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方法文章

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

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DOI：

10.3791/55848

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2018年1月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。

摘要

神经创伤和神经退行性疾病常常导致持久的神经功能缺损，这是由于中枢神经系统（CNS）在替代丢失的神经元和再生轴突通路方面能力有限。然而，在神经系统发育过程中，神经元迁移和轴突延伸通常沿着由其他细胞形成的通路进行，这些通路被称为 "活体支架"旨在模拟这些机制并设计一种可规避中枢神经系统抑制性环境的策略，本文提供了一种用于构建组织工程星形胶质细胞支架的实验方案 "活体支架"采用一种新型生物材料包封方案构建这些结构，以诱导星形胶质细胞自组装形成致密的三维双极结构，其胞体与突起呈纵向排列。首先组装中空水凝胶微柱，并在其内腔表面包被胶原细胞外基质。随后将解离的大脑皮层星形胶质细胞导入圆柱形微柱的内腔，在特定内径条件下 <350 µm，自发地自我对齐并收缩，形成由致密的星形胶质细胞突起和胶原原纤维束组成的长纤维状电缆结构，其直径为 <直径150 µm但长度可达数厘米。这些人工构建的活体支架表现出 >97% 的细胞存活率，并几乎完全由表达中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（vimentin）和巢蛋白（nestin）的星形胶质细胞组成。这些定向排列的星形胶质细胞网络可为神经元黏附及定向神经突延伸提供有利的基质。此外，这些结构在从水凝胶包埋中取出后仍能保持完整性和定向排列，适用于中枢神经系统植入。这些预先构建的结构在形态上模拟了天然胶质细胞介导的细胞架构中的关键要素 "活体支架" 体内因此，这些人工构建的活体支架可作为研究神经发育机制的实验平台 体外 或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进中枢神经系统退变后的神经再生 体内.

引言

中枢神经系统（CNS）在对抗神经元丢失和/或轴突通路功能障碍方面的能力有限，这些情况常见于创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中、脊髓损伤（SCI）以及神经退行性疾病1,2,3,4,5。CNS中的神经发生仅局限于脑部少数特定区域，这限制了丢失神经元的再生6,7。此外，由于缺乏定向引导、存在轴突发育抑制因子以及神经组织损伤后出现的反应性星形胶质细胞增生，CNS中丢失的轴突通路再生能力不足2,8,9,10。星形胶质细胞通常在维持离子稳态、神经递质清除、突触形成以及神经血管耦合等方面发挥多种支持神经元的功能11。然而，即使神经组织受到轻微损伤，星形胶质细胞也可能发生分子、结构和功能上的改变，并转变为肥大状态11。在严重神经创伤的响应中，这些变化导致形成一种具有“半暗带”的瘢痕结构，其中半暗带包含迁移的反应性星形胶质细胞，而病灶核心则包括从破裂的血脑屏障（BBB）渗漏的白细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和成纤维细胞11,12,13。这些反应性星形胶质细胞呈现出丝状、无序的突起形态，并表现出中间丝蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）表达升高，从而阻碍神经再生12。尽管胶质瘢痕最初有助于恢复血脑屏障的完整性，并防止炎症反应向周围健康组织扩散，但它却成为阻碍轴突再生的物理和生化屏障12,14,15,16。例如，遇到胶质瘢痕的轴突会形成肿胀的营养不良性生长锥，并出现生长受阻12。此外，损伤后星形胶质细胞突起的紊乱排列也阻碍了再生轴突的延伸17。这些抑制性特征的结果表现为严重神经创伤（包括TBI和SCI）患者常出现的持久性身体和神经功能障碍。

尽管中枢神经系统（CNS）的功能性再生面临诸多外在挑战，但已有研究表明轴突本身具备内在的再生能力。例如，与胶质瘢痕接触的营养不良性生长锥具有动态特性，提示这些末端仍保留着延伸能力12。因此，人们认为阻碍轴突再生的主要因素是损伤后中枢神经系统的抑制性微环境，而通过减少胶质瘢痕形成和/或在瘢痕区域构建再生桥梁以提供更有利的微环境将具有显著优势。事实上，先前的研究已证明，中枢神经系统神经元能够利用外周神经移植物作为桥梁，穿过损伤区域延伸轴突，因为外周神经移植物为轴突再生提供了更有利的环境12,18,19。已有多种策略致力于利用这种残存的再生潜能。例如，在多种损伤模型中调控细胞生长信号通路，已实现轴突再生并减少胶质瘢痕形成10,20,21。此外，研究显示，使用软骨素酶ABC处理可切断大多数硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）的糖链，从而减轻反应性星形胶质细胞分泌的CSPGs所产生的抑制效应22。尽管结果令人鼓舞，但这些方法无法为生长锥提供定向引导，可能导致异常再生12，同时也未能解决神经元丢失的问题。基于细胞的策略已被用于尝试克服胶质瘢痕的影响并补充丢失的细胞，尤其是神经元。一些研究团队将反应性星形胶质细胞去分化为神经元，而另一些团队则将神经前体细胞移植至中枢神经系统损伤区域，以重建损伤部位并促进轴突再生23,24,25。然而，单纯干细胞移植受限于细胞存活率低、整合效果差以及在受损组织中滞留能力弱等问题5。此外，这些基于细胞的策略尚无法恢复长距离的轴突通路，尤其难以实现可控性的重建。因此，研究人员正在探索将生物材料与其他方法结合，作为递送多种神经细胞、前体细胞及生长因子的载体26。基于生物材料的策略具有高度的设计可控性，可构建出模拟靶组织三维（3D）微环境中特定物理、触向性和趋化性信号的结构27,28,29,30,31,32,33,34。重现这些微环境信号对于移植细胞表现出类似天然的形态、增殖、迁移和信号传导等神经生物学特性至关重要29。尽管具备上述优势，但仍需突破传统细胞接种型生物材料支架的局限，以同时促进定向的长距离轴突再生并替代丢失的神经元。

一种颇具前景的替代方法基于神经组织工程构建的“活体支架”，该方法与其他基于细胞的策略不同，因其含有具备预先形成的细胞结构的活神经细胞，能够模拟天然神经解剖结构和/或发育机制，从而促进神经环路的靶向替代、重建与再生4,35设计活体支架时需考虑神经细胞的表型与来源，以及由相关生物材料组成所决定的力学/物理特性和生化信号35. 制备完成后 体外，这些活体支架可被植入 体内 呈递细胞黏附分子以及趋化和神经营养信号，以根据再生过程的状态和进展主动调控神经细胞迁移和轴突生长35胶质细胞可作为构建活体支架工程化细胞结构的基础，因为这些细胞介导多种发育机制。 体内在大脑发育过程中，新生神经元依赖于放射状胶质细胞从脑室区向发育中的皮质板延伸的基底突起，作为其定向迁移的活体支架36,37此外，生长锥通过感知胶质引导细胞发出的吸引性和排斥性信号来调整自身方向，而所谓的“先驱”轴突则通过沿预先形成的胶质支架延伸，从而到达正确的靶目标。35,38,39因此，胶质细胞对于引导先驱性轴突至关重要，这些先驱性轴突随后作为基于轴突的“活体支架”，引导“追随者”轴突的投射。此外，已有研究表明，胶质细胞介导的生长机制在出生后仍然持续存在，神经母细胞沿吻侧迁移流（RMS）从侧脑室下区（SVZ）——成年大脑中为数不多的神经发生区域之一——迁移至嗅球（OB）。40。这些神经母细胞在放射状胶质细胞形成的管道内沿RMS迁移（图1A-1，由纵向排列的星形胶质细胞突起通过直接的细胞间黏附和局部可溶性因子组成37,41最后，哺乳动物中枢神经系统损伤会导致星形胶质细胞突起排列紊乱，形成胶质瘢痕，从而在物理上阻碍轴突再生17，许多非哺乳类生物系统缺乏有害胶质瘢痕的形成。相反，非哺乳类物种的胶质细胞保持更有序、排列更整齐的结构，作为穿越损伤区域的引导通路17,42,43例如，在非哺乳动物的SCI模型中，轴突被发现与跨越损伤区域的胶质桥紧密相关，表明有序的胶质支架作为促进轴突再生和功能恢复的基质具有重要作用（图1A-2)42,44,45上述神经解剖学特征及发育/再生机制的重现，可能催生一类新型的工程化胶质细胞支架，这类支架能够在原本不具备支持性的环境中，同时促进未成熟神经元的迁移和轴突导向，从而有望减轻中枢神经系统损伤和疾病相关的神经元及轴突束退行性变化。

我们的研究团队先前已分别通过微组织工程神经网络（micro-TENNs）和组织工程神经移植物（TENGs），为中枢神经系统和周围神经系统（PNS）内轴突束的重建与再生设计了多种类型的活体支架。27,46,47,48两种策略本质上均基于仿生学原理。微神经组织（Micro-TENNs）是受解剖结构启发的装置，旨在结构和功能上替代连接脑内不同神经元群体的轴突束。神经束引导导管（TENGs）则利用轴突促进轴突再生的发育机制，即“追随”轴突沿“先驱”轴突生长，从而实现宿主轴突的靶向再生。35,46,48我们近期利用了活体支架技术的多功能性，采用与微组织工程神经网络（micro-TENNs）相似的包封策略，并借鉴了发育过程中普遍存在的胶质细胞相关机制。在此，我们开发出一种构建体，由沿水凝胶微柱胶原腔内排列的星形胶质细胞束组成。49这些星形胶质细胞活体支架的制备首先是在毛细管-针灸针组件中填充液态琼脂糖，以形成具有外径（OD）和内径（ID）的中空圆柱形水凝胶，其外径和内径分别对应于毛细管和针灸针的直径。琼脂糖凝胶化后，将水凝胶微柱从毛细管中取出，随后在其中空内表面涂覆I型胶原蛋白，以提供利于星形胶质细胞黏附及定向束状结构形成的微环境。图1B-1）。随后，将出生后幼鼠大脑皮层星形胶质细胞接种至管腔内。图1B-2）。与依赖电场、微图案沟槽和细胞外基质（ECM）蛋白图案化的二维（2D）排列技术不同，活体支架技术中星形胶质细胞的排列依赖于可控变量（如基底曲率（柱ID）、细胞密度和胶原蛋白浓度）引导的自组装过程50,51,52星形胶质细胞收缩并重塑胶原，呈现出双极、纵向排列的形态，类似于所观察到的天然支架结构 体内 (图1B-3）。事实上，我们正在积极探索将这些电缆状结构用作物理基质，以引导未成熟神经元的定向迁移，并促进轴突在受损中枢神经系统不利环境中的再生，特别是哺乳动物的胶质瘢痕环境。图1C）。本文将详细介绍星形胶质细胞微柱的制备方法、预期细胞结构的相差显微图像与免疫荧光图像，并对该技术目前的局限性及未来发展方向进行系统性讨论。

神经生物学启发示意图：胶质桥通过微柱结构引导轴突再生。
图1：有序星形胶质细胞网络的灵感来源、制备方案及预期应用。 (A) 神经生物学启发：(1) 来源于生神经的室管膜下区（SVZ）的神经前体细胞利用吻侧迁移流（RMS）中纵向排列的胶质管进行定向迁移，最终到达嗅球（OB）；(2) 两栖类和鱼类等非哺乳动物在神经组织损伤后能够持续再生，部分原因在于形成了连接损伤两端的胶质桥例如 横断的脊髓）并作为引导再生轴突的支架。 (B) 制备流程概述：（1）构建微米级中空水凝胶微柱，其内腔表面包被细胞外基质（ECM）；（2）接种从新生大鼠幼崽分离的原代皮层星形胶质细胞；（3）在培养过程中形成纵向取向的束状结构并实现自组装；（4）将束状结构从生物材料包埋结构中取出，用于后续的移植研究。C) 体内 应用：（1）这些活体支架可作为工程化胶质导管，引导神经元从神经发生中心定向迁移，以重建神经元缺失区域；（2）重现发育过程中先驱轴突导向的机制以及非哺乳动物中胶质桥介导的再生机制，可能赋予这些星形胶质细胞支架以引导轴突穿越哺乳动物非允许性胶质瘢痕环境的能力。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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方案

所有实验程序均经宾夕法尼亚大学和迈克尔·J·克雷斯琴兹退伍军人事务医疗中心的机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物人道照护与使用公共卫生服务政策》（2015年）中规定的要求。

1. 琼脂糖水凝胶微柱的制备

  1. 通过称取3 g琼脂糖并转移至含有100 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌烧杯中，配制3%质量/体积（w/v）的琼脂糖溶液。向烧杯中加入一个无菌磁力搅拌子，并将其置于加热板/搅拌器表面。在下一步操作中保持烧杯覆盖，以防止内容物蒸发。
  2. 在100 °C温度下加热琼脂糖和DPBS，并以60–120 rpm速度搅拌。根据需要调整设置，并持续监测溶解过程的进展，溶液最初由浑浊逐渐变为透明，表明琼脂糖已完全溶解。
    注意：烧杯及溶液温度很高！
  3. 在加热并搅拌琼脂糖溶液的同时，取出四个空的10 cm培养皿，并向其中两个加入20 mL DPBS。将针灸针（直径：300 µm，长度：40 mm）、玻璃微量毛细管（直径：701.04 µm，长度：65 mm，容量：25.0 µL）和球形移液器放入生物安全柜中。当液态琼脂糖溶液变得澄清后，保持约50 °C的恒温加热并持续搅拌，以防止琼脂糖发生凝胶化。
  4. 将一根针灸针插入球形移液器底部开口。将毛细管套在暴露于外侧的针头上。通过将毛细管的一部分插入球形移液器筒体的橡胶部分，固定毛细管。
  5. 使用移液器将1 mL液态琼脂糖转移至一个空培养皿表面，将毛细管一端垂直（针头已插入）接触琼脂糖，同时向内挤压球形移液器的橡胶帽。缓慢释放球形移液器帽上的压力，将琼脂糖吸入毛细管中。
    注意：将液态琼脂糖转移至毛细管的操作必须迅速进行。若液态琼脂糖在培养皿表面冷却足够时间（约60 s），则会开始凝胶化，从而阻碍琼脂糖在毛细管内的有效吸入。
  6. 将每个球形移液器-毛细管-针头组件放入一个空培养皿中，让毛细管内的琼脂糖凝胶固化5分钟。用手小心地将毛细管从球形移液器筒体的橡胶塞中拔出，使针头和琼脂糖凝胶保留在毛细管内。
  7. 手动缓慢地将针灸针从毛细管中抽出；在此过程中，新固化的琼脂糖柱也会随针一同滑出毛细管，仍包裹在针头周围。使用无菌镊子的尖端轻轻推动微柱沿针灸针移动至末端。将针头置于盛有DPBS的开放培养皿上方，用镊子将微柱推入DPBS中。
    注意：若在取出针灸针后琼脂糖微柱仍滞留在玻璃毛细管内，可用25 mm规格的针头缓慢将琼脂糖微柱从毛细管中推出，并移入含DPBS的培养皿中。
  8. 使用热珠灭菌器对微型手术刀或镊子进行灭菌。通过称取4 g琼脂糖并转移至100 mL DPBS中，配制4% w/v琼脂糖溶液。按照步骤1.2所述方法加热并搅拌，获得澄清的4%液态琼脂糖溶液。在后续所有步骤中保持该溶液的加热与搅拌状态。
  9. 将含有微柱的培养皿转移至解剖罩内，用精细镊子将一根微柱移至一个空培养皿中。利用体视显微镜进行视觉引导，并使用微型手术刀将微柱切割至所需长度。修整两端，使其形成与水平方向成45o角的斜面，以便在后续细胞外基质（ECM）包被和细胞接种过程中更易操作微柱。
  10. 在同一培养皿中对另外三根微柱重复上述步骤，并将四个结构平行排列，各圆柱之间间距小于<3 mm。使用移液器吸取50 µL 4%琼脂糖溶液，快速沿微柱阵列上方倾倒一条细线状液体，使结构连接并捆绑成四根一组（此后称为"微柱船"）。为避免4%琼脂糖流入微柱末端造成内部堵塞，请尽量缩短结构间距，并以细线形式快速添加琼脂糖。
    注意：将四根微柱组合成"船"并非构建星形胶质细胞支架的必要步骤。然而，“船”结构有助于加快制备流程，并在后续步骤中更安全地移动和操作微柱。
  11. 让微柱船冷却1–2分钟，使所添加的4%琼脂糖完成凝胶化。使用精细镊子夹住连接用的4%琼脂糖部分，将微柱船转移至步骤1.1.3中准备的另一含DPBS的培养皿中。根据需要，使用剩余微柱制备更多“船”结构。
  12. 将含有微柱和/或“船”结构的培养皿转移至生物安全柜中，暴露于紫外光（UV）下灭菌30分钟。
    注意：操作时应穿戴适当防护装备，避免紫外线暴露。
  13. 若不立即进行细胞外基质（ECM）包被和细胞接种，可将含微柱船的培养皿在4 °C条件下保存于DPBS中，最长可保存1周。若在此期间未使用这些结构，则需重新执行微柱制备步骤。

2. 原代细胞培养与分离

  1. 从新生大鼠幼崽中分离皮层星形胶质细胞
    1. 为后续步骤做准备，向四个10 cm的培养皿中各加入20 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS），作为解剖组织的储存容器。将所有培养皿置于冰上。使用热珠灭菌器对洁净的外科剪刀、镊子、微型刮勺和微型手术刀进行灭菌处理。
    2. 将含有1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.15 mg/mL脱氧核糖核酸酶（DNase）I的0.25%胰蛋白酶溶液在37 °C预热。此外，将星形胶质细胞培养基在37 °C预热，该培养基由Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与Ham's F-12营养混合物及10%胎牛血清（FBS）组成。
    3. 通过低温暴露使出生后第0天或第1天的Sprague-Dawley大鼠幼崽麻醉，并通过断头法实施安乐死。使用19号针头插入动物鼻部（眼睛前方）将其头部固定在操作台上。
    4. 使用手术刀从颈部基部向前至眼睛后方正中线处做一纵向切口，再从眼睛正后方向下做两侧横向切口，形成“T”形切口。用精细镊子将颅骨皮肤/颅骨向侧方剥离。
    5. 用镊子夹住动物的鼻部（朝上），一只镊臂置于动物口中，另一只置于外部表面。用无菌微型刮勺取出脑组织，并将其放入盛有冷HBSS的培养皿中。操作完成后立即将该培养皿放回冰上，并在非使用状态下始终保持低温。
    6. 将先前储存在-20 °C的花岗岩块置于解剖罩内的体视显微镜下方。将含有脑组织的培养皿放置在花岗岩块表面，以在解剖过程中维持其低温状态。在接下来的所有步骤中均使用体视显微镜进行视觉引导。
    7. 若嗅球仍完整，使用镊子或微型手术刀将其切除。同时使用微型手术刀去除小脑，并沿中线切开以分离两个大脑半球。用镊子将半球转移至另一含有新鲜冷HBSS的培养皿中。
    8. 使用微型手术刀从半球内部解剖出中脑结构，仅保留分离的皮层组织。用精细镊子剥离覆盖在皮层组织上的膜状结构——软脑膜，并将分离的皮层转移至新的含冷HBSS的培养皿中。使用微型手术刀将组织切碎，以增加下一步胰蛋白酶作用的表面积。
    9. 使用巴斯德吸管将皮层组织转移至含有4 mL预热胰蛋白酶-EDTA溶液的15 mL离心管中（每管放入8个皮层）。将皮层组织在37 °C下暴露于胰蛋白酶-EDTA中5–7分钟。
    10. 用巴斯德吸管小心吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，并向离心管中加入400 µL的0.15 mg/mL DNase I溶液。振荡或涡旋离心管，直至所有组织完全解离，液体中无任何组织碎片残留。若无法完全溶解组织，可用巴斯德吸管尖端移除剩余碎片。
    11. 将含有解离细胞悬液的离心管以200 x g离心3分钟。用巴斯德吸管小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。使用移液器向管中加入1 mL星形胶质细胞培养基（定义见步骤2.1.2），并轻轻振荡以重悬细胞，形成均匀悬液。
    12. 使用刻度吸管向T-75培养瓶中加入10 mL星形胶质细胞培养基。使用移液器将步骤2.1.11制备的1 mL细胞悬液中的250 µL加入培养瓶中，使每个培养瓶接种相当于一只幼崽脑组织的细胞量。将排出的细胞悬液均匀分布于培养基表面，并轻轻振荡培养瓶以进一步促进均匀分布。
    13. 将接种后的培养瓶置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。在培养24小时和72小时后，通过机械振荡培养瓶去除未贴壁的细胞类型，如神经元和少突胶质细胞。
    14. 随后，在每个时间点进行换液操作。将培养瓶垂直放置，使培养基位于瓶底，不覆盖贴壁细胞。用巴斯德吸管吸取培养基，将吸管尖端紧贴瓶底角落，以避免吸出细胞。将培养瓶恢复至水平位置后，使用刻度吸管轻轻加入10 mL星形胶质细胞培养基覆盖细胞。
    15. 每次换液后将培养瓶放回培养箱。当细胞达到90%融合度时，再次进行机械振荡，以去除任何残留的未贴壁细胞。
    16. 通过真空泵和巴斯德吸管移除培养基完成星形胶质细胞传代。使用刻度吸管向贴壁细胞层加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻振荡培养瓶，确保胰蛋白酶覆盖所有细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育5–7分钟。
    17. 使用刻度吸管向细胞中加入1 mL星形胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶反应。用刻度吸管将细胞悬液从培养瓶中吸出，并转移至无菌的15 mL离心管中。以200 x g离心3分钟。
    18. 用刻度吸管吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。振荡离心管以确保细胞悬液均匀。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
      注：一个达到90%融合度的培养瓶通常可获得约300万个星形胶质细胞。
    19. 向T-75培养瓶中加入10 mL星形胶质细胞培养基。使用移液器将步骤2.1.18中的细胞悬液250 µL转移至已含培养基的T-75培养瓶中，实现1:4稀释。轻轻振荡以确保细胞在整个培养瓶表面均匀分布。
    20. 每次细胞达到90%融合度时，重复步骤2.1.16–2.1.19进行细胞传代。
  2. 从大鼠胚胎中分离皮层神经元
    1. 参照步骤2.1.1和2.1.2进行类似准备，不同之处在于预热的培养基为共培养基，其成分为Neurobasal培养基 + 2% B-27补充剂（用于神经元） + 1% G-5无血清补充剂（用于星形胶质细胞） + 0.25% L-谷氨酰胺。
    2. 使用二氧化碳窒息法处死妊娠期第18天的Sprague-Dawley大鼠，并通过断头法确认死亡。
    3. 取出大鼠胚胎，在置于冷花岗岩块表面的含HBSS培养皿中，使用体视显微镜进行视觉引导，借助灭菌剪刀、微型手术刀和镊子解剖出皮层组织与其他脑组织分离53。在依次完成头部、脑组织、大脑半球及皮层的解剖后，将每份组织转移至新的含HBSS培养皿中。
    4. 将皮层组织切碎成更小的片段，以增加胰蛋白酶作用的表面积。使用巴斯德吸管将4–6个皮层组织转移至含有5 mL预热胰蛋白酶-EDTA溶液的离心管中，并在37 °C维持以解离组织。在5–7分钟时手动振荡离心管，混匀内容物并防止组织结块。
    5. 10分钟后将离心管从37 °C取出。如步骤2.1所述，吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，并替换为1.8 mL的0.15 mg/mL DNase溶液。随后涡旋组织悬液，直至溶液呈现均匀状态，液体中无任何组织碎片漂浮。
    6. 将解离后的组织悬液以200 x g离心3分钟。吸除上清液后，用2 mL共培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。
      注：通常每侧皮层半球可获得3.0–5.0 × 106个细胞。
    7. 使用上述定义的共培养基，配制细胞密度为2.0–4.0 × 105个细胞/mL的新细胞悬液。

3. 微柱内星形胶质细胞电缆的发育

  1. ECM 核心制备
    注意：必须在进行细胞接种的当天，将 ECM 添加到水凝胶微柱的内部。
    1. 在生物安全柜内，使用无菌微量离心管，用共培养基配制浓度为 1 mg/mL 的大鼠尾部 I 型胶原蛋白溶液。除使用时外，其余时间均需将装有 ECM 溶液的微量离心管置于冰上保存。
    2. 用移液器吸取 1–2 µL ECM 溶液滴加到一条石蕊试纸上，以估算其 pH 值。根据需要，用移液器加入 1 µL 1 N 氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl），分别用于提高或降低 ECM 溶液的 pH 值，并上下吹打混匀。用石蕊试纸条检测新的 pH 值，并根据需要继续添加酸或碱，直至 pH 稳定在 7.2–7.4 范围内。
    3. 将步骤 3.1.2 中的培养皿转移至解剖显微镜操作台，用无菌精细镊子将 4–5 个微柱或一个载具转移至另一个洁净无菌的 35 或 60 mm 培养皿中。在体视显微镜引导下，将移液器的 10 µL 吸头置于每个微柱的一端，抽吸以排空管腔内的 DPBS 和气泡。通过体视显微镜确认无气泡残留，以确保下一步加入的 ECM 能在管腔内自由流动。
    4. 用 ECM 溶液预润洗 P10 移液器，将 10 µL 吸头紧贴水凝胶微柱的一端，注入足够量的溶液以充满管腔（约 3–5 µL），并在体视显微镜下观察 ECM 的进入情况。在微柱的两端各保留一小段储液区（2–4 µL）。
      注意：每次操作应仅处理 4–5 个微柱或一个载具，以防止结构长时间暴露导致干燥，否则可能引起微柱结构塌陷。完全干燥的微柱会牢固粘附在培养皿表面，从而无法用于后续细胞接种。不可向微柱中添加过量共培养基（作为保湿措施），否则可能导致 ECM 在下述孵育过程中流出。
    5. 在培养皿周围以环形方式加入共培养基，形成湿度缓冲区，防止微柱在孵育期间干燥。将含有 ECM 的微柱置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时，以促进胶原蛋白聚合，之后再加入神经元和/或星形胶质细胞。
      注意：ECM 应在中空管腔内表面形成一层包被，而非完全填充内部形成实心 ECM 核心，这两种状态均可通过体视显微镜观察确认。若 ECM 形成了实心核心，应继续孵育直至仅剩内壁涂层。此涂层形成后，星形胶质细胞悬液可在后续铺板步骤中填充微柱内部。
    6. 在孵育期间，准备星形胶质细胞悬液（如下所述）。
  2. 在微柱中接种星形胶质细胞和神经元
    1. 按步骤 2.1.16–2.1.19 所述方法传代培养的星形胶质细胞（传代次数在第 4 至第 12 代之间）。计数培养瓶中的细胞数量后，用细胞培养基配制浓度为 9.0–12.0 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液。
    2. 在体视显微镜下，将 P10 移液器吸头置于微柱一端，注入足够量的细胞悬液（约 5 µL），完全充满管腔。如同之前处理 ECM 一样，在每个微柱的两端各保留少量细胞悬液作为储液区。
    3. 将接种后的微柱置于培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时，以促进星形胶质细胞在 ECM 上的贴附。若不向微柱中添加神经元，则直接进入步骤 3.2.5。
    4. 初始孵育结束后，用移液器在体视显微镜观察下，向微柱两端各加入 1–2 µL 步骤 2.2.7 所得的皮层神经元悬液。确保培养皿中有足够的培养基以避免干燥，并再次于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 40 分钟，以促进神经元黏附。
      注意：皮层神经元悬液也可在束状结构形成后 1–2 天添加，操作时先用移液器小心吸除培养皿中的培养基，再执行步骤 3.2.4。
    5. 孵育结束后，小心地向含有接种微柱的培养皿中加入 3 或 6 mL 共培养基（分别对应 35 或 60 mm 培养皿）。将接种微柱继续在 37 °C、5% CO2 条件下培养，以促进星形胶质细胞有序自组装形成束状、电缆样结构，该结构通常在 6–10 小时内形成。
  3. 星形胶质细胞电缆结构的稳定化
    注意：在束状结构形成后，即构建体培养约 6–12 小时后，执行以下步骤，以防止星形胶质细胞支架的有序结构塌陷。
    1. 在无菌微量离心管中，用共培养基配制浓度为 3 mg/mL 的大鼠尾部 I 型胶原蛋白溶液。参照步骤 3.1.2 所述方法调节溶液 pH 至 7.2–7.4。未使用时，胶原原液和共培养基应始终置于冰上，配制好的胶原溶液也需全程保持在冰上。
    2. 用移液器吸除含有星形胶质细胞支架的培养皿中的培养基，仅在皿壁边缘保留少量培养基，以形成湿度缓冲区，确保微柱保持水合状态。将培养皿置于体视显微镜下以便观察。
    3. 用移液器吸取 2–3 µL 胶原溶液，在体视显微镜引导下分别加入微柱的两端。确保培养皿边缘周围有足够培养基作为湿度缓冲区。将含有微柱的培养皿置于湿润培养箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，以促进新添加胶原的凝胶化。
    4. 用移液器缓慢向培养皿中加入 3 或 6 mL 共培养基（分别对应 35 或 60 mm 培养皿），并将培养皿继续置于 37 oC、5% CO2 的湿润培养箱中进行培养。

4. 从水凝胶内部提取星形胶质细胞束

  1. 在高压灭菌器中对玻璃盖玻片进行灭菌。用无菌细胞培养级水配制 20 µg/mL 的多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液。
  2. 在生物安全柜内，用无菌镊子将灭菌后的玻璃盖玻片转移至无菌的 10 cm 培养皿中，并加入足量的 PLL 溶液以完全覆盖盖玻片。
  3. 将覆盖有 PLL 溶液的盖玻片于 37 °C 孵育 30 分钟，以完成表面包被。孵育 30 分钟后，用巴斯德吸管吸除 PLL 溶液。随后加入细胞培养级水，再用巴斯德吸管吸除，重复此清洗步骤三次。
  4. 在形成定向排列的胶质细胞束后，用无菌精细镊子小心地将微柱转移至无菌培养皿中，并用微量移液器加入 10 µL 共培养培养基，形成小液滴，以防止脱水并维持细胞束的活性。在体视显微镜下进行视觉引导，用无菌外科镊子从一端轻轻拉出，将星形胶质细胞束从水凝胶微柱中提取出来。
  5. 用镊子夹持星形胶质细胞束，将其放置在 PLL 包被的盖玻片上。随后按照以下方案进行固定和染色。

5. 免疫细胞化学检测用于 体外 研究

注意：本研究中使用的一抗包括兔抗胶质酸性纤维蛋白（GFAP）（1:500）、小鼠抗β-微管蛋白III（1:500）、兔抗胶原蛋白I（1:500）、小鼠抗巢蛋白（nestin）（1:200）以及兔抗波形蛋白（vimentin）（1:100）。二抗包括驴抗小鼠568、驴抗兔568、驴抗兔488和驴抗小鼠568（所有稀释比例均为1:500）。所有操作中，需加入足量的每种溶液以完全覆盖微柱结构。

  1. 在化学通风橱内，用1×DPBS配制4%体积/体积（v/v）的甲醛溶液。
    注意：甲醛是一种已知具有致癌性的有毒化合物，必须单独收集并妥善处理。操作时务必在化学通风橱内进行，并穿戴个人防护装备（PPE），如实验服、护目镜和手套。
  2. 对于微柱样品，使用巴斯德吸管将含有构建物的培养皿中的培养基弃去，注意避免吸入水凝胶圆柱体。加入足量甲醛溶液以完全覆盖仍置于培养皿中的微柱或载玻片，于18–24 °C孵育35分钟。
  3. 用血清移液管吸除固定后的微柱或载玻片上的4.0%甲醛溶液。用PBS快速冲洗固定样品三次：前两次为快速加液并吸除，第三次则浸泡10分钟。
  4. 将正常马血清（NHS）溶于PBS中，配制成4% v/v的溶液。以该NHS溶液为溶剂，加入非离子型去垢剂，配制成浓度为0.3% v/v的溶液。
  5. 用移液管吸除含有微柱或载玻片的培养皿中的PBS。加入足量0.3%去垢剂溶液，完全覆盖微柱或载玻片，在18–24 °C孵育60分钟，以通透细胞膜。
  6. 吸除去垢剂溶液，先用PBS快速冲洗两次，再浸泡冲洗三次，每次5分钟。根据所需抗体浓度，计算所需4% NHS溶液的体积以及每种一抗的用量。
  7. 吸除培养皿中的PBS，加入足量的一抗溶液（用4% NHS-DPBS稀释），完全覆盖微柱或提取的星形胶质细胞束。于4 °C孵育过夜（12–16小时）。
  8. 吸除一抗溶液，用PBS快速冲洗两次，再分别浸泡5分钟冲洗三次。在避光条件下，用4.0% NHS溶液将二抗稀释至1:500，配制二抗工作液。
  9. 将细胞与二抗溶液在18–24 °C孵育2小时。整个孵育过程中，需用铝箔包裹含有微柱的培养皿，避免光照。
  10. 吸除二抗溶液，加入Hoechst染色液（1:10,000），于18–24 °C孵育10分钟，用于细胞核染色。
    注意：Hoechst是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理。因此，必须单独收集废弃物，且操作时始终穿戴个人防护装备。
  11. 用PBS冲洗五次，每次5–10分钟。随后将染色后的微柱置于PBS中，于4 °C保存，并用铝箔包裹避光。对于已固定的星形胶质细胞束样品，滴加一滴水性封片剂至样本上，覆盖另一块盖玻片，用指甲油密封两片盖玻片边缘，以便长期保存和后续成像分析。

6. 使用活死细胞（钙黄绿素-AM/溴化乙锭同二聚体）染色法进行细胞活力检测

  1. 在10 mL的1×DPBS中加入5 μl钙黄绿素AM（4 mM，溶于无水二甲基亚砜（DMSO））和20 μl碘化乙啶同型二聚体-1（EthD-1）（2 mM，溶于DMSO/H2O，体积比1:4），配制试剂溶液。用铝箔包裹溶液或避光保存，以防光照。
  2. 用巴斯德吸管吸除含有接种微柱的培养皿中的培养基，加入足量上述配制的溶液以完全覆盖微结构。于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，孵育期间保持培养皿避光。
  3. 用微量移液器或巴斯德吸管移除溶液。按照步骤5.3所述方法用DPBS冲洗2–3次。根据培养皿大小加入足量DPBS浸没样品。随后立即使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行细胞成像。
    注意：具有代谢活性的活细胞可将膜通透性的钙黄绿素AM转化为钙黄绿素，产生绿色荧光。死亡细胞的细胞膜完整性受损，允许EthD-1进入细胞并与核酸结合，产生红色荧光。

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结果

最初，采用相差显微镜观察星形胶质细胞黏附、束状结构形成及其细胞架构整体稳定性随时间的变化情况。接种1小时后，可见星形胶质细胞分布于微柱腔内，呈球形形态。图 2A）。在5小时时，星形胶质细胞开始伸出突起并发生收缩，到8小时时，细胞呈现出完整的具有突起的形态，并沿微柱的长轴方向形成类似电缆的结构。图 2A）。值得注意的是，与细胞最初在微柱间分散分布的状态相比，星形胶质细胞似乎收缩并沿内部形成致密束状网络 (图2B）。初始细胞排列完成后，星形胶质细胞网络常沿纵轴方向相互牵拉，形似拉链闭合，于微柱中心形成致密的束状结构。图 2C）。这种束状结构的形成源于自组装过程，部分由微柱内径（ID）和细胞密度的选择所决定。当星形胶质细胞接种于内径小于 350 µm (图3B

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讨论

与周围神经系统（PNS）较为支持性的环境相比，中枢神经系统（CNS）在应对神经损伤和神经退行性病变的有害后果方面能力尤为有限。在哺乳动物中枢神经系统遭受严重损伤后，会形成胶质瘢痕，其核心由纤维化细胞和炎性细胞构成，外围则被一层致密无序的反应性星形胶质细胞网络所包围，这些星形胶质细胞分泌抑制轴突再生的蛋白聚糖。14该瘢痕对轴突末端的再生起到物理和生化层面的阻碍作用12此外，成年哺乳动物中枢神经系统在创伤或神经退行性病变导致细胞丢失后，可用于补充新神经元的来源十分有限，因为具有神经发生能力的区域仅局限于侧脑室下区（SVZ）、海马齿状回，以及可能存在的其他通常处于非活跃状态的区域。54一种理想策略应能规避中枢神经系统（CNS）有限再生能力的两个方面，而现有方法尚无法解决这一问题。为此，本研究团队开发了基于星形胶质细胞的支架结构，旨在为神经元向神经元缺失区域迁移以及再生轴突生长锥的定向延伸提供活体通路。这些星形胶质细胞活体支架由包裹在琼脂糖微柱内部的胶原基质中排列整齐的星形胶质细胞束构成。与传统用于中枢...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

财务支持由美国国立卫生研究院提供［U01-NS094340（Cullen） & F31-NS090746（Katiyar）]，迈克尔·J·福克斯基金会[治疗管线项目#9998（Cullen）]，宾夕法尼亚大学医学院神经科学中心试点奖（Cullen），美国国家科学基金会[研究生研究奖学金DGE-1321851（Struzyna）]，美国退伍军人事务部[RR&D 优秀奖评审 #B1097-I（Cullen），以及美国陆军医学研究与物资司令部 [#W81XWH-13-207004（Cullen）] & W81XWH-15-1-0466（Cullen）]

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
针灸针（300 µm 直径）Lhasa MedicalHS.30x40可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿Fisher08772B
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Invitrogen14200075
聚苯乙烯一次性血清移液管Fisher13-678-11D
琼脂糖SigmaA9539-50G
微升玻璃毛细管（701 µm）Fisher21-170J可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
微毛细管吸头吹气球Fisher21-170J吹气球随微毛细管配套提供。
加热板FisherSP88857200
磁力搅拌子Fisher1451352
微量移液器SigmaZ683884-1EA
25 mm 规格针头Fisher14-826-49
微型手术刀Roboz SurgicalRS-6270
剪刀Fine Science Tools14081-09
镊子World Precision Instruments501985
热珠灭菌器SigmaZ378550-1EA
体视显微镜NikonSMZ800N
微型刮勺FisherS50821
大鼠尾型 I 型胶原蛋白Corning354236保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
微量离心管Fisher02-681-256
氢氧化钠（NaOH）FisherSS2661
盐酸（HCl）FisherSA48-1
石蕊试纸Fisher09-876-18
汉克平衡盐溶液（HBSS）Invitrogen14170112储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25200056储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）ISigma10104159001储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
含 Ham's F-12 营养混合物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11330-032储存于 4 ºC。
胎牛血清（FBS）Atlanta BiologicalsS11195储存于 -20ºC。
出生后第 0 天或第 1 天的 Sprague Dawley 大鼠幼崽Charles RiverStrain 001
Neurobasal 胚胎神经元基础培养基Invitrogen21103049储存于 4ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 无血清添加剂Invitrogen12587010储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺Invitrogen35050061储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
G5 星形胶质细胞添加剂Invitrogen17503012
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠Charles RiverStrain 001
巴斯德移液管Fisher22-042816
15 mL 离心管EMESCO1194-352099
涡旋振荡器Fisher02-215-414
离心机Fisher05-413-115
血细胞计数板Fisher02-671-6
培养箱Fisher13 998 076
40% 甲醛FisherF77P-4甲醛是一种已知的致癌性有毒化合物，必须单独容器收集处理。
玻璃盖玻片Fisher12-548-5M
指甲油Electron Microscopy Sciences (EMS)72180
Fluoromont 封片介质Southern Biotech0100-01
聚-L-赖氨酸SigmaP4707
磷酸盐缓冲液FisherBP3994
吐温 X-100SigmaT8787
正常马血清Gibco16050-122
兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一抗MilliporeAB5804储存于 -20ºC。
鼠抗 β-微管蛋白 III 一抗SigmaT8578储存于 -20ºC。
兔抗 I 型胶原蛋白一抗Abcamab34710储存于 -20ºC。
兔抗波形蛋白MilliporeAB3400储存于 -20ºC。
鼠抗巢蛋白MilliporeAB5326储存于 -20ºC。
驴抗鼠 568 二抗InvitrogenA10037储存于 4ºC。
驴抗兔 568 二抗InvitrogenA10042储存于 4ºC。
驴抗兔 488 二抗InvitrogenA21206储存于 4ºC。
Hoechst 33342 三盐酸盐InvitrogenH3570储存于 4ºC。Hoechst 是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理，因此必须单独容器收集处理。
钙黄绿素 AMSigmaC1359溶于无水 DMSO，浓度为 4 mM
碘化乙啶同聚物-1Life TechnologiesE1169溶于 DMSO/H2O（1:4, v/v），浓度为 2 mM
二甲基亚砜（DMSO）Sigma276855
A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜Nikon用于获取免疫标记结构的共聚焦重建图像。
Eclipse Ti-S 显微镜Nikon用于获取相差图像。配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01 版）进行数字图像采集。

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