密集的细胞群落中，且细胞长度存在较大差异图2）。因此，自动细胞检测有时会出现错误，导致结果可靠性较低。本方案概述了一种用于培养、成像和分析成群运动细菌细胞的流程 副溶血性弧菌，该方案针对这些细胞的特定需求进行了优化，例如在表面提供可控的生长环境，并进行后续图像分析，以适应紧密生长且长度各异的细胞的存在。

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致谢

本工作由马克斯·普朗克学会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养基组分
LB培养基RothX968.3
Difco 琼脂，颗粒状BD214510用于制备含LB培养基的LB琼脂
Difco 心脑浸出液琼脂（Heart Infusion Agar）BD244400用于制备HI琼脂群游平板
Agarose NEEO，超纯级Roth2267.3用于制备显微镜观察用琼脂糖垫
名称公司目录编号备注
添加剂
L-阿拉伯糖Roth5118.3用于诱导pBAD衍生物
2,2'-联吡啶Sigma AldrichD216305-25G用于制备HI琼脂群游平板
二水合氯化钙Roth5239.1用于制备HI琼脂群游平板
氨苄青霉素钠盐RothK029.3
氯霉素Roth3886.3
PBS缓冲液--磷酸盐缓冲盐水的标准配方
D(+)蔗糖Roth4621.1用于制备电转感受态细胞
甘油Roth3783.5用于制备电转感受态细胞
名称公司目录编号备注
硬件
带凸缘的150 mm × 20 mm培养皿Sarstedt82.1184.500用于制备HI琼脂群游平板
kelvitron t (B 6420)Heraeus-用于干燥HI琼脂群游平板
Gene Pulser Xcell 微生物系统BioRad1652662用于质粒DNA的电穿孔
名称公司目录编号备注
软件
MetaMorph Offline（版本 7.7.5.0）Molecular Devices-用于显微镜图像分析
ExcelMicrosoft-用于显微镜数据分析

参考文献

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