三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

摘要

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。

摘要

神经创伤和神经退行性疾病常常导致持久的神经功能缺损，这是由于中枢神经系统（CNS）在替代丢失的神经元和再生轴突通路方面能力有限。然而，在神经系统发育过程中，神经元迁移和轴突延伸通常沿着由其他细胞形成的通路进行，这些通路被称为 "活体支架"旨在模拟这些机制并设计一种可规避中枢神经系统抑制性环境的策略，本文提供了一种用于构建组织工程星形胶质细胞支架的实验方案 "活体支架"采用一种新型生物材料包封方案构建这些结构，以诱导星形胶质细胞自组装形成致密的三维双极结构，其胞体与突起呈纵向排列。首先组装中空水凝胶微柱，并在其内腔表面包被胶原细胞外基质。随后将解离的大脑皮层星形胶质细胞导入圆柱形微柱的内腔，在特定内径条件下 <350 µm，自发地自我对齐并收缩，形成由致密的星形胶质细胞突起和胶原原纤维束组成的长纤维状电缆结构，其直径为 <直径150 µm但长度可达数厘米。这些人工构建的活体支架表现出 >97% 的细胞存活率，并几乎完全由表达中间丝蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（vimentin）和巢蛋白（nestin）的星形胶质细胞组成。这些定向排列的星形胶质细胞网络可为神经元黏附及定向神经突延伸提供有利的基质。此外，这些结构在从水凝胶包埋中取出后仍能保持完整性和定向排列，适用于中枢神经系统植入。这些预先构建的结构在形态上模拟了天然胶质细胞介导的细胞架构中的关键要素 "活体支架" 体内因此，这些人工构建的活体支架可作为研究神经发育机制的实验平台 体外 或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进中枢神经系统退变后的神经再生 体内.

引言

中枢神经系统（CNS）在对抗神经元丢失和/或轴突通路功能障碍方面的能力有限，这些情况常见于创伤性脑损伤（TBI）、脑卒中、脊髓损伤（SCI）以及神经退行性疾病^1,2,3,4,5。CNS中的神经发生仅局限于脑部少数特定区域，这限制了丢失神经元的再生^6,7。此外，由于缺乏定向引导、存在轴突发育抑制因子以及神经组织损伤后出现的反应性星形胶质细胞增生，CNS中丢失的轴突通路再生能力不足^2,8,9,10。星形胶质细胞通常在维持离子稳态、神经递质清除、突触形成以及神经血管耦合等方面发挥多种支持神经元的功能¹¹。然而，即使神经组织受到轻微损伤，星形胶质细胞也可能发生分子、结构和功能上的改变，并转变为肥大状态....

方案

所有实验程序均经宾夕法尼亚大学和迈克尔·J·克雷斯琴兹退伍军人事务医疗中心的机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物人道照护与使用公共卫生服务政策》（2015年）中规定的要求。

1. 琼脂糖水凝胶微柱的制备

1. 通过称取3 g琼脂糖并转移至含有100 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌烧杯中，配制3%质量/体积（w/v）的琼脂糖溶液。向烧杯中加入一个无菌磁力搅拌子，并将其置于加热板/搅拌器表面。在下一步操作中保持烧杯覆盖，以防止内容物蒸发。
2. 在100 °C温度下加热琼脂糖和DPBS，并以60–120 rpm速度搅拌。根据需要调整设置，并持续监测溶解过程的进展，溶液最初由浑浊逐渐变为透明，表明琼脂糖已完全溶解。
   注意：烧杯及溶液温度很高！
3. 在加热并搅拌琼脂糖溶液的同时，取出四个空的10 cm培养皿，并向其中两个加入20 mL DPBS。将针灸针（直径：300 µm，长度：40 mm）、玻璃微量毛细管（直径：701.04 µm，长度：65 mm，容量：25.0 µL）和球形移液器放入生物安全柜中。当液态琼脂糖溶液变得澄清后，保持约50 °C的恒温加热并持续搅拌，以防止琼脂糖发生凝胶化。
4. 将一根针灸针插入球形移液器底部开口。将毛细管套在暴露于外侧的针头上。通过将毛细管的一部分插入球形移液器筒体的橡胶部分，固定毛细管。
5. 使用移液器将1....

结果

最初，采用相差显微镜观察星形胶质细胞黏附、束状结构形成及其细胞架构整体稳定性随时间的变化情况。接种1小时后，可见星形胶质细胞分布于微柱腔内，呈球形形态。图 2A）。在5小时时，星形胶质细胞开始伸出突起并发生收缩，到8小时时，细胞呈现出完整的具有突起的形态，并沿微柱的长轴方向形成类似电缆的结构。图 2A）。值得注意的是，与细胞最初在微柱间分散分布的状态相比，星形胶质细胞似乎收缩并沿内部形成致密束状网络 (图2B）。初始细胞排列完成后，星形胶质细胞网络常沿纵轴方向相互牵拉，形似拉链闭合，于微柱中心形成致密的束状结构。图 2C）。这种束状结构的形成源于自组装过程，部分由微柱内径（ID）和细胞密度的选择所决定。当星形胶质细胞接种于内径小于 350 µm (图3B

讨论

与周围神经系统（PNS）较为支持性的环境相比，中枢神经系统（CNS）在应对神经损伤和神经退行性病变的有害后果方面能力尤为有限。在哺乳动物中枢神经系统遭受严重损伤后，会形成胶质瘢痕，其核心由纤维化细胞和炎性细胞构成，外围则被一层致密无序的反应性星形胶质细胞网络所包围，这些星形胶质细胞分泌抑制轴突再生的蛋白聚糖。¹⁴该瘢痕对轴突末端的再生起到物理和生化层面的阻碍作用¹²此外，成年哺乳动物中枢神经系统在创伤或神经退行性病变导致细胞丢失后，可用于补充新神经元的来源十分有限，因为具有神经发生能力的区域仅局限于侧脑室下区（SVZ）、海马齿状回，以及可能存在的其他通常处于非活跃状态的区域。⁵⁴一种理想策略应能规避中枢神经系统（CNS）有限再生能力的两个方面，而现有方法尚无法解决这一问题。为此，本研究团队开发了基于星形胶质细胞的支架结构，旨在为神经元向神经元缺失区域迁移以及再生轴突生长锥的定向延伸提供活体通路。这些星形胶质细胞活体支架由包裹在琼脂糖微柱内部的胶原基质中排列整齐的星形胶质细胞束构成。与传统用于中枢.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针灸针（300 µm 直径）	Lhasa Medical	HS.30x40	可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿	Fisher	08772B
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14200075
聚苯乙烯一次性血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
微升玻璃毛细管（701 µm）	Fisher	21-170J	可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
微毛细管吸头吹气球	Fisher	21-170J	吹气球随微毛细管配套提供。
加热板	Fisher	SP88857200
磁力搅拌子	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 mm 规格针头	Fisher	14-826-49
微型手术刀	Roboz Surgical	RS-6270
剪刀	Fine Science Tools	14081-09
镊子	World Precision Instruments	501985
热珠灭菌器	Sigma	Z378550-1EA
体视显微镜	Nikon	SMZ800N
微型刮勺	Fisher	S50821
大鼠尾型 I 型胶原蛋白	Corning	354236	保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸（HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen	14170112	储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma	10104159001	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
含 Ham's F-12 营养混合物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11330-032	储存于 4 ºC。
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11195	储存于 -20ºC。
出生后第 0 天或第 1 天的 Sprague Dawley 大鼠幼崽	Charles River	Strain 001
Neurobasal 胚胎神经元基础培养基	Invitrogen	21103049	储存于 4ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 无血清添加剂	Invitrogen	12587010	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
G5 星形胶质细胞添加剂	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	Strain 001
巴斯德移液管	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋振荡器	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
培养箱	Fisher	13 998 076
40% 甲醛	Fisher	F77P-4	甲醛是一种已知的致癌性有毒化合物，必须单独容器收集处理。
玻璃盖玻片	Fisher	12-548-5M
指甲油	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont 封片介质	Southern Biotech	0100-01
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
磷酸盐缓冲液	Fisher	BP3994
吐温 X-100	Sigma	T8787
正常马血清	Gibco	16050-122
兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一抗	Millipore	AB5804	储存于 -20ºC。
鼠抗 β-微管蛋白 III 一抗	Sigma	T8578	储存于 -20ºC。
兔抗 I 型胶原蛋白一抗	Abcam	ab34710	储存于 -20ºC。
兔抗波形蛋白	Millipore	AB3400	储存于 -20ºC。
鼠抗巢蛋白	Millipore	AB5326	储存于 -20ºC。
驴抗鼠 568 二抗	Invitrogen	A10037	储存于 4ºC。
驴抗兔 568 二抗	Invitrogen	A10042	储存于 4ºC。
驴抗兔 488 二抗	Invitrogen	A21206	储存于 4ºC。
Hoechst 33342 三盐酸盐	Invitrogen	H3570	储存于 4ºC。Hoechst 是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理，因此必须单独容器收集处理。
钙黄绿素 AM	Sigma	C1359	溶于无水 DMSO，浓度为 4 mM
碘化乙啶同聚物-1	Life Technologies	E1169	溶于 DMSO/H2O（1:4, v/v），浓度为 2 mM
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	276855
A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜	Nikon		用于获取免疫标记结构的共聚焦重建图像。
Eclipse Ti-S 显微镜	Nikon		用于获取相差图像。配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01 版）进行数字图像采集。