使用真空采血系统对未麻醉大鼠尾静脉进行重复采血

摘要

本文介绍一种使用真空采血管系统在未麻醉大鼠中进行尾静脉采血的简便方法。该方法可降低直接接触血液的风险，并简化单次穿刺后多次采样的操作。

摘要

可以从大鼠的多个采样部位采集血液。例如，尾静脉是进行血液采样的理想部位。然而，尾静脉较细，有时难以穿刺。此外，尾静脉血流较慢，需要较长的采样时间才能获得足够的血量。本报告介绍了一种简单的血液采集方法——真空采血法，该方法通常用于从患者身上获取血样，此处应用于未麻醉的大鼠。将22 G蝶形针头以约20°的角度插入距尾尖约2-3 cm处的一侧尾静脉，然后将蝶形针的橡胶端插入真空采血管中，从而收集血液。实验结果表明，实验组的成功率为95%，初学者组的成功率为90%。两组在成功率和穿刺次数方面相似，但实验组的采样时间显著短于初学者组。综上所述，这种从非麻醉大鼠尾静脉进行连续血液采集的真空采血法是可行且易于掌握的，可能成为大鼠常规血液采样技术的一种可靠替代方法。

引言

在多种实验研究中，需要从大鼠采集血液样本。大鼠采血技术包括心脏穿刺、眶后静脉丛穿刺、颈静脉穿刺、隐静脉穿刺、尾部血管穿刺、颈动脉穿刺、腹主动脉穿刺以及下腔静脉穿刺。大多数技术（除隐静脉和尾部血管穿刺外）均需使用麻醉^1,2。大鼠尾部静脉常用于采血和血管注射。将尾部用温水处理后，血管会充分扩张，便于操作，即使在大鼠处于麻醉状态下也是如此³。

尽管已开发出多种获取小型实验动物血样的新方法并不断改进²，但在对小型动物采样时并不总能轻松获得足够的血液。大鼠尾静脉是进行采血的较理想部位⁴。然而，尾静脉较细，穿刺难度较大，且由于血流速度较慢，采集足量血液往往耗时较长。在临床常规操作中，通常采用真空采血管系统进行血液采集。这种封闭式采血系统可降低直接接触血液的风险，并能通过单次静脉穿刺方便地采集多份血样⁵。本报告介绍一种在未麻醉大鼠中使用真空采血管系统进行尾静脉采血的简便方法。该方法易于掌握，可用于大鼠多次重复采集较大量血液。

方案

所有实验程序均经华中科技大学同济医学院动物护理委员会（中国武汉）批准。手稿的撰写遵循ARRIVE（动物研究：In Vivo 实验报告）指南⁶。

1. 动物饲养

1. 使用华中科技大学实验动物中心提供的Sprague-Dawley（SD）大鼠（n = 20，10只雄性，8周龄，体重261至291 g，平均体重 = 272.85 ± 9.07 g），并依照美国国立卫生研究院（NIH）出版的《实验动物护理与使用指南》（NIH出版号85-23，1996年修订版）进行饲养管理。
2. 在标准条件下饲养，自由摄食和饮水。将大鼠饲养于530 cm²的笼具中，垫料为木屑，每笼饲养两只。所有笼具均开放于室内环境（无微隔离或通风笼具）。
3. 确保参与实验操作的工作人员定期对大鼠进行抓取和处理。
4. 维持室温在21 °C至23 °C之间。在整个研究期间给予正常盐饮食（0.3% NaCl）。

2. 血液采集步骤

注意：真空采血系统由双端针头［22 G（0.7 mm × 25 mm）］、塑料持针器以及一系列带橡胶塞的真空采血管（2 mL）组成（图1）。

1. 将大鼠放入塑料固定装置中，用温水（20–30 °C）清洗尾部，以去除任何可见的污垢或粪便。在助手将尾巴拉直固定的同时，用70%乙醇擦拭尾部，并用纱布清洁，使静脉清晰可见。
2. 将22 G蝶形针头尖端以约20°角插入尾部一侧的侧尾静脉（深度约5 mm），穿刺位置距离尾尖约2–3 cm（图2）。通过将蝶形针的橡胶端插入真空采血管中，将血液收集至真空采血管内（图3）。
   注意：最大采血量为1.2 mL⁷。
3. 采血完成后，拔出针头，并用纱布轻轻按压穿刺部位15–30秒，以止血。随后将大鼠从塑料固定装置中释放，并放回笼中。
4. 使用含有EDTA作为抗凝剂的采血管收集血浆。轻柔颠倒混匀数次，使抗凝剂与血液充分混合，并将样本垂直置于冰上。
5. 将采血后的样本管在冷藏离心机中以2,000 × g离心10分钟，以分离血浆或血清。
6. 吸取血浆或血清时，注意不要扰动红细胞和白细胞层。若需收集血清，应使用不含抗凝剂的采血管。两种样本均可立即使用，或在-80 °C保存长达一年。
   注意：成功采血定义为每次采集到1.2 mL血液。最大穿刺次数设定为三次；若第三次穿刺后总采血量仍低于1.2 mL，则定义为采血失败。采样持续时间从尾静脉穿刺开始，至采血完成后拔出蝶形针为止。
7. 在两周内进行两次采血⁷。
   1. 为测试并验证该方法的可行性，在实施本采血方案前，对两名医学生（初学者）进行2小时培训。使用20只大鼠，其中10只由2名经验丰富的研究人员（实验组）采血，另10只由2名医学生（初学者组）采血。

3. 统计分析

1. 以均值 ± 标准差表示数据，并使用 SPSS Statistics 17 进行分析。设定 α 值为 0.05，因此 p <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

两组动物的采样持续时间、体质量和采血量
每组中的10只大鼠（5只雄性）在两周内各采血两次。两组的平均体质量相似（272.00 ±9.66 g 和 273.70 ±8.87 g）。实验组的采样时间显著短于初学者组（2.77 ±0.53 min 对比 3.28 ±0.83 min，p <0.05）（表1）。

两组的成功率与穿刺次数
实验组的成功率为95%（19/20），初学者组为90%（18/20）（p >0.05）。两组之间的穿刺次数无显著差异（1.50 ±0.61 min 与 1.85 ±0.75 min 相比，p >0.05）（表2）。这些结果表明，该方法易于学习，经过2小时培训后即可掌握该技术。

图1： 2 mL 真空血液采集管（左）；22 G 蝶形针（中）；塑料固定装置（右）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2： 将针尖以约20°的角度插入距尾尖约2-3 cm处的尾侧静脉（插入深度约5 mm）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 成功的静脉穿刺。请点击此处查看此图的放大版本。

实验组						初学者组
	性别	体重 (g)	采集血液体积 (mL)	采样持续时间 (min)			性别	体重 (g)	采集血液体积 (mL)	采样持续时间 (min)
E1-1	male	291	1.2	3.12		B1-1	male	282	1.2	3.18
E1-2	male	291	1.2	2.73		B1-2	male	282	1.2	2.18
E2-1	male	276	1.2	2.3		B2-1	male	264	1.2	3.73
E2-2	male	276	1.2	2.37		B2-2	male	264	1.2	2.47
E3-1	male	267	1.2	2.73		B3-1	male	265	1.2	3.52
E3-2	male	267	1.0	3.88		B3-2	male	265	1.2	2.53
E4-1	male	263	1.2	2.41		B4-1	male	289	1.2	2.32
E4-2	male	263	1.2	2.52		B4-2	male	289	1.2	3.62
E5-1	male	265	1.2	3.61		B5-1	male	277	1.2	3.48
E5-2	male	265	1.2	2.42		B5-2	male	277	1.2	3.12
E6-1	female	285	1.2	3.33		B6-1	female	274	0.9	4.87
E6-2	female	285	1.2	3.03		B6-2	female	274	1.2	3.37
E7-1	female	271	1.2	2.82		B7-1	female	268	1.0	3.93
E7-2	female	271	1.2	2.42		B7-2	female	268	1.2	3.82
E8-1	female	268	1.2	1.93		B8-1	female	262	1.2	2.07
E8-2	female	268	1.2	3.05		B8-2	female	262	1.2	3.67
E9-1	female	273	1.2	2.52		B9-1	female	281	1.2	4.38
E9-2	female	273	1.2	3.17		B9-2	female	281	1.2	4.57
E10-1	female	261	1.2	1.82		B10-1	female	275	1.2	2.53
E10-2	female	261	1.2	3.25		B10-2	female	275	1.2	2.28
平均值				2.77						3.28
En-1：实验组大鼠第一次采血的编号。
En-2：实验组大鼠第二次采血的编号。
Bn-1：初学者组大鼠第一次采血的编号。
Bn-2：初学者组大鼠第二次采血的编号。

表1：实验组与初学者组采集血液的结果。

	采血时间	平均穿刺次数	一次穿刺成功	两次穿刺成功	三次穿刺成功	失败	成功率
实验组	20	1.50 ±0.61	11	8	0	1	95%
初学者组	20	1.85 ±0.75	7	9	2	2	90%
一次穿刺成功：首次穿刺后成功采血的大鼠数量
两次穿刺成功：第二次穿刺后成功采血的大鼠数量
三次穿刺成功：第三次穿刺后成功采血的大鼠数量
失败：三次穿刺后仍采血失败的大鼠数量

表2：实验组与初学者组穿刺次数及成功率的比较。

讨论

本报告介绍了一种易于掌握的大鼠采血方法。我们的结果表明，该方法适用于反复从大鼠采集较大量血液。此外，该方法学习周期短，易于掌握。该操作可在未麻醉的大鼠上进行，仅对动物造成最小程度的应激。

可从大鼠的多个部位采集血液。尾静脉是进行采血的较优部位⁴。然而，由于大鼠尾静脉较细且血流速度较低，往往难以获得足够的采血量。在日常临床实践中，通常使用真空采血系统从患者体内采集血样。该真空采血系统已长期应用于患者及实验动物的采血过程^8,9,10。该系统由内壁涂有硅酮的真空采血管和蝶形针头组成，基于真空负压原理，可实现连续采血，避免血液滞留，同时降低污染和溶血的风险¹¹。导管内残留的血量约为0.3 mL。当针头从尾静脉拔出后，导管中阻塞的血液会因真空作用流入采血管中。该方法也可用于体重低于100 g的大鼠，只需使用更细的穿刺针即可。

这种采血方法具有多个优点。该操作仅对大鼠造成轻微损伤，且无需使用麻醉剂即可完成采血，从而避免了应激反应和麻醉剂对血液样本的影响。我们的观察显示，大鼠在塑料固定装置中在整个操作过程中保持安静，实验期间无动物死亡。其次，该方法允许每隔一天或每天重复采血，能够频繁获取足量血液，满足多种研究需求。最后，该方法易于学习，初学者经过短暂（2小时）的学习即可熟练掌握，本报告中初学者组与实验组在操作成功率和穿刺时间上相似的结果也证实了这一点。在先前的一项研究中，Lee et al. 报道了从大鼠尾侧静脉采血的类似方法⁴。与Lee et al.⁴ 报道的方法相比，我们的方法更为简便：我们直接将穿刺针插入尾静脉，采血管的另一端直接连接真空采血管收集血液，无需额外使用注射器手动抽吸，也无需通过“挤奶”方式挤压静脉以促进血液流出。采用这种封闭系统采血可降低血液污染的风险。使用塑料固定装置还可减少大鼠的应激反应，并有助于尾部的固定。

以下两个步骤对于该方法的成功应用至关重要：1）拉直尾部并避免尾部移动；2）以20°角轻轻刺入静脉，避免刺穿静脉，并保持穿刺针位于静脉内。

综上所述，采用的大鼠真空采血方法安全、可行且易于操作。该方法能够在未麻醉的大鼠中频繁采集血液，并获得足够的血量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双头针	上海康农医疗器械有限公司，中国	22G	(0.7×25mm)
真空采血管	武汉智源医学科技有限公司，中国	2 ml
大鼠固定器	上海康农医疗器械有限公司，中国	250g大鼠固定器型号
大鼠正常盐饮食			大鼠在整个研究期间接受正常盐饮食（0.3% NaCl）
用于统计分析的SPSS软件	SPSS Inc,  Chicago; USA	版本 17.0.