我们开发了一种研究异细胞群体在扰动下动态变化的新方案。本文描述了一个基于成像的平台，可稳健地同时对异细胞群体中多种细胞表型进行定量数据采集和特征分析。
本文内容
摘要
摘要
细胞过程十分复杂，源于多种细胞类型与其环境之间的相互作用。现有的细胞生物学技术往往难以准确解读这种相互作用。我们采用一种基于定量成像的方法，提出了一种高内涵实验方案，用于表征异质性细胞群体在环境刺激变化下的动态表型响应（即 形态变化、增殖、凋亡）。我们强调，可根据具体应用需求，通过荧光强度或细胞固有的形态特征来区分不同细胞类型。该平台能够在更短的时间内，使用更少的试剂，并以更低的误差概率，实现对亚群响应扰动的更全面表征，优于传统的细胞生物学检测方法。然而，在某些情况下，由于细胞特征复杂，可能难以识别和定量细胞群体，需要额外的故障排查；我们在本方案中指出了其中一些情况。我们以癌症模型中对药物的响应为例展示了该方法的应用，但该方案也可广泛适用于其他生理过程的研究。本方案可帮助研究人员在共培养体系中识别出不同的细胞亚群，并分别表征它们对外部刺激的特异性响应。
引言
基于细胞的检测方法在基础研究和药物开发中一直发挥着重要作用。然而，随着标准检测方法的局限性日益显现，其结果与实际情况之间的不一致性也愈发突出 体外 以及临床数据，且大多数药物未能获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。在此，我们提出一种新方法，利用定量成像技术，同时分析在相关且共存的环境刺激下异质细胞表型的变化。
用于检测细胞活力的传统基于细胞的检测方法包括：台盼蓝排斥法、MTT/MTS 法以及 Annexin V-FITC 流式细胞术染色。台盼蓝排斥法虽然操作简单且成本低廉，但需要大量细胞，耗时较长，并且常受到操作者主观偏差的影响1。MTT 和 MTS 检测法通过测定线粒体代谢速率间接评估细胞活力。然而，细胞的代谢活性可能受不同培养条件（如培养基或氧气浓度）的影响，导致结果不准确，并阻碍了在不同细胞类型和实验条件间的标准化2,3。这些技术的另一主要缺点是无法区分多种细胞类型——大多数生物系统均为异质性细胞群体。尽管流式细胞术能够区分不同的细胞亚群，但仍需使用细胞标记物，动态取样具有挑战性，而在使用贴壁细胞时，该方法更显耗时且易引入误差。
其他重要的细胞表型，包括形态学变化，会在环境刺激下发生，但传统的基于细胞的检测方法无法捕捉到这些变化。通过形态学特征分析细胞状态，并绘制不同样本间的相似性图谱，是一种强大且无偏倚的工具，能够为包括基础细胞生物学和药物发现在内的基础与转化研究的诸多方面提供新颖的见解4。此外，已有研究表明肿瘤细胞的形态与肿瘤亚型5及侵袭性6相关。因此，研究这些细胞特征及其与特定环境扰动之间的关系具有重要意义。此外，还可以利用形态学特征的差异来区分共培养系统中的不同细胞亚群。对细胞进行荧光标记存在一些缺点（例如改变细胞固有特性、耗时较长），因此开发其他用于细胞类型分类的方法具有优势。
基于显微镜的成像技术是一种以多重、定量且稳健的方式分析细胞表型的替代方法。在本研究中，我们应用定量成像流程，以揭示肿瘤内异质性细胞群体的进化动态。我们重点关注非小细胞肺癌（NSCLC）细胞与癌症相关成纤维细胞（CAFs）之间的相互作用，后者是肿瘤中最常见的间质细胞类型。已有研究表明，CAFs参与了肿瘤的发生、发展及治疗反应；因此，在缺乏CAFs的情况下对肿瘤细胞进行表型检测可能产生误导性结果7,8,9。具体而言，我们评估了CAFs在厄洛替尼（erlotinib）处理下对肿瘤细胞的影响。厄洛替尼是一种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的小分子药物，常用于NSCLC的临床治疗。我们采用高内涵筛选平台及其配套图像分析软件进行评估；但为了使该方法更易于被其他研究人员使用，我们还开发了一种可比的下游分析流程，使用开源软件CellProfiler10和CellProfiler Analyst11。目前大多数基于图像的高内涵筛选实验均依赖于特定仪器型号的商业化软件进行分析，由于底层算法通常为专有技术，导致不同实验室使用不同软件时难以重复实验结果。通过该基于图像的分析流程，我们利用基于荧光和形态学分类的方法，测量了异细胞共培养体系中各亚群在药物处理下的细胞增殖、死亡及形态变化。以下实验方案为研究复杂细胞过程提供了一种稳健的方法学基础。
方案
1. 细胞培养
注意：本研究探讨了非小细胞肺癌细胞（H3255）与肺成纤维细胞（CCD-19Lu GFP）共培养时，对靶向EGFR的药物厄洛替尼的表型反应。针对同一数据集，采用了基于荧光和基于形态学的分类方法对两种细胞群体（H3255和CCD-19Lu GFP）进行分类，以示例说明两者结果的一致性。然而，在实际应用中仅需选用其中一种分类方法，具体选择应根据实验目的而定。
- 配制500 mL RPMI-1640培养基，添加10%热灭活的胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
注意：可根据其他细胞类型的需求更换培养基和添加剂。 - 将细胞以纯种形式在10 cm3培养皿中培养，置于37 °C、5% CO2条件下，每3-4天按适当比例传代一次。
2. 细胞的制备
- 制备细胞悬液时，移除细胞培养基，并用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 吸除 PBS，加入 1 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 5 分钟（或直至细胞不再贴壁）。
- 为中和胰蛋白酶，向 H3255 和 CCD-19Lu GFP 培养板中各加入 4 mL RPMI 培养基，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 在室温下以 150 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL RPMI 培养基中，置于圆锥形离心管内，准备接种。
3. 细胞铺板
- 计数细胞以标准化接种。
- 倒置离心管以混匀细胞悬液。用移液器将每种细胞悬液各10 µL转移至微量离心管中，加入10 µL台盼蓝。
- 将10 µL该溶液用移液器加入细胞计数板中，然后插入自动细胞计数仪。
注意：其他细胞计数方法（即 血细胞计数板）可被使用。 - 至少重复细胞计数三次，或直至获得的计数结果一致。
- 将种子细胞接种至多孔板中
注意：接种培养板的数量取决于将要成像的时间点数量。或者，如果细胞已转导组蛋白2B-GFP（或其它可提供足够核分割的稳定慢病毒核染料），则可对同一块培养板在不同时间点进行重复成像。- 在100 µL RPMI培养基中每孔接种总计1,500个细胞。制备三种细胞悬液以接种三种细胞群体：H3255、CCD-19Lu GFP，以及50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP。每个时间点均设置三复孔，且培养板设置保持一致。
注意：初始接种密度应针对每种细胞系和培养板尺寸进行优化。 - 使用多通道移液器在3个96孔板中接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养细胞。2.
- 在100 µL RPMI培养基中每孔接种总计1,500个细胞。制备三种细胞悬液以接种三种细胞群体：H3255、CCD-19Lu GFP，以及50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP。每个时间点均设置三复孔，且培养板设置保持一致。
4. 药物给药
- 将DMSO加入厄洛替尼粉末中，配制成终浓度为10 mM的厄洛替尼储备液。
注意：可根据需要替换药物。 - 用细胞培养基将药物稀释至最终浓度的2倍，最高终浓度为10 µM，并以1:10的比例连续稀释四次，共获得五个药物浓度梯度及一个无药物对照组。
注意：若在最高药物剂量下DMSO浓度等于或超过0.1% v/v，则无药物对照组应含有等量的DMSO，以确保所观察到的效应并非由DMSO毒性引起。 - 将100 µL药物溶液加入相应孔中，使药物在培养基中的终浓度为1x。
5. 图像采集
注意：图像分别在第0天、 第2天和第3天采集。根据所研究的细胞类型和细胞过程，也可选择其他合适的时间点进行观察。
- 对细胞进行染色以准备成像。
- 配制染料溶液，使其达到以下终浓度。
- 用于基于荧光的分类时，在 PBS 中配制 5 µg/mL 核染料和 5 µM 死细胞染料（参见 材料表).
- 用于形态学分类时，在 PBS 中配制 5 µg/mL 核染料、5 µM 死细胞染料和 5 µM 细胞染料（参见 材料表).
- 每孔加入20 µL染料溶液，在37 °C避光孵育30分钟。
- 配制染料溶液，使其达到以下终浓度。
- 优化并采集图像。
- 从培养箱中取出培养板，用70%乙醇擦拭板底，然后将培养板放入成像室中。
- 在“设置”选项卡中，点击“通道选择”下方的“+”按钮，以添加适当的成像通道即 明场、细胞核染色、死细胞染色、GFP 和 RFP 信号
- 点击“布局选择”，从0 µm开始，以2 µm为间隔获取至20 µm的z轴层扫测试图像，以确定焦平面位置。将该距离作为每个通道的“高度”参数输入。
- 在每个通道下方点击“快照”以评估信号强度并优化曝光时间。根据需要在“时间”下输入更高或更低的数值。
- 在屏幕右侧，于孔板示意图上标出需要成像的相应孔位。在下方的孔内视野示意图中，以类似方式标出需要成像的二十五个视野区域。
- 在“运行实验”中，于左侧标签页的“板名称”下识别相应孔板，然后点击下方的“开始”按钮，以10X物镜运行图像采集程序，从而在上述通道中生成灰度TIFF图像。
注意：不同仪器的成像方案分步操作说明可能有所差异，但参数值仍需进行优化。 - 在第二天和第三天重复成像。
6. 图像分析
注意：所有图像分析均使用专有软件完成。然而，由于该软件并非公开可用，因此还在 CellProfiler 2.2 和 CellProfiler Analyst 2.0 上设计了可比的分析流程，简要方案列于下文，详细方案作为补充材料提供（测试图像已载入流程中以验证工作流程）。本实验的图像按孔为单位进行分组，以便每个孔的图像可单独加载。以下 CellProfiler 流程包含一个正则表达式，用于从每个图像文件名中解析元数据信息，并允许图像按通道进一步分组。
- 下载并安装开源软件：“CellProfiler”和“CellProfiler Analyst”。安装过程中接受所有默认选项和附加组件。
- 将异细胞共培养物分类为亚群。
- 打开“CellProfiler”软件，点击“文件”|“导入流程”|“从文件”，并选择相应的文件（"Fluorescence_Classification.cppipe" 基于荧光的分类, 或 "Morphology_Classification.cppipe" 基于形态学的分类）。
注意：这些文件包含基本图像处理和细胞核/细胞分割的实验方案。由于这些细胞中的Hoechst染色不均匀，因此先对细胞核进行分割并扩大，然后用其作为掩膜对图像进行遮蔽，以便实现对荧光强度较低的细胞核进行分割。- 选择基于荧光的分类流程，根据eGFP强度将细胞分类为H3255或CCD-19Lu，并计算形态学特征。
注意：CCD-19Lu 细胞已用 GFP 转导。 - 选择基于形态学的分类流程，以分割细胞核和细胞，并计算形态学特征。
注意：需要在“CellProfiler Analyst”中进行进一步的下游分析以实现分类。死细胞通过基于荧光的分类方法进行分类。
- 选择基于荧光的分类流程，根据eGFP强度将细胞分类为H3255或CCD-19Lu，并计算形态学特征。
- 单击屏幕左下角的“查看输出设置”。选择用于分析的图像文件位置（“默认输入文件夹”）以及提取数据的保存位置（“默认输出文件夹”）。
- 单击“分析图像”以开始分析。分析完成后，单击“确定”，然后前往“默认输出文件夹”查看计算结果。
注意：示例参数值和图像可在 补充文件1-CellProfiler实验方案.pdf. - 仅在进行基于形态学的分类时，执行以下操作。
- 打开“CellProfiler Analyst”软件，选择在 CellProfiler 中生成的数据库属性文件，然后点击“打开”。
- 单击屏幕左上角的“Classifier”选项卡。要从实验中调用随机细胞图像，请单击“Fetch”；图像将显示在未分类窗口中。
- 手动将细胞分类为阳性（H3255）或阴性（CCD-19Lu），方法为选择细胞并将其拖动至相应的分选区域（参见 补充文件 2-Pipeline.pdf: 图B对每个亚群至少分类50个细胞后，点击“Train Classifier”，然后点击“Check Progress”。
注意：细胞通过用户监督的随机森林机器学习算法进行分类12. 如果准确率未达到批准的阈值（>90%），可能需要返回并优化“CellProfiler”中的细胞分割，或者这些细胞可能不适合通过形态学进行分类。 - 单击“全部评分”以生成包含每个亚群细胞计数的表格。
- 打开“CellProfiler”软件，点击“文件”|“导入流程”|“从文件”，并选择相应的文件（"Fluorescence_Classification.cppipe" 基于荧光的分类, 或 "Morphology_Classification.cppipe" 基于形态学的分类）。
结果
我们生成了一组图像，包含每孔25个视野，每块板54个孔（3种细胞群体 × 6种药物浓度 × 3个重复），共三块板，总计4,050张独立图像。实验过程中生成的图像集使用专有软件（见材料表）进行分析，以提取细胞的多种定量特征即 形态学、荧光）可用于对细胞亚群进行分类。然而，由于所使用的商业软件访问受限，因此在 CellProfiler 和 CellProfiler Analyst 中建立了可比较的下游分析流程。
异细胞分类为亚群
基于DNA染色（此处为Hoechst）对细胞核进行识别和分割，并根据荧光或形态学特征对细胞群体进行分类（图1）。在基于荧光的分类中，成纤维细胞（CCD-19Lu）先前已被GFP慢病毒转导。测量每个细胞核的GFP荧光强度，高于设定阈值（基于背景信号）的细胞被归类为CCD-19Lu，低于该阈值的则被识别为肿瘤细胞（H3255）。在基于形态学的分类中，细胞先前使用一种无毒的细胞染料进行染色（见材料表），用于识别和分割细胞质。利用来自每种细胞群体的约50–100个细胞训练机器学习算法，识别出在不同细胞群体间存在显著差异的形态学特征，并据此构建线性分类器以区分CCD-19Lu和H3255细胞。在未处理条件下，荧光与形态学分类方法在区分两种细胞群体上的一致性为97.4%（n = 1403），在药物处理条件下（1 µM erlotinib）的一致性为92.5%（n = 916）（图2）。
亚群的表型分析
除了区分细胞类型外，我们还旨在表征各亚群的表型特性。多重检测技术可节省时间和试剂，提高实验一致性，并为所研究的系统提供更丰富的信息。潜在的表型检测指标多种多样，应根据具体研究问题选择合适的检测项目。本文中考察了厄洛替尼处理后细胞形态和存活状态的变化。经过三天的药物处理后，H3255细胞的核面积减小，细胞面积增大。图3A) 被观察到。通过双侧t检验（类型2，假设方差相等），发现“无药物”组与“药物处理”组之间核面积的平均差异具有统计学显著性。 t-检验（p = 7.92 × 10-16我们推测，这一现象是细胞对药物处理所施加的压力产生的应答反应。
同样值得关注的是研究一种药物是否具有细胞毒性（即 随时间推移死细胞数量增加）或细胞抑制性（即 随着时间推移细胞增殖数量减少）对细胞的影响，因为这具有重要的临床意义。例如，细胞毒性药物效应可诱导细胞生长停滞，但并未清除肿瘤中的细胞，因此一旦停药，癌细胞有可能重新启动增殖。药物效应通常依赖于细胞所处的微环境、药物浓度以及细胞类型。我们此前观察到厄洛替尼（erlotinib）在一种细胞类型中引发细胞毒性反应，而在另一种细胞类型中则表现为细胞抑制性反应13.
传统的细胞活力检测方法输出的是相对细胞数量，因此无法区分细胞生长停滞与细胞死亡。在此，通过碘化丙啶染色来鉴定死亡细胞（图3B）。在H3255细胞中观察到厄洛替尼具有细胞毒性和细胞抑制性双重效应，表现为药物处理后死亡细胞数量增加，同时新生细胞数量减少（图3C）。值得注意的是，给药后第1天起死亡细胞数量下降，这可能是由于细胞清除作用所致。CCD-19Lu细胞不受该药物影响。该平台的另一优势在于能够生成定量数据。例如，在我们的共培养实验中，初始有1,118个（75.8%）H3255细胞亚群，在无厄洛替尼处理条件下3天后增至2,817个（87.9%），而在厄洛替尼处理条件下则减少至396个（57.2%）（图4）。由于本方法可提供实际细胞计数值，而非流式细胞术等方法所得的相对百分比，因此我们得出结论：药物处理期间群体组成的变化是由于H3255细胞数量减少，而非CCD-19Lu细胞数量增加。需要指出的是，由于细胞清除作用的存在，死亡率可能被低估，而细胞清除在实验上难以准确评估，且可能在不同细胞类型间存在差异。
图1：图像分析方案概述。 两条可能的下游图像分析流程，用于对异质细胞群体进行分类，分别基于形态学分类或荧光信号分类。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：形态学分类与基于荧光的分类之间的一致性。（A）一致性图显示了两种分类方法的重叠情况。相同的细胞在基于形态学和基于荧光的分类中均被归类为H3255。两种方法具有高度一致性，对于未处理细胞，97.4%（n = 1403）的细胞分类结果一致；对于经厄洛替尼处理的细胞，92.5%（n = 916）的细胞分类结果一致（注：白色区域过小，无法可视化）。（B）10倍放大图像，展示基于荧光与基于形态学分类之间一致性良好和较差的示例。白色箭头指示在两种平台间分类不一致的细胞。输入图像：蓝色——细胞核（Hoechst）；绿色——CCD19Lu（GFP）。分类图像：红色——H3255；绿色——CCD-19Lu。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：来自同一实验设置的多重表型测量结果。（A）在有药和无药条件下，于单细胞水平计算形态学特征，如细胞核和细胞面积。注意：面积小于100 µm2的细胞被视为碎片，不纳入分析。箱线图显示中位数、第一和第三四分位数范围，以及95%置信区间误差线。（B）H3255（蓝色）和CCD-19Lu（绿色）细胞共培养，根据碘化丙啶染色（红色）的强度识别死细胞，并使用10X物镜成像。比例尺 = 1 mm（上图）；100 µm（下图）。（C）在有或无药物处理的情况下，连续三天计算活细胞和死细胞的总数，结果显示加入厄洛替尼后活细胞数量明显减少，死细胞数量增加。误差线表示基于三个重复样本的平均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：随时间变化的亚群动态。 第0天和第3天含有H3255（蓝色）和CCD-19Lu（绿色）的孔的代表性10倍放大图像，包括有药和无药条件。对每个亚群的细胞进行计数，比例饼图显示了各样本间群体组成的实际变化。比例尺 = 1 mm（中间图，显示于最左图）、1 mm（顶部图像）、100 µm（底部图像）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
上述方案通过在减少试剂使用量和时间消耗的同时，提供对多种细胞类型在环境扰动下表型动态的更全面洞察，从而改进了现有的细胞生物学检测方法。该实验设计的一个主要优势在于，仅需一次实验设置即可分析多种表型，并在单细胞水平上生成定量数据以表征这些表型。该平台的一项技术优势是相较于其他检测方法，初始故障排查更为简便。由于该方法基于成像，研究者可直观检查各孔是否存在接种密度过高或过低的情况。建议在整个实验过程中保持细胞处于指数生长期，避免因营养或空间限制而受限，或因接种密度过低导致细胞衰老而产生干扰。否则，细胞的增殖与死亡速率在不同实验之间可能无法重现。作为参考，CellPD 是一个公开可用的用于计算细胞增殖和死亡速率的程序14。此外，研究者还可直观判断各孔中染料的浓度是否充足。单个孔的移液问题可能导致细胞分割错误和数据偏差，但通过上述方案可轻松检测到此类问题。
遗憾的是，并非所有细胞类型都适用于此应用。准确分割细胞核和细胞至关重要，因此对于形成更接近球形或成团结构的细胞，可能并不适合进行此类分析。对于某些细胞，在接种前使用细胞筛过滤可能有助于确保初始接种时为单细胞状态。此外，线性分类器技术仅适用于能够基于形态学特征轻易区分的细胞类型。
要确保本实验方案的成功，首先优化成像条件至关重要，因为后续分析的有效性依赖于图像的质量。尽管本研究使用了高内涵筛选平台进行实验，但图像采集也可通过任何荧光显微镜完成（尽管自动化成像平台更适用于高通量研究）。每次成像时间点之前应先采集测试图像，以确保显微镜或实验方案不存在问题。信噪比应保持较高水平，尤其是用于分割的通道即 细胞核、细胞染料）。此外，选择最佳焦平面成像至关重要。若图像失焦，分割将变得困难，所计算的形态学特征也可能不准确。不同视野间的照明差异同样会影响图像分割。亮度差异过大会导致自动选择阈值困难。此外，若细胞间荧光强度存在异质性，则单一阈值可能无法充分分割图像中的所有细胞。在本分析中，通过在较亮和较暗的细胞群体周围创建掩膜，并分别对各群体进行分割，克服了上述问题。
尽管本方案中所研究的表型仅限于活细胞、死细胞及形态学特征的鉴定，但可轻松扩展以研究其他特征。例如，可结合RNA干扰、过表达或其他化学干预手段，开展功能性基因研究。
本文展示了该实验方案在检测非小细胞肺癌细胞对厄洛替尼的反应能力方面的应用，包括在存在和不存在癌症相关成纤维细胞（CAF）条件下的情况。然而，这仅仅是可测试的多种细胞类型和微环境参数中的一个示例。我们已将该方案拓展应用于其他细胞类型和药物研究，包括从患者肿瘤中分离的原代细胞13,15。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国家癌症研究所（NCI）资助，资助编号分别为U54CA143798和U54CA143907，用于在丹娜—法伯癌症研究所和南加州大学分别建立物理科学—肿瘤学中心（PS-OC）。S.M. Mumenthaler获得了PS-OC跨网络奖项，该奖项为本研究的部分工作提供了支持。
我们谨向我们的慈善支持者，特别是斯蒂芬森家族的Emmet、Toni和Tessa，致以最诚挚的感谢，感谢他们捐赠了Operetta高内涵筛选平台。我们还要感谢J. Foo提供的指导，以及应用分子医学中心团队成员：D. Agus在临床指导和指导方面的支持，K. Patsch在实验设计方面的深入讨论，R. Rawat在图像分析方案上的协助，J. Katz在Operetta技术操作上的帮助，以及P. Macklin和D. Ruderman在讨论和反馈中提供的宝贵建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | 细胞培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Gemini | 100-106 | 培养基添加剂 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15-140-122 | 培养基添加剂 |
| TC20 | Biorad | 1450102 | 细胞计数仪 |
| 含台盼蓝的TC20计数载片 | Biorad | 1450003 | 细胞计数仪载片 |
| 96孔板 | Corning | 3904 | 透明底黑色板 |
| 厄洛替尼（Erlotinib） | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | 药物重悬溶液 |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | 细胞核染料 |
| 碘化丙啶（PI） | Invitrogen | P1304MP | 死细胞染色剂 |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | 全细胞染色剂 |
| Operetta 高内涵成像系统 | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | 版本 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| 细胞培养孵箱 | 任何细胞培养孵箱均可使用——细胞在37 ºC、5% CO2条件下培养。 | ||
| 15 mL Falcon 锥形管 | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 细胞培养板 | TPP | 93040 |
参考文献
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