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方法文章

小鼠心脏形态的超声心动图与组织学检查

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DOI：

10.3791/55843

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2017年10月26日

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

本文内容

摘要

超声心动图检查在小鼠中经常使用。为此已开发出昂贵的高分辨率超声设备。本方案描述了一种经济实惠的超声心动图操作流程，并结合组织学形态计量分析，以确定心脏形态。

摘要

近年来，可用的转基因小鼠模型数量不断增加，同时在小鼠中开展的药理学研究也十分广泛。对这些小鼠模型进行表型特征鉴定时，常需评估其心脏功能与形态。超声心动图和磁共振成像（MRI）是常用于表征小鼠心脏功能与形态的两种方法。专为小型啮齿类动物设计的超声心动图和MRI设备 昂贵且需要专用空间。本方案描述了使用配备15 MHz人体血管探头的临床超声心动成像系统对小鼠进行心脏测量的方法。测量在麻醉后的成年小鼠上进行。每只动物至少记录并分析三个心动周期的M型超声图像，采用胸骨旁短轴切面。随后进行心脏组织学检查，并在苏木精-伊红染色或麦芽凝集素（WGA）染色的石蜡切片上测定心肌细胞直径。在Pecam-1免疫组化染色后，通过形态测量法确定血管密度。该方案已成功应用于药理学研究，以及不同遗传性动物模型在基础状态和通过永久结扎左前降支冠状动脉（LAD）诱导心肌梗死后的研究。根据我们的经验，超声心动成像仅限于麻醉动物，适用于体重至少25 g的成年小鼠。

引言

可获得多种转基因小鼠模型，且针对小鼠的药理学研究数量众多1,2超声心动图和磁共振成像常用于这些小鼠模型中心脏功能和形态的表型表征3本方案旨在分析成年小鼠的心脏功能与形态，结合了超声心动图、组织学及免疫组织化学检测方法。超声心动图检查在小鼠中被广泛应用4,5,6,7,8,9,10,11,12. Pachon 等11 确定了已发表的205项研究 循环, 循环研究, 美国生理学杂志 - 心脏与循环生理学，以及 心血管研究 2012年至2015年间采用动物超声心动图检查的研究。

超声心动图可用于鉴定基因修饰小鼠的心脏表型5,6,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22，也可用于分析小鼠在慢性超负荷诱导的肥厚、心肌缺血及心肌病模型中的心脏功能（综述见12）。改进的超声心动图设备可实现左心室（LV）收缩期和舒张期容积的标准测量、组织多普勒成像、心肌对比超声以及左心室局部功能和冠状动脉储备的评估12。理想情况下，应在清醒小鼠中进行超声心动图检查，以避免麻醉对心肌收缩功能、自主神经反射调控及心率的负面影响11。然而，该方法受限于需要对动物进行训练；维持体温稳定困难；运动伪影；应激反应；极高的心率；以及实验通常至少需要两名研究人员协作完成，尤其是在研究大量动物时。有趣的是，最近一项研究报道，在经过训练与未经训练的动物之间，超声心动图参数并无差异19。我们是在麻醉小鼠中进行超声心动图测量的。不同的麻醉方案将在下文讨论。

尽管标准分辨率超声心动图（>10 MHz）足以测量成年小鼠左心室的收缩和舒张期尺寸及心脏功能，但该方法在描述潜在结构变化方面存在局限性。因此，我们将 体内 测量结果与组织学和免疫组织化学分析相结合，以测量心肌细胞直径和血管密度等指标。其他组织学和免疫组织化学研究，如细胞增殖检测、凋亡分析、梗死面积测量、纤维化程度评估以及特定标志物表达的检测，也可在相同处理的组织样本上进行，但这些内容不在本实验方案的讨论范围内。将 体内 超声心动图检查与组织学分析相结合，可进一步揭示潜在的结构改变。此外，我们还可进一步补充分子水平和超微结构层面的研究。组织学分析不仅能够完善超声心动图检查的结果，在超声心动图分辨率不足时更显得不可或缺。这种情况尤其见于胚胎致死型基因修饰小鼠模型23,24。

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方案

本文所述实验均遵守相关的机构规定及法国动物福利法律法规、指南和政策。实验已获得法国伦理委员会（Comité Institutionnel d'Ethique Pour l'Animal de Laboratoire；批准编号 NCE/2012-106）的批准。

1. 超声心动图

  1. 使用标准实验室天平称量小鼠体重，操作时轻轻抓住其尾巴以确保正确摆放位置。
  2. 通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对动物进行麻醉25,26。
    注意：若在整个研究过程中采用相同的麻醉方案，也可使用其他类型的麻醉剂。其优缺点将在下文讨论。
  3. 将小鼠放回其笼中，等待其失去反应性、呼吸平稳且后肢反射消失。为测试此状态，可轻微挤压一只脚，观察腿部是否仍会回缩。
  4. 使用商用啮齿类动物剃毛器剃除左侧胸壁及左腋下的毛发。
    注意：使用专用的啮齿类动物剃毛器可彻底清除细小的鼠毛，避免干扰超声心动图测量。应避免使用市售脱毛膏或脱毛液，因其通常含有香料，可能在动物苏醒后引起不适。避免过度剃毛，以免增加热量散失。
  5. 将处于睡眠状态的动物置于设定温度为 40 - 42 °C 的加热垫上，采取轻度左侧卧位，头部朝向12点钟方向，尾部朝向6点钟方向。用胶带固定左前肢、左后肢和尾巴。
  6. 将预热的超声耦合剂涂抹于已剃毛的胸部区域以及探头头部。
  7. 将探头置于胸骨旁左侧，朝向颈部右侧，以获取乳头肌水平的二维（2D）胸骨旁长轴切面图像。将探头顺时针旋转90°，获得乳头肌水平的短轴切面图像。采用最小深度设置并使用放大功能，以最大化图像质量和帧率。将扫描速度设为最大。
    1. 为达到上述设置，可根据仪器和软件的不同选择不同的放大和深度选项。记录短轴切面下的二维引导M型图像27。参见 图1A 和 B27。
      注意：注意避免对胸部施加过大压力，以防引起心动过缓。
  8. 每只动物至少记录3组、每组3个心动周期的动态图像序列。
    注意：对于本研究中使用的超声心动图软件，仅需按一次"Acquire/Save"按钮即可。该方法仅适用于配备此特定软件的超声心动图仪。其他设备可使用不同的软件包。
  9. 成功记录后，用纸巾擦去小鼠胸壁、加热垫和探头上的超声耦合剂，并移除四肢和尾巴上的胶带。
  10. 将小鼠留在加热垫上继续观察，用纸巾覆盖以避免不必要的光照和热量散失，直至其完全苏醒。
  11. 将动物放回其笼中。
  12. 分析来自胸骨旁短轴切面的M型图像，以确定左心室（LV）的尺寸和功能。利用存储图像中组织-血液界面的识别，测量收缩期和舒张期左心室前壁厚度（LVAWs 和 LVAWd）、左心室收缩末期和舒张末期内径（LVIDs 和 LVIDd），以及收缩期和舒张期左心室后壁厚度（LVPWs 和 LVPWd）。
  13. 在左心室舒张末期容积明显最大时测量舒张期参数，在左心室后壁收缩最前移位时测量收缩末期参数。轻触屏幕上的"Analyze"图标，然后点击"LVAWd"图标。将电子游标置于舒张期右心室腔与左心室前壁交界处。
  14. 将电子游标置于左心室前壁与左心室腔之间的界面，以获得左心室舒张期前壁厚度；软件将自动切换至左心室内径舒张末期测量。
  15. 将游标置于左心室腔与左心室后壁之间的界面，以获得左心室内径舒张末期直径；软件将自动切换至左心室后壁厚度测量。
  16. 将游标置于左心室后壁与心包之间的界面，以获得左心室舒张期后壁厚度。对于左心室收缩期参数，轻触屏幕上的"LVAWs"图标，并将电子游标置于收缩期右心室腔与左心室前壁的交界处。
  17. 将电子游标置于左心室前壁与左心室腔之间的界面，以获得左心室收缩期前壁厚度。重复上述步骤，测量左心室内径收缩末期值和左心室收缩期后壁厚度。采用美国超声心动图学会（American Society of Echocardiography）推荐的“ Leading-edge” 法来追踪心内膜和心外膜边界13,27。
    注意：左心室收缩功能参数将基于上述测量值自动计算。左心室缩短分数（FS）定义为 FS (%) = [(LVIDd - LVIDs)/LVIDd] × 100。左心室射血分数（EF）采用改良Teicholz公式计算，即 EF (%) = [(LVIDd3 - LVIDs3)/LVIDd3] × 10012。参见 图1A 和 B。
  18. 将数据存储于光盘或U盘中，并制作备份副本。
  19. 使用适当的软件导入、分析并导出数据。
    注意：完成上述基线测量后，实验可暂时中止。若需直接比较基因敲除动物与其野生型同窝仔鼠，可继续进行组织学分析6。对于Cre-ERT2; lox/lox小鼠品系，可在次日通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导，具体方法见文献5,24。若需通过结扎左冠状动脉诱导实验性心肌梗死5,28，可在超声心动图检查后、动物仍处于麻醉状态下立即进行手术。否则，两次麻醉之间应至少间隔一周，以降低术后死亡率。

2. 组织学评估用心脏样本的制备

  1. 通过颈椎脱位处死动物，测量其体重。使用70%酒精棉片对 胸部和腹部进行消毒。
  2. 在胸骨远端1 cm处的皮肤上做一横向切口。用钝头镊子将胸廓皮肤向头部方向剥离。用精细镊子轻轻夹住胸骨，用精细剪刀的钝端插入并剪开膈肌。
  3. 沿胸骨两侧平行剪开肋骨。将胸骨向头部方向掀开，暴露胸腔内的心脏。用精细镊子夹住心脏的血管干，用精细剪刀在其下方剪断。
  4. 打开胸腔，完整取出心脏，称量心脏重量，并计算心体比4,5,6,23,29,30。
  5. 将心脏置于含2 mL 10%中性缓冲甲醛溶液的15 mL离心管中，于4 °C固定过夜。
    CAUTION: 危险！操作甲醛溶液时必须在化学通风橱中进行；佩戴手套和护目镜。
    NOTE: 由于不同供应商提供的甲醛缓冲液成分可能不同，整个研究过程中应使用同一供应商的产品。
  6. 次日，将心脏在中间位置沿横断面切开，转移至包埋盒中，送至病理科使用自动包埋仪进行石蜡包埋。
  7. 进行切片。
    1. 使用切片机将石蜡包埋块切成3 µm厚度的切片，漂浮于40 °C的蒸馏水水浴中。
    2. 将切片转移至载玻片上，置于37 °C培养箱中过夜干燥，随后于4 °C保存，待染色时使用。
      NOTE: 此处可暂停操作，直至准备进行染色（步骤3）。
  8. 脱蜡并水化组织切片。
    1. 将切片放入带有玻璃衬垫的染色缸中，置于55 °C烘箱内10分钟，以融化石蜡。
    2. 将切片在两份200 mL二甲苯或二甲苯替代剂中各脱蜡5分钟，每次更换新液。
      CAUTION: 高度易燃且有毒！必须在化学通风橱中操作；佩戴手套和护目镜。
    3. 将切片转移至200 mL 100%乙醇中，更换两次，每次3分钟；再经200 mL 95%乙醇一次，3分钟。
      CAUTION: 高度易燃！远离火源，禁止吸烟。
    4. 用200 mL磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗两次，每次5分钟，随后继续进行步骤3、4或5。

3. 苏木精和伊红染色

  1. 将载玻片及其上的切片用蒸馏水冲洗。
  2. 用苏木精溶液染色细胞核 8 分钟。
  3. 用流动的自来水冲洗 10 分钟。
  4. 用伊红溶液染色 2 分钟。
  5. 在 100% 乙醇（EtOH）中脱水三次，每次 2 分钟；在二甲苯或二甲苯替代品中透明化三次，每次 2 分钟；使用基于二甲苯的封片介质封片。
  6. 拍摄载玻片图像，并在室间隔纵向切片中测量细胞核水平的心肌细胞直径；每张切片至少测量 100 个细胞，每只心脏测量三张切片。

4. WGA 染色

  1. 将步骤2.7获得的载玻片置于湿润 chamber 中，与四甲基罗丹明（或其他荧光染料）标记的WGA（1:100 PBS稀释）室温孵育60分钟。
  2. 用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用含 DAPI 的荧光封片剂封片。分析前于 4 °C 避光保存。
    注意：佩戴护目镜并戴上适用的耐化学腐蚀手套。
  4. 拍摄载玻片。
    1. 使用配备荧光落射照明装置以及DAPI和四甲基罗丹明滤光片组的显微镜（参见 材料表将光圈调至最大，亮度设为自动曝光。
    2. 在400倍放大倍数下分别采集蓝色和红色通道的图像。在ImageJ中打开图像。如有必要，调整亮度和对比度（图像 > 调节 > 亮度/对比度
    3. 将每幅图像设置为8位（Image > 类型 > 8位）。叠加DAPI与WGA图像，DAPI使用蓝色通道，WGA使用红色通道，绿色和灰色通道设置为无（图像 > 颜色 > 合并通道31.
  5. 测定室间隔横切面心肌细胞核水平处的心肌细胞直径。
    1. 在 ImageJ 中定义图像的标尺。为此，需拍摄一个已知尺寸物体的图像（例如， 同一放大倍数下，使用血细胞计数室对心脏切片进行观察（步骤4.4）。
    2. 使用直线工具，从已知结构的起点到终点画一条线（分析 > 设置比例尺。
      注意：像素距离将自动显示；需手动输入已知距离及长度单位。在细胞核水平进行心肌细胞的测量。
    3. 从WGA阳性膜经DAPI阳性细胞核画一条直线至WGA阳性细胞膜的对侧（分析 > 测量）。在结果窗口中，确保长度值保留有意义的小数位数（分析 > 设置测量参数 > 小数位。
    4. 每张切片至少测量100个细胞，每只心脏测量三个切片。将结果导出至Excel（点击“结果”） > 文件 > 保存为 > .csv6,31.

5. Pecam-1 免疫染色

  1. 进行抗原修复。
    1. 向压力锅中加入 1,600 mL 柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）。将压力锅置于加热板上并全功率加热。此时不要锁紧压力锅盖，仅将其轻轻盖上。
      警告：高温！
    2. 当柠檬酸钠缓冲液开始沸腾后，将步骤 2.5 中的切片转移至压力锅中。锁紧压力锅盖。当压力锅达到最大压力后，等待 7 分钟。7 分钟后关闭加热板，并将压力锅移至空水槽中。打开压力释放阀，并用冷水冲洗锅体。待压力完全释放后，打开锅盖，并用冷水冲洗锅内 5 分钟。将切片放入 200 mL PBS 中。
      注意：也可采用微波抗原修复法，但存在过热风险。
  2. 使用甲醇中含 0.3% 过氧化氢的溶液封闭内源性过氧化物酶活性，孵育 5 分钟。用 200 mL PBS 洗涤切片三次，每次 2 分钟。
    警告：易燃且有毒！
  3. 将切片在含 5% 正常山羊血清的 PBS 稀释液中孵育 15 分钟，该溶液同时含有亲和素封闭剂（1 mL 中加入 4 滴）。
  4. 轻轻吸去组织切片上的液体，并加入兔源 Pecam-1 抗体，用含 2.5% 正常山羊血清及每毫升含 4 滴生物素封闭剂的 PBS 缓冲液按 1:50 稀释。将切片在 4 °C 湿盒中过夜孵育。
  5. 用 200 mL PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。将切片与生物素化山羊抗兔 IgG 抗体在含 2.5% 正常山羊血清的 PBS 中按 1:200 稀释后室温孵育 1 小时。再用 200 mL PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  6. 将切片与基于亲和素/生物素的过氧化物酶系统孵育 20 分钟（试剂 A 与试剂 B 需在使用前 30 分钟混合）。用 200 mL PBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
  7. 将 1 片 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和 1 片尿素过氧化氢片剂溶于 5 mL 双蒸水中。将切片与 DAB 溶液孵育约 3 分钟，并密切观察显色情况。通过将切片在 200 mL PBS 中轻轻冲洗终止显色反应。
    警告：具有致癌性；请佩戴耐化学腐蚀手套！
  8. 用苏木精复染细胞核 6 分钟。用流动自来水冲洗 2 分钟。在 200 mL 100% 乙醇中脱水三次，每次 2 分钟。在 200 mL 二甲苯或二甲苯替代物中透明三次，每次 2 分钟。用基于二甲苯的封片剂封片。
  9. 拍摄切片图像（每例心脏室间隔至少拍摄 10 个视野，放大倍数为 40 倍），并使用免费的 ImageJ 软件31测量 Pecam-1 的面积密度。使用针对 DAB 和苏木精的染色分离插件32，并将图像对比度调整至相同水平。
    注意：若棕色与紫/蓝色存在显著的光谱重叠，可能导致染色分离困难，可尝试不同品牌的苏木精溶液以获得清晰、浅蓝色的细胞核染色。此外，也可采用免疫荧光法或对毛细血管进行人工计数。

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结果

在图1中，代表性超声心动图记录展示了超声心动图在识别基因修饰小鼠心脏表型方面的有效性。具有正常心脏功能的小鼠（图1A）与左心室扩张且左心室功能降低的小鼠（图1B）之间的差异可被轻松识别。图2展示了使用苏木精-伊红染色的心脏石蜡切片及心脏组织纵向切片测量，在无心脏肥厚（图2A）和有心脏肥厚（图2B）动物中心肌细胞直径测量结果的比较。图3说明了使用WGA染色的心脏石蜡切片测量对照组小鼠（图3A）和心脏肥厚动物（图3B）心肌细胞横径的方法。

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讨论

已开发出多种方法用于评估小鼠的心脏结构和功能，包括超声心动图、对比增强磁共振成像（MRI）、微型CT和正电子发射断层扫描（PET）。由于成本较低且操作简便，超声心动图是目前小鼠功能分析中最广泛使用的技术11。通常情况下，由于小鼠心脏体积小且心率较快，应使用频率>10 MHz的探头，尽管已有使用8 MHz或9 MHz探头成功测量的报道4,7。由于心脏功能与体温和心率密切相关，因此在整个研究过程中控制这些参数至关重要。必须将小鼠置于加热垫上，以维持麻醉动物体温恒定。理想情况下，应使用带有直肠探针的可控加热垫，将体温设定为38 °C。若无此设备，加热垫的温度应设置为比该值高2至3度。应避免使用加热灯，因其会增加操作难度并对动物造成过热风险。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国政府（国家科研署，ANR）资助 "未来投资" LABEX SIGNALIFE 项目（编号 ANR-11-LABX-0028-01）以及法国抗癌研究协会、法国基金会和法国国家健康与医学研究院癌症计划向 K. D. W. 提供的资金支持。D. B. 和 A. V. 分别获得了法国医学研究基金会和尼斯市政府的博士后资助。本研究所用的超声心动图仪及换能器由飞利浦公司慷慨提供。我们感谢 A. Borderie、S. Destree、M. Cutajar-Bossert、A. Landouar、A. Martres、A. Biancardini 和 S. M. Wagner 提供娴熟的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
与四甲基罗丹明偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）Life Technologies, Molecular ProbesW849
生物素化山羊抗兔IgG抗体VectorlabsBA-1000
亲和素/生物素封闭试剂盒VectorlabsSP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（过氧化物酶，标准型）VectorlabsPK-6100
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂VectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3,3'-二氨基联苯胺片剂SigmaD4168
过氧化氢溶液SigmaH1009
抗Pecam-1（CD31）抗体Abcamab28364
超声传导凝胶，Gel Aquasonic 100Parker
线性超声探头，L15-7ioPhilips Healthcare
超声心动图仪，IE33 xMATRIXPhilips Healthcare
显微镜，Leica DMi8Leica
DAPI荧光滤光片组Leica11525304
TxR滤光片组Leica11525310
数码相机，SPOT RT3彩色滑轨Spot Imaging
成像软件，SPOT 5.2高级与基础软件Spot Imaging
成像计算机Dell
精细剪刀Fine Science Tools14028-10
大剪刀Fine Science Tools14501-14
手术刀片Fine Science Tools10023-00
Graefe镊子Fine Science Tools11650-10
啮齿类动物剃毛器Harvard Apparatus34-0243
石蜡包埋盒Sakura4155F
中性缓冲福尔马林Sakura8727
二甲苯Sakura8733
石蜡TEK IIISakura4511
自动包埋装置，Tissue-Tek VIPSakura6032
石蜡包埋工作站Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
切片机刀片，Accu-Edge S35Sakura4685
显微镜载玻片，Tissue-TekSakura9533
盖玻片，Tissue-TekSakura9582
封片介质Tissue-TekSakura1408
载玻片盒Sakura3958
伊红溶液Sakura8703
苏木精溶液Sakura8711
切片机，RM2125RTLeica720-1880 (VWR)
水浴锅，Leica HI1210Leica720-0113(VWR)
乙醇VWRACRO444220050
15 ml离心管VWR734-0451
染色玻璃皿VWRMARI4220004
染色缸VWRMARI4200005
培养箱Binder9010-0012
DAB和尿素过氧化氢片剂，SIGMAFAST 3,3′-二氨基联苯胺片剂SigmaD4293
PBS（10X）Thermo Fisher Scientific70011044

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小鼠心脏形态的超声心动图与组织学检查
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