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方法文章

四血管采样法在人类胎盘生理学整合研究中的应用 在体 内

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DOI：

10.3791/55847

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2017年8月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Oslo University Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, 3Norwegian Advisory Unit on Women's Health, Oslo University Hospital, 4Department of Fetal Medicine, Oslo University Hospital

本文内容

摘要

我们介绍了一种在足月时研究人类胎盘生理学的详细方法。in vivo。该方法结合了母体和胎儿侧胎盘流入与流出血管的血液采样、血流量的超声测量以及胎盘组织取样。

摘要

人类胎盘在妊娠期间极难进行研究 在子宫内人类胎盘生理学的当前认知 体内 因此主要基于动物研究，尽管不同物种在胎盘解剖结构、血流动力学及妊娠持续时间方面存在高度差异。绝大多数人类胎盘研究为 离体 灌注研究或 体外 滋养层研究。尽管 体外 研究和动物模型至关重要，但将这些研究的结果外推至人类胎盘时需谨慎 体内 尚不明确。本研究旨在探讨人类胎盘生理学 体内 在足月时，我们详细介绍该方法的具体操作步骤。利用计划性剖宫产术中子宫切口前的腹腔内通路，从胎盘母体侧和胎儿侧的流入与流出血管采集血样。通过结合血样中化合物浓度测定与血流量测定，可定量评估胎盘及胎儿对任何物质的摄取与释放。此外，来自同一母婴配对的胎盘组织样本还可用于测定转运蛋白的密度与活性，以及其他胎盘功能指标。 体内通过整合应用四血管采样法，我们能够验证当前关于胎盘营养物质转运与代谢的一些理论。 体内在正常和病理妊娠中均具有重要意义。此外，该方法能够鉴定胎盘向母体循环分泌的物质，这可能对寻找胎盘功能障碍的生物标志物具有重要贡献。

引言

根据美国国立卫生研究院的说法，胎盘是人体中最不为人所知的器官 1,2,3人类胎盘难以获取和研究 体内 不会对持续的妊娠造成不道德风险。因此，人类胎盘功能的研究在很大程度上基于 体外 和 离体 模型。先前的大部分 体内 胎盘转运和代谢的研究已在动物中开展 4,5,6然而，由于不同物种间的胎盘结构和功能存在显著差异，将动物实验结果外推至人类时必须谨慎。仅有少数小型人类 体内 已有研究探讨了正常生理条件下胎盘和胎儿对物质的摄取与转运，但尚无研究探索多种化合物的整合性转运过程 7,8,9,10,11,12,13这些基础研究表明 体内 人类胎盘的研究是可行的，并且可能具有多种用途。首先，目前关于胎盘功能的概念主要来源于 体外, 离体 动物研究可在人类环境中进行测试，从而为人类胎盘提供新颖且更具特异性的认识。其次，与胎儿生长异常、子痫前期、妊娠期糖尿病、代谢综合征及其他母体代谢紊乱相关的功能障碍性胎盘特性可得到更充分的表征。第三，人类 体内 研究为开发胎盘功能的诊断和预测工具提供了机会。

在此背景下，我们旨在建立一套全面的生理学数据集，以研究人类胎盘功能 体内 在计划性剖宫产手术期间，我们利用进入腹腔的通路，从胎盘母体侧和胎儿侧的流入与流出血管采集血样（四血管采样法）。这些样本用于计算营养物质及其他物质的配对动静脉浓度差。 14此外，我们通过超声测量胎盘两侧的血流量，从而可定量分析胎盘和胎儿对任何化合物的摄取情况。同时，还可测定胎盘释放至母体和胎儿血液循环中的物质。 15,16,17当与母婴临床参数以及胎盘和其他相关组织的分析相结合时，该方法具有整合胎盘功能多个方面的令人振奋的潜力 体内 在同一母体-胎儿配对中。

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方案

该研究已获得奥斯陆大学医院数据保护官员以及挪威南部地区医学与健康研究伦理委员会（2419/2011）的批准。所有参与者在入组时均签署了书面知情同意书。

1. 准备工作

注意：实验流程的时间线如图1所示。

样本处理流程时间线；示意图显示临床数据收集、样本转运和分析过程。
图1：描述4血管采样过程中时间节点及参与人员的流程图。
一种颜色代表一个人。本方法的详细描述见实验方案。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 人员
    1. 确保所有必需人员到位：一名经验丰富的胎儿医学专家负责超声测量，两名产科医生实施手术，其中一名产科医生与两名护士负责样本采集，一名助手负责血气分析，另一名助手在样本采集后立即连续处理其他样本。
      注意：若需更深入采集胎盘组织，则需额外增加一名人员。
  2. 设备
    1. 准备设备，包括50 mL冰冻的1 M磷酸盐缓冲液（PBS）、25 mL冷的RNA稳定溶液，以及5份每份0.5 mL的包埋剂（OCT）。对真空采血管和试管进行标记。参见设备的暂定清单。

2. 母体特征

  1. 在入组时记录母亲的临床和非临床特征，并在分娩时重复询问相关问题和测量指标，包括体重。记录剖宫产手术前的禁食时长，以及手术期间发生的任何低血压事件。
    注意：应包含全球妊娠协作实验室（Global Pregnancy CoLaboratory, COLAB）近期发表文献中报告的最简母亲临床数据集。该文章还涵盖了研究人群选择中的一些重要方面，在研究设计阶段应予以考虑18。
  2. 建议记录父亲的特征，包括种族、年龄和体重指数（BMI）。

3. 超声

  1. 在分娩当天对空腹状态的女性进行多普勒超声检查。检查应在胎儿静止期进行，孕妇取半卧位，并轻微向对侧倾斜，以避免压迫主动脉和下腔静脉。通过显示器上的机械指数和热指数监测输出强度。
  2. 脐静脉
    1. 在胎儿腹部的矢状面或斜横切面上显示脐静脉。在腹内段脐静脉的直线部分（任何可见分支之前）测量血管内径。使用常规B模式，并以垂直入射角度对血管进行成像以测量直径，同时保存多个最佳图像帧用于后续测量，以尽量减少脉动性直径变化的影响。
      1. 重复测量五到十次19。
    2. 在同一位置，使用多普勒超声并调整探头，使入射角尽可能低（始终<30°），以测量时间平均最大流速（TAMX）。在3–5秒内获取流速数据（非脉动性血流）。
  3. 子宫动脉
    1. 使用多普勒超声显示子宫动脉在其跨越髂外动脉处，即从髂内动脉分支后不久的位置。在此处调整探头，使入射角尽可能低（始终<30°），并测量TAMX。取三个心动周期的平均流速作为测量结果。
    2. 由于在同一位置难以获得垂直角度进行直径测量，因此应沿血管向远端追踪，在尽可能接近TAMX测量位置处获取正确的角度进行直径测量。若彩色多普勒超声评估发现该位置之前已有可见分支血管，则排除该处的直径测量值。
      1. 使用常规B模式，并以垂直入射角度对血管进行成像以测量直径，同时保存多个最佳图像帧用于后续测量，以尽量减少脉动性直径变化的影响。
      2. 重复测量五到十次19。
  4. 记录胎盘的位置。

4. 四血管采血

注意：实验流程的时间线见图1，样品的总体概述见图2。

显示子宫静脉、脐静脉、桡动脉和脐动脉的胎盘血流示意图。
图 2：胎盘血管系统及采样部位示意图。
在四血管采样法中，血液样本取自子宫静脉、桡动脉（作为子宫动脉的替代）、脐动脉和脐静脉。子宫动脉和脐静脉中的血流量通过超声测量。同时采集胎盘组织样本。插图：Øystein H. Horgmo，奥斯陆大学。 请点击此处查看此图的放大版本

  1. 安全操作规程
    1. 为手术室内的所有人员提供手套、手术刷手服、口罩和头套。
    2. 为接触手术区域的外科医生和研究人员提供手术刷手服、口罩、头套、手术衣和双层手套。护目镜可选。
    3. 为处理血液样本的人员提供手套。
    4. 为处理胎盘样本的人员提供手套和外科口罩。匀浆过程需在通风橱中进行。
  2. 手术室内的准备工作
    1. 在手术开始前，向所有协助采样的人员简要说明并分发设备。
    2. 向将协助建立必要外周动脉和静脉通路的麻醉医师和麻醉科护士说明情况，并确保在采样前不给予任何静脉输液。
    3. 将三支（10 mL）无针头注射器交给协助采集肘前静脉样本的人员，将两支注射器（一支20 mL和一支10 mL）以及一支血气注射器（含肝素）交给协助采集桡动脉样本的人员。
    4. 准备两个无菌注射器（20 mL）、五个无菌注射器（10 mL）、三根蝶形针头和两个血气分析注射器用于操作区域。
  3. 血管通路
    1. 剖宫产术前遵循标准操作程序，确保外周静脉（iv）通路通畅。
      注意：肘正中静脉是较优选择，因为从此部位采样更容易。
    2. 通过超声或触诊定位腕部桡动脉。皮下注射0.5 mL利多卡因镇痛后，将动脉导管置入桡动脉。若穿刺尝试三次未成功，或患者在置管过程中出现疼痛，应放弃从此部位采样。
      注意：剖宫产手术应按照标准流程进行。以下仅强调取样操作所需的调整步骤。
  4. 母体血液样本
    注意：在子宫切开前，同时采集全部三份母体血液样本（子宫静脉、桡动脉和肘正中静脉）。
    1. 打开腹腔后，使用拉钩提起腹壁，暴露子宫前外侧的子宫静脉主支。尽可能从与胎盘同侧的子宫静脉分支采血；若胎盘位于子宫中线，则选用最明显的静脉丛采血。
      1. 以约30度角将蝶形针插入子宫静脉，连接血气针筒，轻柔抽吸采集血液，避免溶血。在妥善固定蝶形针静脉位置的同时，依次更换已充满的血气针筒为20 mL和10 mL针筒继续采血。
        注意：选择子宫静脉对侧位置站立时，可获得最佳操作视野。
    2. 对于桡动脉，从动脉内导管抽吸血液。弃去最初的5 mL，然后用肝素注射器抽取3 mL用于血气分析，再用两个注射器分别抽取3 mL（20 + 10 mL）。
    3. 对于肘正中静脉，从静脉导管中轻柔抽吸。弃去最初的5 mL，然后用三支注射器（每支10 mL）共抽取30 mL血液。
    4. 在关闭腹腔前，对子宫静脉的采样部位进行最终检查。
  5. 胎儿血液样本
    1. 婴儿出生后，立即从脐动脉抽吸血液，无需夹闭脐带或娩出胎盘。首先使用血气分析用注射器采血，随后尽可能使用三支10 mL注射器继续采集。
    2. 当动脉样本采集完毕后，夹闭脐带并将婴儿交予助产士，随后采集脐静脉血样（血气分析及20 + 10 mL注射器）。
      注意：在分娩后数秒内且在胎盘娩出前获取所有脐带样本 原位 除非其已自行脱落。
    3. 遵循挪威关于延迟断脐的建议。若新生儿出现窘迫情况，应立即夹闭并切断脐带，随后将新生儿交予助产士和新生儿科医生。
  6. 血液样本的处理
    1. 将血气分析注射器置于冰上，同时准备其余血液样本，并在5分钟内使用血气分析仪进行分析。
    2. 立即将血液样本转移至真空采血管中，血浆管置于摇床上轻轻摇动1 - 2分钟，随后立即置于冰上。血清管置于实验台静置30分钟。
      注意：此步骤是实验过程中的关键环节，需格外注意，因为必须同时制备来自全部五个位点的样品，以确保样品质量。
    3. 尽快在30分钟内离心血浆样本， 6 °C2,500 × g，离心20分钟
    4. 30分钟后，在室温下以2,500 × g离心血清样本10分钟。
    5. 小心将上清液分装至2 mL冻存管中，离心管底部保留0.5 mL上清液于沉淀之上，以确保获得无血小板血浆。
    6. 将样品储存在 -80 °C.

5. 胎盘组织的采集

  1. 将胎盘娩出后尽快平放在预冷的冰上解剖托盘中。拍照记录测量最长直径以及与其垂直的直径。
  2. 称量胎盘。
  3. 记录重量、两个直径、任何大体病理变化、脐带中的血管数量，以及从分娩到胎盘置于冰上之间的时间间隔。
    注意：若临床指征需要，应将胎盘送病理检查。
  4. 将胎盘的母体面朝上放置，随机选择胎盘四个象限中的4 - 5个取样位点，避开明显病理区域。使用剪刀从母体面去除蜕膜，剪除深度为3 - 5 mm。采集1 - 2 cm大小的组织样本3 每个位点的绒毛组织样本。
  5. 用50 mL冷的1 M PBS轻轻冲洗收集的组织。从每个采样部位将组织分割成若干小块并分装。
    注意：胎盘组织块的大小取决于计划进行的分析。
  6. 加入 0.1 - 0.5 cm 的等分试样3 将组织样本分装至5个冻存管中，并在液氮中速冻。
  7. 加入0.1 - 0.2 cm的小块组织3 加入25 mL RNA稳定溶液至管中。储存于 4 °C 孵育24小时后，弃去RNA稳定液并更换新液。冷冻保存。
  8. 加入0.5 cm的片段3 向5个含有0.5 mL OCT的冻存管中补加OCT至满，混匀后冷冻。
  9. 将样品储存在 -80 °C 直至分析前。
    注：Burton 等人针对胎盘取样的实际操作提供了全面概述，具体方法取决于计划进行的分析类型。 20 考虑将剩余组织用于制备微绒毛膜和基底膜，并通过负压吸引技术收集蜕膜组织。 21,22

6. 新生儿特征

  1. 记录新生儿特征，包括Apgar评分（1、5和10分钟）、性别、体重、身长、胎龄以及是否入住新生儿重症监护病房（住院时长及结局）。
  2. 可考虑通过人体测量学、空气置换体积描记法或双能X射线吸收测定法评估新生儿身体成分。23,24

7. 计算

  1. 假设桡动脉与子宫动脉的血液成分相似，计算子宫胎盘动静脉浓度差。
    子宫胎盘动静脉浓度差 = CA - CV
    脐静脉-动脉浓度差 = Cv - Ca

    其中 C 表示浓度，下标：A 为桡动脉；V 为子宫静脉；v 为脐静脉；a 为脐动脉。
  2. 计算血流量，mL/min（Q）：
    流速公式 \( Q = h \times (\frac{D}{2})^2 \times \pi \times TAMX \)。
    其中 D 为血管直径（cm），TAMX 为时间平均最大流速，h 为血流速度空间分布剖面的系数。脐静脉使用 0.5 作为系数，子宫动脉使用 0.625,26。
  3. 根据 Fick 原则计算胎盘摄取与释放量：

    子宫胎盘摄取量 = (CA - CV) x Qm
    胎儿摄取量 =     (Cv - Ca) x Qf

    下标：m 表示母体，f 表示胎儿。

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结果

4-血管采样法适用于临床实践，我们已成功从209对母婴中获取了血液样本。其中128对还实现了血流量的测量。在70对母婴-胎儿配对中，获得了完整的4-血管采样以及高质量的母体和胎儿血管血流测量结果（图3）。此外，截至目前，我们已从30名子痫前期患者中收集了血液和胎盘组织样本。我们此前已发表多篇文章，研究人类胎盘对营养物质的转运以及胎盘释放血管活性因子的情况，展示了该方法的两种应用14,15,16。

4-血管法用于研究胎盘转运的示例
胎盘两侧存在显著的动静脉血糖差异，表明 在体 子宫胎盘和胎儿对葡萄糖的摄取（表1）。葡萄...

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讨论

胎盘四血管取样方法与三个主要目的相关。首先，该方法可用于研究特定物质如何从母体侧被胎盘摄取，并可能转运至脐循环及胎儿体内，我们的葡萄糖和氨基酸研究已对此进行了验证。其次，该方法对于研究胎盘产生并释放至母体或胎儿循环中的物质具有重要意义，孕酮的研究结果已证明了这一点。第三，该方法可能有助于研究胎儿在快速生长和组织重塑过程中如何在活体（in vivo）内清除代谢废物。

四血管法的关键步骤与后勤问题
胎盘四血管取样法先前已被用于确定大分子营养物质的胎盘转运 体内 在正常的生理妊娠中 8,10,12但研究对象数量有限。4血管采样法应用受限，可能源于该操作在实施过程中的复杂后勤协调。成功实施该方法需要孕妇、研究人员以及胎儿医学、产科和麻醉科部门工作人员之间的有效协作。我们认为，多位主要研究人员本身为产科医生，熟悉临床流程和关键...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

首先，我们诚挚感谢参与本项目的各位母亲。其次，我们感谢所有协助和促进采样过程的工作人员，包括麻醉医师、麻醉护士以及手术室护士。本项目的开展离不开挪威东南部地区卫生当局、挪威妇女健康咨询单位、奥斯陆大学以及奥斯陆大学医院提供的本地资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>母体身体成分
阻抗量程Tanita或类似物
<强>超声测量 
Sequoia 512 超声成像仪Acuson配备带有彩色多普勒和脉冲波多普勒功能的弧形探头（频率带宽 2 - 6 MHz）
<强>血液样本
动脉导管BD 医疗682245或类似物
20 cc 偏心鲁尔接头针筒（不带针头）泰尔莫SS-20ES或类似物，需要3个。
10 cc 偏心鲁尔接头针筒（不带针头）泰尔莫SS-10ES或类似物，需要9个。
5 cc 6% 鲁尔注射器（无针头）泰尔莫SS-05S1或类似物，需要2个。
动脉血气采血针 Radiometer Medical或类似物，共需4个。
无菌带翼针头连接至软管，21 号Greiner Bio-One450081（仅供一次性使用）。需要3个。
6 mL EDTA 真空采血管 Greiner Bio-One456043或类似物。用样本位点标记。需要10个。
5 mL LH 锂肝素分离胶真空采血管Greiner Bio-One456305或类似物。用样本来源地标记。需要5个。
6 mL 血清凝块激活剂真空采血管 Greiner Bio-One456089或类似物。用样本来源地标记。需要5个。
真空采血管 3 mL  9NC 凝血钠枸橼酸盐 3.2%Greiner Bio-One454334或类似物。用样本位点标记。需要5个。
2.0 mL 冻存管康宁430488或类似物。用样本来源、血清/血浆类型和编号标记。需要90份。
标记托盘以运输注射器在手术室中转运血液样本
摇床用于样品的轻柔混匀
冰在泡沫塑料箱中
液氮在合适的容器中
<强>胎盘样本
金属托盘
冰在泡沫塑料箱中
校准刻度
金属尺
1 M 磷酸盐缓冲液SigmaD1408或类似浓度。将10 M稀释至  使用前 1 M
RNA稳定液SigmaR0901-500ML 或类似物
最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂vwr361603E或类似物
2.0 mL 冻存管康宁430488或类似物。用样本位点、内容和编号进行标记。需要10个。
离心管，锥底，50 mLGreiner Bio-One227,285或类似物。标记为 "RNA later"样本位点和编号，需要2个。
液氮在合适的容器中
<强>胎儿身体成分
校准刻度
卷尺

参考文献

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