三维组织工程化排列的星形胶质细胞网络, 以概括发展机制和促进神经系统再生

摘要

我们展示了自组装的发展, 三维束纵向排列星胞和过程内的新型生物材料装箱。这些被设计的 "活脚手架", 显示微米尺度的直径, 但长度延长厘米, 可作为试验床研究神经发育机制或促进 neuroregeneration 通过引导神经元迁移和/或轴突寻.

摘要

神经和神经退行性疾病往往导致持久的神经缺损, 由于中枢神经系统 (CNS) 的能力有限, 以取代失去的神经元和再生轴突通路。然而, 在神经系统的发育过程中, 神经元的迁移和轴突的扩展通常发生在其他细胞形成的通路上, 称为 "活支架"。为了模拟这些机制, 并设计一个绕过中枢神经系统抑制环境的策略, 本手稿提出了一种制造组织工程 astrocyte-based "活支架" 的协议。为了创建这些结构, 我们采用了一种新的生物材料装箱方案, 诱导星形胶质细胞组装成稠密的三维双极纵向排列的胞和过程的束。首先, 对中空水凝胶微柱进行了组装, 内腔表面涂有胶原细胞基质。然后将游离的大脑皮质星形胶质细胞传送到圆柱形微柱的腔内, 并在 < 350 µm 的临界内径上自发对准, 并收缩产生由稠密束组成的长纤维状电缆。星形胶质细胞的过程和胶原纤维的测量 < 150 µm 的直径, 但延长了几个厘米的长度。这些工程化的活体支架展示了 > 97% 细胞的生存能力, 实际上完全由星形胶质细胞、胶质纤维酸性蛋白、波形和巢组成。这些对齐的星形胶质细胞网络被发现为神经元附着和对突起扩展提供了一个可容许的基底。此外, 这些结构保持完整性和对齐时, 提取从水凝胶装箱, 使其适合中枢神经系统植入。这些预制结构模仿自然发生的 glial-based "活体支架"在体内的关键细胞元素。因此, 这些工程化的活体支架可以作为试验床, 用于研究神经发育机制体外或促进 neuroregeneration, 方法是引导神经元迁移和/或轴突寻继中枢神经系统变性后体内.

引言

中枢神经系统 (CNS) 的能力有限, 以抵消的损失和/或功能障碍的神经元和轴突通路, 伴随的条件, 如创伤性脑损伤 (脑外伤), 中风, 脊髓损伤 (SCI), 和神经变性疾病^{1 ,2,3,4,5}。中枢神经系统的神经再生仅限于大脑中的有限区域, 从而阻碍了丢失神经元的恢复^6,7。此外, 由于缺乏定向引导, 存在的生长抑制剂, 和反应 astrogliosis 在神经组织损伤后的中枢神经系统失去的轴突通路的再生是不够的^{2,8, 9,10}。星形胶质细胞在帮助神经元的离子稳态、神经递质清除、突触形成和神经血管耦合方面具有不同的功能¹¹。然而, 随着对神经组织的轻度损伤, 星形胶质细胞在转变为肥厚状....

方案

所有程序均经宾夕法尼亚大学动物保育和使用委员会和迈克尔 j Crescenz 退伍军人事务医疗中心批准, 并遵守 NIH 公共卫生服务政策中提出的人道实验室动物的关心和使用 (2015)。

1. 琼脂糖凝胶微柱的研制

1. 使琼脂糖3% 重量/体积 (瓦特/v) 溶液通过重3克琼脂糖和转移到一个无菌烧杯含有100毫升的 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)。在烧杯中加入无菌磁条, 并将其放在热板/搅拌器的表面上。保持烧杯的覆盖, 以防止它的内容蒸发的下一步。
2. 在100° c 的温度下加热琼脂糖和 DPBS, 搅拌 60-120 rpm。根据需要调整这些设置, 并不断监测溶解过程的进展, 因为溶液最初从不透明变为清晰的外观, 这意味着琼脂糖已完全溶解。
   注意: 热烧杯和解决方案是热的!
3. 由于琼脂糖溶液加热和搅拌, 检索四空 10 cm 培养皿, 并添加20毫升的 DPBS 其中两个。地方针灸针 (直径: 300 µm, 长度:40 毫米), 玻璃升毛细管 (直径: 701.04 µm, 长度:65 毫米, 容量: 25.0 µL), 以及在生物安全柜内的灯泡分配器。当液体琼脂糖溶液清除, 保持恒定加热约50° c 和搅拌, 以避免凝胶的琼脂糖。
4. 将针刺针引入灯泡分配器的底部开口。在针头外露的地方插入一根毛细管。通过进入灯泡分配器气缸的橡胶部分来保护毛细管。
5. 将1毫升的....

结果

最初, 用相衬显微镜监测星形胶质细胞黏附和束形成的进展, 以及细胞的整体稳定性作为时间的函数。在1小时的电镀后, 星形胶质细胞在微柱的腔内被发现球形形态 (图 2A)。在5小时, 星形胶质细胞开始扩展过程和收缩, 而由 8 h 电池展示了一个完整的过程-轴承形态, 并形成了电缆状结构, 沿纵向轴线的微柱 (图 2A)。值得注意的是, 与最初分散在微柱上的细胞的存在相比, 星形细胞似乎已经收缩形成了内部的稠密束网络 ( 图 2B)。在最初的细胞对齐后, 星形胶质网通常沿着纵轴拉在一起, 类似于拉链的闭合, 在微柱的中心形成一个稠密的束 (图 2C)。这一捆绑架构的形成是由于一个自组装过程, 部分取决于选择的微柱 ID 和细胞密度。星形胶质细胞排列并获得了一个双极形态, 当种子在微列的 ID 小于350µm.......

讨论

与三七总皂苷的支持环境相比, 中枢神经系统在处理神经和神经的有害后果方面特别有限。在对哺乳动物中枢神经系统的严重侮辱后, 形成了一个神经胶质瘢痕, 由纤维化和炎症细胞的核心组成, 由一个致密网状的无条理的反应性星形胶质组织所包围, 分泌轴突生长抑制蛋白¹⁴。此疤痕作为一个物理和生物化学的障碍, 反对再生轴突结束¹²。此外, 成年哺乳动物中枢神经系统拥有有限的新神经元来源, 以恢复创伤或神经后丢失的细胞, 因为神经源中心仅限于 SVZ, 海马齿状回, 和潜在的其他通常不活跃区域⁵⁴。一个理想的策略将绕过中枢神经系统有限的疗养能力的两个方面, 目前的方法无法解决。因此, 我们的研究小组开发了 astrocyte-based 支架, 目的是为神经移植向神经元不足的区域提供生存途径, 并引导再生轴突生长锥的延伸。在琼脂糖微柱内的胶原内部排列的星束构成了这些星活支架。与常规的细胞和 biomaterial-based 策略, 用于中枢神经系统修复和再生的一个相当大的区别是, 这些结构的细胞完全预制.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针灸针 （300 µm 直径）	拉萨医疗	HS.30x40	直径可根据微柱管腔所需的尺寸而变化。
培养皿	Fisher	08772B
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Invitrogen	14200075
聚苯乙烯一次性血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
微升玻璃毛细管（701 µm）	Fisher	21-170J	直径可根据微柱壳的所需尺寸而变化。
微胶囊分配器	Fisher	21-170J	灯泡配有微胶囊管。
热板	Fisher	SP88857200
磁棒	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 毫米规格针	Fisher	14-826-49
微手术刀	Roboz 手术	RS-6270
剪刀	精细科学工具	14081-09
镊子	世界精密仪器	501985
热珠消毒器	Sigma	Z378550-1EA
立体镜	尼康	SMZ800N
微刮刀	Fisher	S50821
鼠尾 I 型胶原蛋白	康宁	354236	维持在 4 ºC 并仅在需要时删除。使用时用冰块保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
氢氧化钠 （NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸 （HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液 （HBSS）	Invitrogen	14170112	储存在 4 º C。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存在 -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
牛胰腺脱氧核糖核酸酶 （Dnase） I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
Gibco	11330-032	Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	储存温度为 4°C。
胎牛血清 （FBS）	Atlanta Biologicals	S11195	储存在 -20ºC。
出生后第 0 天或第 1 天 Sprague Dawley 大鼠幼崽	Charles River	菌株 001
Neurobasal 胚胎神经元基础培养基	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
B-27 无血清补充剂	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	Store 在 -20 ºC 和 37 的暖色 ºC 使用前。
G5 星形胶质细胞补充剂	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	菌株 001
巴斯德移液器	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
离心	Fisher	05-413-115
血球计数器	Fisher	02-671-6
培养箱	Fisher	13 998 076
甲醛 40%	Fisher	F77P-4	甲醛是一种已知致癌的有毒化合物，必须丢弃在单独的容器中。
玻璃盖玻片	Fisher	12-548-5M
指甲油	电子显微镜科学 （EMS）	72180
氟蒙特封固剂	Southern Biotech	0100-01
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
磷酸盐缓冲盐水	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
正常马血清	Gibco	16050-122
兔抗神经胶质酸性纤维蛋白 （GFAP） 一抗	Millipore	AB5804	储存在 -20ºC。
小鼠抗 β-微管蛋白 III 一抗	Sigma	T8578	储存在 -20ºC。
兔抗胶原 I 一抗	Abcam	ab34710	储存温度为 -20ºC。
兔抗波形蛋白	Millipore	AB3400	储存在 -20ºC。
小鼠抗巢蛋白	Millipore	AB5326	储存在 -20ºC。
驴抗小鼠 568 二抗	Invitrogen	A10037	储存在 4ºC。
驴抗兔 568 二抗	Invitrogen	A10042	储存在 4ºC。
驴抗兔 488 二抗	Invitrogen	A21206	储存在 4ºC。
Hoechst 33342，三盐酸盐	Invitrogen	H3570	储存在 4ºC。Hoechst 是一种已知的诱变剂，应作为致癌物处理。因此，它必须丢弃在单独的容器中。
钙黄绿素 AM	Sigma	C1359	4 mM 溶于无水 DMSO
乙锭同型二聚体-1	Life Technologies	E1169	2 mM 溶于 DMSO/H2O 1：4 （v/v）
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma	276855
A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜	尼康		用于免疫标记构建体的共聚焦重建。
Eclipse Ti-S 显微镜	尼康		用于拍摄相差图像。使用与 Nikon Elements Basic Research 软件 （4.10.01） 接口的 QiClick 相机进行数字图像采集。