超声心动图检查在小鼠中经常使用。为此已开发出昂贵的高分辨率超声设备。本方案描述了一种经济实惠的超声心动图操作流程，并结合组织学形态计量分析，以确定心脏形态。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，可用的转基因小鼠模型数量不断增加，同时在小鼠中开展的药理学研究也十分广泛。对这些小鼠模型进行表型特征鉴定时，常需评估其心脏功能与形态。超声心动图和磁共振成像（MRI）是常用于表征小鼠心脏功能与形态的两种方法。专为小型啮齿类动物设计的超声心动图和MRI设备 昂贵且需要专用空间。本方案描述了使用配备15 MHz人体血管探头的临床超声心动成像系统对小鼠进行心脏测量的方法。测量在麻醉后的成年小鼠上进行。每只动物至少记录并分析三个心动周期的M型超声图像，采用胸骨旁短轴切面。随后进行心脏组织学检查，并在苏木精-伊红染色或麦芽凝集素（WGA）染色的石蜡切片上测定心肌细胞直径。在Pecam-1免疫组化染色后，通过形态测量法确定血管密度。该方案已成功应用于药理学研究，以及不同遗传性动物模型在基础状态和通过永久结扎左前降支冠状动脉（LAD）诱导心肌梗死后的研究。根据我们的经验，超声心动成像仅限于麻醉动物，适用于体重至少25 g的成年小鼠。
引言
可获得多种转基因小鼠模型，且针对小鼠的药理学研究数量众多1,2超声心动图和磁共振成像常用于这些小鼠模型中心脏功能和形态的表型表征3本方案旨在分析成年小鼠的心脏功能与形态，结合了超声心动图、组织学及免疫组织化学检测方法。超声心动图检查在小鼠中被广泛应用4,5,6,7,8,9,10,11,12. Pachon 等11 确定了已发表的205项研究 循环, 循环研究, 美国生理学杂志 - 心脏与循环生理学，以及 心血管研究 2012年至2015....
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方案
本文所述实验均遵守相关的机构规定及法国动物福利法律法规、指南和政策。实验已获得法国伦理委员会（Comité Institutionnel d'Ethique Pour l'Animal de Laboratoire；批准编号 NCE/2012-106）的批准。
1. 超声心动图
- 使用标准实验室天平称量小鼠体重，操作时轻轻抓住其尾巴以确保正确摆放位置。
- 通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对动物进行麻醉25,26。
注意：若在整个研究过程中采用相同的麻醉方案，也可使用其他类型的麻醉剂。其优缺点将在下文讨论。 - 将小鼠放回其笼中，等待其失去反应性、呼吸平稳且后肢反射消失。为测试此状态，可轻微挤压一只脚，观察腿部是否仍会回缩。
- 使用商用啮齿类动物剃毛器剃除左侧胸壁及左腋下的毛发。
注意：使用专用的啮齿类动物剃毛器可彻底清除细小的鼠毛，避免干扰超声心动图测量。应避免使用市售脱毛膏或脱毛液，因其通常含有香料，可能在动物苏醒后引起不适。避免过度剃毛，以免增加热量散失。 - 将处于睡眠状态的动物置于设定温度为 40 - 42 °C 的加热垫上，采取轻度左侧卧位，头部朝向12点钟方向，尾部朝向6点钟方向。用胶带固定左前肢、左后肢和尾巴....
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结果
在图1中，代表性超声心动图记录展示了超声心动图在识别基因修饰小鼠心脏表型方面的有效性。具有正常心脏功能的小鼠（图1A）与左心室扩张且左心室功能降低的小鼠（图1B）之间的差异可被轻松识别。图2展示了使用苏木精-伊红染色的心脏石蜡切片及心脏组织纵向切片测量，在无心脏肥厚（图2A）和有心脏肥厚（图2B）动物中心肌细胞直径测量结果的比较。图3说明了使用WGA染色的心脏石蜡切片测量对照组小鼠（图3A）和心脏肥厚动物（图3B）心肌细胞横径的方法。
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讨论
已开发出多种方法用于评估小鼠的心脏结构和功能，包括超声心动图、对比增强磁共振成像（MRI）、微型CT和正电子发射断层扫描（PET）。由于成本较低且操作简便，超声心动图是目前小鼠功能分析中最广泛使用的技术11。通常情况下，由于小鼠心脏体积小且心率较快，应使用频率>10 MHz的探头，尽管已有使用8 MHz或9 MHz探头成功测量的报道4,7。由于心脏功能与体温和心率密切相关，因此在整个研究过程中控制这些参数至关重要。必须将小鼠置于加热垫上，以维持麻醉动物体温恒定。理想情况下，应使用带有直肠探针的可控加热垫，将体温设定为38 °C。若无此设备，加热垫的温度应设置为比该值高2至3度。应避免使用加热灯，因其会增加操作难度并对动物造成过热风险。
为了控制心率和心脏功能，麻醉剂的类型至关重要。大多数研究使用异氟烷（isoflurane），因其可通过诱导室吸入（3% 异氟烷）轻松诱导麻醉，通过面罩吸入维持麻醉（1–2% 异氟.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由法国政府（国家科研署，ANR）资助 "未来投资" LABEX SIGNALIFE 项目（编号 ANR-11-LABX-0028-01）以及法国抗癌研究协会、法国基金会和法国国家健康与医学研究院癌症计划向 K. D. W. 提供的资金支持。D. B. 和 A. V. 分别获得了法国医学研究基金会和尼斯市政府的博士后资助。本研究所用的超声心动图仪及换能器由飞利浦公司慷慨提供。我们感谢 A. Borderie、S. Destree、M. Cutajar-Bossert、A. Landouar、A. Martres、A. Biancardini 和 S. M. Wagner 提供娴熟的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 与四甲基罗丹明偶联的小麦胚芽凝集素（WGA） | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| 生物素化山羊抗兔IgG抗体 | Vectorlabs | BA-1000 | |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（过氧化物酶，标准型） | Vectorlabs | PK-6100 | |
| 含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂 | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-二氨基联苯胺片剂 | Sigma | D4168 | |
| 过氧化氢溶液 | Sigma | H1009 | |
| 抗Pecam-1（CD31）抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 超声传导凝胶，Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| 线性超声探头，L15-7io | Philips Healthcare | ||
| 超声心动图仪，IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| 显微镜，Leica DMi8 | Leica | ||
| DAPI荧光滤光片组 | Leica | 11525304 | |
| TxR滤光片组 | Leica | 11525310 | |
| 数码相机，SPOT RT3彩色滑轨 | Spot Imaging | ||
| 成像软件，SPOT 5.2高级与基础软件 | Spot Imaging | ||
| 成像计算机 | Dell | ||
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 大剪刀 | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| 手术刀片 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe镊子 | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| 啮齿类动物剃毛器 | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| 石蜡包埋盒 | Sakura | 4155F | |
| 中性缓冲福尔马林 | Sakura | 8727 | |
| 二甲苯 | Sakura | 8733 | |
| 石蜡TEK III | Sakura | 4511 | |
| 自动包埋装置，Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| 石蜡包埋工作站Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| 切片机刀片，Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| 显微镜载玻片，Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| 盖玻片，Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| 封片介质Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| 载玻片盒 | Sakura | 3958 | |
| 伊红溶液 | Sakura | 8703 | |
| 苏木精溶液 | Sakura | 8711 | |
| 切片机，RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| 水浴锅，Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| 乙醇 | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml离心管 | VWR | 734-0451 | |
| 染色玻璃皿 | VWR | MARI4220004 | |
| 染色缸 | VWR | MARI4200005 | |
| 培养箱 | Binder | 9010-0012 | |
| DAB和尿素过氧化氢片剂，SIGMAFAST 3,3′-二氨基联苯胺片剂 | Sigma | D4293 | |
| PBS（10X） | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
参考文献
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological resear....
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重印与许可
